沉默Htr3a的Htr3a-shRNA基因序列、质粒、病毒及在AD治疗中的应用

沉默htr3a的htr3a-shrna基因序列、质粒、病毒及在ad治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因治疗技术领域，尤其是涉及一种沉默htr3a蛋白表达的htr3a-shrna基因序列、质粒、病毒及其在ad基因治疗中的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)起病隐匿，是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性疾病。《2015年世界阿尔茨海默报告》指出，全球约有4680万阿尔茨海默病患者，平均每3秒钟就有1例新发患者，预计2050年全球患者将突破1亿3150万人。阿尔茨海默病在65岁以上的年龄段的人群中患病率为5％；超过85岁患病率25％，95岁以上的老人则高达60％。而人口老龄化使全球ad患者数量显著增加，因此ad患者给家庭和社会带来巨大的精神负担和经济负担。aβ淀粉样蛋白沉积是ad大脑的两个标志性特征之一，也是疗法开发的重要靶点。目前，临床使用的药物乙酰胆碱脂酶抑制剂和谷氨酸nmda受体抑制剂。迄今为止，阿尔茨海默病患者没有特异性的有效药物阻止疾病的发展。因此，研发针对ad的病理过程、减少aβ斑的产生，延缓、阻止ad病变的发展，有极大的应用前景和社会价值。
3.htr3受体是5-羟色胺的第3型受体，是配体门控的离子通道型受体。目前发现htr3有5种亚单位：htr3a、htr3b、htr3c、htr3d、htr3e。htr3a是1991年第一个被克隆的亚单位，478-490个氨基酸，在不同种属间具有高度的保守性。人的htr3a基因由9个外显子和8个内含子构成，位于11号染色体，mrna经过可变剪接产生两个异构体。htr3a是功能性htr3亚单位，可以形成功能性同源htr3受体。htr3b基因存在于人和啮齿类动物；但啮齿类动物(大、小鼠)海马htr3b是否存在一直有争议，并且htr3b自身不能形成功能性htr3受体，必需与htr3a结合才能形成功能性htr3受体。2003年发现人的htr3c、htr3d、htr3e基因，位于3号染色体；而在啮齿类至今尚未发现类似的基因。htr3c、htr3d、htr3d亚单位自身都不能形成功能性htr3受体，必需与htr3a结合形成才能形成功能性htr3受体。rt-pcr分析显示htr3c、htr3d、htr3e mrna主要表达于人胃肠道和背根神经节。因此，无论啮齿类大脑还是人脑，htr3受体的功能主要由htr3a决定，htr3受体由htr3a形成的同源五聚体或htr3a与htr3b形成的异源五聚体(图21)，并且htr3a在不同种属间具有高度保守性。
4.在哺乳类动物皮质和海马，htr3a表达于γ-氨基丁酸能中间神经元，来源于胚胎时期神经嵴细胞的迁移。至今，没有文献报道htr3a基因与阿尔茨海默病相关。


技术实现要素：

5.针对以上问题，本发明的目的是提供一种沉默htr3a蛋白表达的htr3a-shrna基因、质粒、病毒及其在ad基因治疗中的潜在应用。
6.本发明发现阿尔茨海默病(alzheimer's disease，ad)转基因动物app/ps1(tgad)小鼠和ad病人的htr3a蛋白表达比正常对照组显著增加。更重要的是本发明首次观察到
tgad小鼠htr3a强阳性的γ-氨基丁酸能中间神经元是生成aβ的神经元之一。htr3a是形成功能性htr3受体所必需，且自身能形成功能性htr3受体。针对htr3a基因序列，设计了沉默htr3a的三个htr3a-shrna基因序列，构建了三个paav-htr3a-shrna腺相关病毒载体质粒。同时构建htr3a过表达腺相关病毒载体质粒。
7.本发明提供的技术方案中，paav-htr3a-shrna腺相关病毒载体质粒和htr3a过表达病毒载体质粒同时转染293t细胞，western blot分析筛选能显著降低htr3a表达的paav-htr3a-shrna腺相关病毒载体质粒，并对其进行病毒包装。将包装后的aav-htr3a-shrna病毒对6月龄tg ad小鼠海马注射四周后，海马htr3a蛋白含量显著降低；并且海马aβ斑显著减少而皮质没有差异。基于人和啮齿类动物htr3a基因高度保守，本发明认为能够显著沉默htr3a表达的htr3a-shrna基因、paav-htr3a-shrna质粒和aav-htr3a-shrna病毒，在对ad患者的基因治疗中有极大的应用前景。
8.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
9.本发明首先提供htr3a基因序列的应用，htr3a基因中的第383-第401位的ggttctgaccacctacata基因序列在制备治疗阿尔茨海默病的药物上的应用。本发明研究发现，干扰htr3a的ggttctgaccacctacata这一段基因序列，能显著降低htr3a蛋白表达。
10.在本发明的一个实施方式中，htr3a基因序列第383-第401位的ggttctgaccacctacata基因序列在制备沉默htr3a表达以治疗阿尔茨海默病的药物上的应用。
11.本发明还提供一种有效沉默htr3a基因的htr3a-shrna基因序列，其靶向htr3a基因第383-第401位的ggttctgaccacctacata基因序列。
12.进一步地，有效沉默htr3a基因的htr3a-shrna的序列5
’‑
accggggttctgaccacctacatattcaagagatatgtaggtggtcagaaccttttt-3’。
13.本发明还提供一种沉默htr3a表达的paav-htr3a-shrna质粒，所述质粒中包含所述的htr3a-shrna基因序列。
14.沉默htr3a表达的paav-htr3a-shrna质粒，具体为一种沉默htr3a表达的paav-htr3a-shrna腺相关病毒载体质粒。
15.在本发明的一个实施方式中，所述质粒的基因序列如seq id no.7所示。
16.本发明还提供一种沉默htr3a蛋白表达的aav-htr3a-shrna病毒，所述病毒包含的paav-htr3a-shrna质粒。
17.沉默htr3a蛋白表达的aav-htr3a-shrna病毒，具体为沉默htr3a表达的aav-htr3a-shrna腺相关病毒。
18.本发明还提供一种所述有效沉默htr3a基因的htr3a-shrna在制备阿尔兹海默症基因治疗药物中的应用。
19.本发明还提供一种所述沉默htr3a表达的paav-htr3a-shrna质粒在制备阿尔兹海默症基因治疗药物中的应用。
20.本发明还提供一种所述沉默htr3a蛋白表达的aav-htr3a-shrna病毒在制备阿尔兹海默症基因治疗药物中的应用。
21.本发明申请人在很偶然的实验中用western blot方法观察到10月龄tg ad小鼠的大脑皮质和海马htr3a含量较同窝的阴性(wt)小鼠显著增加。进一步用western blot方法
观察3月龄的小鼠htr3a的蛋白表达水平，实验结果发现：3月龄的tg ad小鼠其htr3a的表达水平较wt小鼠也显著增加。
22.其次，用免疫组化、免疫荧光染色观察，染色结果显示10月龄tgad小鼠皮层和海马有大量的htr3a强阳性中间神经元、且可见htr3a强阳性中间神经元聚集呈簇，而在wt小鼠仅可见弥散分布、htr3a弱阳性的神经元。
23.第三，发明申请人用htr3a/thio-s、htr3a/app、htr3a/bace1荧光双标共聚焦观察，发现htr3a强阳性中间神经元是生成aβ的神经元之一。
24.第四，本发明用构建的aav-htr3a-shrna病毒注射到6月龄tgad小鼠海马，一个月后取脑组织观察，海马htr3a蛋白表达显著减少，证明tgad小鼠海马htr3a沉默成功、htr3a蛋白表达减少。因此，说明本发明构建的aav-htr3a-shrna腺相关病毒载体在小鼠脑内能有效沉默htr3a基因，降低htr3a蛋白表达。更重要的是沉默htr3a基因，tgad小鼠海马aβ淀粉样斑显著减少，这些结果直接证实tgad小鼠的htr3a强阳性中间神经元是产生aβ淀粉样斑神经元之一。
25.这些结果首次证实ad模型小鼠中htr3a强阳性中间神经元是产生aβ淀粉样斑的神经元之一，沉默htr3a基因降低htr3a蛋白表达，减少aβ淀粉样斑。
26.本发明构建的aav-htr3a-shrna腺相关病毒能有效沉默htr3a基因、降低htr3a蛋白表达、减少aβ淀粉样斑。
27.进一步，本发明还利用实验证实了ad患者脑组织htr3a强表达，发现了ad患者的脑组织htr3a强表达。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.(1)在ad模型小鼠中，阐明htr3a强阳性中间神经元是生成aβ淀粉样斑的神经元之一；
30.(2)利用aav-htr3a-shrna病毒对tgad小鼠进行基因治疗，显著降低htr3a的表达，并显著减少aβ淀粉样斑，减缓ad的病程；
31.(3)设计、筛选、制备针对特异性降低htr3a表达的htr3a-shrna基因序列、paav-htr3a-shrna腺相关病毒载体质粒和aav-htr3a-shrna腺相关病毒，在ad患者的基因治疗中有极大的应用前景。
附图说明
32.图1实施例1中western blot分析3月龄和10月龄tgad小鼠皮质和海马htr3a的表达水平
33.图1显示3、10月龄的app/ps1 ad(tgad)小鼠的皮质(cortex,ctx)和海马(hippocampus,hip)htr3a表达水平比野生型wt小鼠的显著增加。
34.图2：实施例1中tgad小鼠海马htr3a免疫荧光化学染色实验结果；
35.图2显示，10月龄(10m)的tgad小鼠海马htr3a强阳性中间神经元(箭头所指)；wt组仅可见很弱的htr3a免疫染色。gc：齿状回颗粒细胞层(granular cell,gc)。放大倍数200倍。
36.图3：实施例1中tgad小鼠htr3a免疫组化染色结果；
37.图3显示10月龄tgad小鼠皮质和海马htr3a强阳性中间神经元(箭头所指)，wt组仅
可见很弱的htr3a免疫染色。放大倍数200倍
38.图4：实施例2中htr3a/thio-s荧光双染共聚焦观察结果。
39.图4包括图4a 和4b；
40.4a共聚焦200倍镜下显示aβ斑周围有htr3a强阳性中间神经元聚集(箭头所指)；
41.4b共聚焦400倍镜下观察aβ斑周围有htr3a强阳性中间神经元聚集，下排是上排a框的放大可见htr3a与thio-s染色的共定位(黄色，箭头所指)
42.图5：实施例2中htr3a/app免疫荧光双标染色共聚焦观察结果
43.图5显示聚集呈花环状的app阳性神经突起周围有聚集的htr3a强阳性染色；并且部分app阳性神经突起与htr3a强阳性染色共定位(黄色，箭头所指)
44.图6实施例2中htr3a/bace1免疫荧光双标染色共聚焦观察结果
45.图6显示bace1阳性染色周围有聚集的htr3a强阳性中间神经元，并且部分bace1阳性染色与htr3a强阳性染色共定位(箭头所指)，放大倍数200倍
46.图7实施例3western blot检测htr3a过表达质粒转染293细胞后htr3a的表达结果；
47.图7显示htr3a过表达质粒转染293细胞后htr3a的表达比对照组显著增加。1是htr3a的阳性对照；2con:空病毒转染293细胞；3oe:htr3a过表达质粒转染293细胞
48.图8实施例3，western blot检测htr3a-shrna病毒载体质粒转染293t细胞后htr3a的表达水平；
49.图8显示htr3a-shrna病毒载体质粒转染293t细胞后，western blot检测293t细胞htr3a表达结果，结果显示kd3的htr3a-shrna病毒载体质粒比对照组显著降低了htr3a蛋白的表达。
50.con：不转染任何质粒的293t细胞组(空细胞组)
51.oe-nc：共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒细胞组(阴性对照组)
52.kd：共转染htr3a过表达质粒和htr3a-shrna病毒载体质粒细胞组
53.kd 1-3：含有针对目的基因htr3a的不同干扰序列的shrna病毒载体质粒
54.oe：htr3a过表达质粒
55.图9：htr3a rnai腺相关病毒载体构建的流程图；
56.图10：htr3a rnai腺相关病毒载体gv390信息；
57.图11：htr3a过表达载体腺相关病毒gv208信息；
58.图12：本实施例中，western blot分析aav-htr3a-shrna病毒海马注射后小鼠海马htr3a表达结果
59.图12结果显示，tgad小鼠海马注射aav-htr3a-shrna病毒4周后，显著降低海马htr3a蛋白表达，但仍显著高于wt对照组。
60.图13本实施例中，aav-htr3a-shrna病毒海马注射后海马和皮质htr3a免疫染色照片
61.图13结果显示，aav-htr3a-shrna病毒组的tgad小鼠海马htr3a强阳性染色比tgad小鼠对照组的显著减少，但仍高于wt对照组；但aav-htr3a-shrna病毒组的tgad小鼠皮质htr3a强阳性染色和tgad小鼠对照组皮质的没有差异。(箭头示聚集的htr3a强阳性中间神经元)
62.图14：本实施例中，使用aβ特异性抗体6e10进行western blot分析aav-htr3a-shrna病毒注射后小鼠海马aβ淀粉样斑含量的结果
63.图14结果显示，aav-htr3a-shrna病毒注射显著减少了tgad小鼠海马aβ淀粉样斑
64.图15：本实施例中，6e10抗体免疫染色分析aav-htr3a-shrna病毒海马注射后tgad小鼠皮质和海马aβ淀粉样斑染色结果
65.图15结果显示，aav-htr3a-shrna 病毒注射组的tgad小鼠海马aβ淀粉样斑含量比ad病毒对照组的显著降低；而皮质没有差别(箭头所指aβ斑)
66.图16：实施例5中ad患者额叶特异性aβ抗体6e10组织化学染色结果；
67.图16ad患者额叶皮层有显示ad患者皮层有大量的aβ淀粉样斑；而ad对照组没有阳性染色。右侧低倍：40倍，左侧高倍：200倍(箭头所指aβ斑)
68.图17：实施例5中ad患者皮质aβ淀粉样蛋白western blot分析结果；
69.图17western blot分析显示ad患者皮质aβ淀粉样蛋白比正常组显著增加。
70.图18：实施例5中ad患者额叶磷酸化tau蛋白的组织化学染色结果；
71.图18ad患者额叶磷酸化tau蛋白的组织化学染色显示ad患者皮层神经纤维缠结而ad对照组没有阳性染色。低倍：40倍，高倍200倍(箭头所指磷酸化tau阳性的神经纤维缠结)
72.图19：实施例5中western blot方法ad患者htr3a蛋白表达；
73.图19western blot分析ad患者皮层(ctx)和海马(hip)的htr3a表达较对照组的显著升高。
74.图20：实施例5中用免疫组织化学染色观察ad患者htr3a阳性细胞；
75.图20免疫组织化学染色显示ad患者脑海马区域有一些htr3a阳性细胞，对照组未观察到阳性细胞。
76.图21htr3a的结构示意图和中枢htr3受体结构示意图。
具体实施方式
77.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
78.aβ淀粉样蛋白沉积是ad大脑的两个标志性特征之一，也是疗法开发的重要靶点。htr3a是形成功能性htr3受体所必需，表达于大脑皮质和海马的gaba能中间神经元，调控抑制性神经元的突触传递，与认知、情感密切相关。
79.本发明研究的htr3a的结构示意图和中枢htr3受体结构示意图如图21所示。
80.实施例1
81.app/ps1转基因ad模型小鼠(tgad小鼠)皮质和海马htr3a的表达显著增加；免疫染色观察到htr3a强阳性中间神经元、且聚集呈簇，并与早期aβ淀粉样斑的出现部位相吻合。
82.本技术发明人在很偶然的实验中用western blot方法观察到10月龄tg ad小鼠的大脑皮质和海马htr3a含量较同窝的阴性(wt)小鼠显著增加。进一步观察3月龄的小鼠htr3a的蛋白表达水平，实验结果发现：3月龄的tg ad小鼠其htr3a的表达水平较wt小鼠也显著增加(图1)，
83.其次，用免疫组化染色、免疫荧光染色观察，染色结果显示7月龄、10月龄tgad小鼠皮层和海马有大量的htr3a强阳性中间神经元、且可见强阳性的中间神经元聚集呈簇，而在wt小鼠仅可见弥散分布、htr3a弱阳性的神经元(图2-3)。在海马，htr3a强阳性中间神经元
的分布特点与早期aβ淀粉样斑的出现部位相一致。这些结果提示tgad小鼠htr3a强阳性的中间神经元可能在ad的aβ淀粉样斑形成中起作用。
84.本实施例的方法如下：
85.本实施例采用的tgad小鼠(从南方大学模式动物中心购买)，是广泛使用的ad模型小鼠。本实施例中，western blot分析的具体方法如下：
86.同窝出生的tgad小鼠、阴性小鼠(wt)在同一饲养环境下分别饲养3个月和7.个月、10个月。在各时间点，过量麻醉小鼠、断头取出海马和大脑皮质，用ripa裂解液提取蛋白，bca蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。按照每孔10μg的蛋白总量，12％sds-page电泳分离蛋白后，将凝胶转至pvdf膜。根据蛋白分子量切膜，剪好后的膜用1
×
tbst室温下于慢速摇床上漂洗5min，随后将膜于5％bsa中室温下封闭1h。膜封闭后于一抗中4℃下孵育16h，用鼠来源的htr3抗体(1∶500)和小鼠抗gapdh抗体(1∶1000；ag019，beyotime)抗体。一抗孵育完成后，用1
×
tbst室温下于快速摇床上，荡洗10min，共3次。将膜浸入相应辣根过氧化物酶标记抗鼠(1∶1000；a0181，beyo-time)二抗中，室温下于慢速摇床上孵育2h后，用1
×
tbst室温下于快速摇床上，荡洗10min，共3次。用ecl化学发光试剂盒(p0018a，beyotime)显影，采用image quant las4000mini化学发光成像分析仪(28955813，gehealthcare life sciences)观察结果。用imagej软件分析，以gapdh为内参，计算出htr3a相对表达量。
87.本实施例中，免疫荧光染色的具体方法如下：
88.wt小鼠和app/ps1 ad小鼠各3只，用于免疫荧光染色。小鼠用适量10％水合氯醛麻醉后开胸暴露心脏，经左心室用生理盐水灌注至肝脏变白，经含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液(pb)灌注预固定后，取出全脑，4℃下在上述相同固定液中后固定24h。后固定完成后，将全脑于4℃下在含20％蔗糖的pb溶液中沉底24h，随后移入含30％蔗糖的pb溶液，4℃下放置24h完全沉底。将组织用冰冻切片机进行冠状切片，厚度为10μm。选取脑片，于pbs中室温下在慢速摇床上漂洗三次，每次10min，随后用5％bsa室温下封闭2h。封闭后，脑片浸入htr3a抗体(1∶100)中，4℃下孵育18h。脑片于pbs中室温下在慢速摇床上漂洗三次，每次10min。将脑片浸入相应生物素化二抗；避光室温孵育3h，漂洗后孵育三抗cy3-结合的链霉亲合素(1∶1000)中，室温下避光孵育2h后，慢速摇床上漂洗三次，每次10min。用dapi(1∶300)染色5min，室温下于慢速摇床上漂洗三次，每次10min后，封片。正置显微镜下观察拍照，用im-agej软件对每张脑片htr 3a阳性细胞进行计数。
89.本实施例中，免疫组化染色的具体方法如下：脑切片的处理与上述荧光染色相同。在第一抗体(htr3a抗体)孵育24h后；生物素化二抗(1:200)中，置于摇床上转速80-100rpm，室温孵育2小时；再孵三抗，将脑片放入含有生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(1:200)的ep管中，置于摇床上转速80-100rpm，室温孵育2小时。dab呈色观察，pbs充分洗涤后，脱水透明封片。
90.实施例2
91.htr3a/thio-s、htr3a/app、htr3a/bace1荧光双标共聚焦观察，发现htr3a强阳性中间神经元是生成aβ的神经元之一。
92.用htr3a/thio-s双标染色共聚焦观察，实验结果发现：tgad小鼠皮质与海马在aβ斑周围有htr3a强阳性中间神经元聚集，并可见htr3a与thio-s染色的共定位(图4b箭头所指；在无aβ斑块的区域，可见散在分布的htr3a强阳性中间神经元(图4)。
93.用htr3a/app、htr3a/bace1双标染色观察，实验结果发现：在聚集呈花环状的app阳性神经突起周围可见显著的htr3a强阳性中间神经元，并且部分聚集呈花环状app阳性神经突起与htr3a强阳性染色共定位(黄色，图5箭头所指)；bace1阳性染色处有htr3a强阳性染色，部分bace1阳性染色与htr3a强阳性染色共定位(黄色，图6箭头所指)。这些结果首次强烈地提示htr3a强阳性中间神经元是生成aβ的神经元之一。
94.在本实施例中，具体的染色方法如下：
95.脑片的thio-s与htr3a双染：脑片先进行thio-s的染色：将脑片放入0.5％硫磺素thio-s溶液，室温孵育5分钟；50％酒精溶液洗两次，每次5分钟；用双蒸水漂洗5分钟；再进行htr3a的免疫荧光染色，方法同实施例1，封片。在共聚焦荧光显微镜下观察拍照。
96.htr3a/app、htr3a/bace1免疫荧光双染：抗原修复：将脑片置入ph6.0的柠檬酸钠缓冲盐溶液中，95℃水浴修复5分钟，待冷却至室温后；用pbs室温漂洗3次，每次5分钟；孵一抗htr3a抗体/app抗体或htr3a抗体/bace1抗体4℃过夜,和漂洗：孵二抗：按照一抗源性，同时选择相应生物素化二抗和488标记的二抗，用抗体稀释液稀释混匀，稀释比例均为1:500，避光室温孵育3小时；漂洗后，孵三抗：孵育三抗cy3-conjuated streptavidin稀释比例为1:1000，室温1小时；漂洗后封片。在共聚焦荧光显微镜下观察拍照。
97.实施例3
98.构建、筛选能有效沉默htr3a的aav-htr3a-shrna腺相关病毒
99.构建短发夹状结构rna(short haipin rna,shrna)的病毒载体，感染细胞表达产生shrna，经dicer酶切割后得到sirna，沉默htr3a基因。
100.(1)构建三个paav-htr3a-shrna质粒：
101.根据htr3a基因(如seq id no.1所示，gene_id:15561,genbank:nm_013561)设计了针对目的基因htr3a基因中的3个序列(分别是如seq id no.1所示序列的383-401序列；865-883序列；1252-1270序列)，并构建3个htr3a-shrna。
102.3个htr3a-shrna分别为：
103.psc63830-1：accggggttctgaccacctacatattcaagagatatgtaggtggtcagaaccttttt，序列如seq id no.2所示。
104.psc63829-1：accgggccggaggcctttattctattcaagagatagaataaaggcctccggcttttt，序列如seq id no.3所示。
105.psc63828-1：accggccaccttccaagccaacaattcaagagattgttggcttggaaggtggttttt，序列如seq id no.4所示。
106.在上述htr3a-shrna序列中，前面的大写是目的基因htr3a序列片段；后面的大写是与目的基因序列片段互补的基因序列；中间小写部分是连接目的基因片段序列与互补序列的环(loop)。
107.制备双链dna oligo；与酶切后的腺相关病毒载体连接，将连接物转化感受态细胞，菌落pcr鉴定，阳性克隆测序、质粒抽提。
108.基因测序显示三个paav-htr3a-shrna质粒构建成功。
109.三个paav-htr3a-shrna质粒，分别为：htr3a》psc63828-1-pgcsil-f_h08.ab1、htr3a》psc63829-1-pgcsil-f_c07.ab1、htr3a》psc63830-1-pgcsil-f_e07.ab1，一个对照质粒为gv390-control：wy1805-7-pgcsil-f_h09.ab1。
110.htr3a》psc63828-1-pgcsil-f_h08.ab1的基因序列如seq id no.5所示。
111.htr3a》psc63829-1-pgcsil-f_c07.ab1的基因序列如seq id no.6所示。
112.htr3a》psc63830-1-pgcsil-f_e07.ab1的基因序列如seq id no.7所示。
113.对照质粒gv390-control：wy1805-7-pgcsil-f_h09.ab1的基因序列如seq id no.8所示。其中，gv390-control的序列为：5
’‑
accggcgctgagtacttagaaatgtcctcgaggacatttcgaagtactcagcgttttt-3’。序列如seq id no.9所示。
114.(2)构建htr3a过表达质粒、阳性克隆测序
115.htr3a过表达质粒序列如seq id no.10所示。比对结果说明：测序结果与genebank mouse htr3a基因序列完全一致。
116.将htr3a过表达质粒转染293细胞，蛋白印迹检测htr3a的表达情况，结果显示htr3a的表达比对照组显著增加，说明htr3a过表达质粒构建成功(图7)。
117.(3)有效pavv-htr3a-shrna质粒体外筛选：用上述三种htr3a质粒与htr3a过表达质粒共转化293t细胞，蛋白印迹检测htr3a的表达情况，以筛选有效的htr3a-shrna质粒。
118.结果显示在构建的3个pavv-htr3a-shrna质粒中，仅有其中一个质粒显著降低了293细胞的htr3a的表达(图8)。并对htr3a干扰有效的质粒进行腺相关病毒的包装，获得aav-htr3a-shrna的病毒；作为对照aav-con-shrna。
119.综上，本实施例所设计的3个paav-htr3a-shrna质粒psc63830-1(kd3)、psc63828-1(kd1)和psc63829-1(kd2)，只有paav-htr3a-shrna psc63830-1(kd3)质粒能有效沉默htr3a基因、降低htr3a蛋白表达。
120.因此，293t细胞的体外转染实验，证实干扰htr3a的ggttctgaccacctacata这一段基因序列，能显著降低htr3a蛋白表达。
121.(4)htr3a干扰有效的质粒psc63830-1腺相关病毒包装、收集病毒的保存
122.对照组：aav9-con-shrna的滴度是5.69e 12vg/ml；aav9-htr3a-shrna的滴度是2.19e 12vg/ml。将上述病毒分装，保存于-80℃冰箱。
123.本实施例的具体实验步骤如下：
124.一在本实施例中，htr3a rnai腺相关病毒载体构建的流程图如图9所示。
125.1腺相关病毒载体(aav)信息
126.paav-u6-shrna-cmv bglobin-egfp-3flag(gv390)腺相关病毒载体如图10：
127.gv390腺相关病毒载体具有如下特点：
128.a，结构为u6 promoter-polylinker-cmv-bglobin-intron-egfp
129.b，polylinker:
130.accgcgagacggcccggcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgacgtcctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccactagtcgtctcctaga
131.c，通过限制性内切酶bsmb i使gv390载体线性化，连接入htr3a-shrna序列，构建
为带有目的基因htr3a-shrna序列的腺相关病毒载体。两个bsmbi之间的序列上带有lac-z序列，可以作蓝白斑筛选。如图10所示。
132.2.htr3a和对照组luciferase sirna靶点设计
133.(1)阴性对照组基因信息
134.rnai control shrna for luciferase
135.(2)sirna序列:根据小鼠htr3a基因序列，设计3个针对htr3a基因的不同序列如下表，并设计阴性对照(firefly luciferase)。
136.genesourcetarget sequencefirefly luciferase(sirna阴性对照)nonecgctgagtacttcgaaatgtchtr3a-sirna(psc63828-1)mouseccaccttccaagccaacaahtr3a-sirna(psc63829-1)mousegccggaggcctttattctahtr3a-sirna(psc63830-1)mouseggttctgaccacctacata
137.3病毒载体构建框架
[0138][0139][0140]
4dna oligo合成
[0141]
(1)合成片段信息
[0142][0143]
(2)引物退火形成带粘性末端的双链
[0144]
把合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，然后自然冷却至室温，配对。
[0145]
5克隆制备
‑‑
连接反应通过t4 dna连接酶将双酶切线性化的载体和dna oligo在适当的buffer中进行连接反应，连接后的产物进行转化实验。
[0146]
腺相关病毒载体连接反应体系：
[0147][0148]
转化过程实验步骤：(1)用冷却的无菌吸头从大肠杆菌感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加2μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；(2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管；(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟；(4)每管加800μlsoc培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；(5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/l mgso4和amp抗性(100ug/ml)的lb琼脂培养基上；(6)将平板置于室温直至液体被吸收；(7)倒置平皿，于37℃培养，16小时；(8)阳性克隆pcr鉴定。
[0149]
6.阳性克隆的pcr鉴定、阳性克隆测序
[0150]
蓝白斑筛选后，挑选白色克隆送测序。
[0151]
二htr3a过表达载体构建
[0152]
1.病毒载体gv208信息，如图11所示。
[0153]
2.载体酶切
[0154]
根据如下列表，配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
[0155][0156]
3.htr3a的获取
[0157]
(1)引物
[0158]
设计htr3a扩增引物，扩增引物包含交换配对碱基、酶切位点、表达增强序列以及目的基因5’端部分序列用于pcr钓取目的基因。
[0159]
(2)pcr扩增目的基因片段
[0160]
配制如下反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于pcr仪中进行反应。
[0161]
反应体系：
[0162][0163]
反应条件：
[0164][0165]
pcr产物琼脂糖凝胶电泳回收目的条带及纯化，得到htr3a基因。
[0166]
4.pcr产物与载体进行连接
[0167]
于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
[0168]
5.转化、菌落pcr鉴定、测序的步骤与paav-htr3a-shrna质粒相同。
[0169]
将10μl交换反应产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置
30min。42℃预热90s，冰水浴孵育2min。加入500μl lb培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。
[0170]
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行分析。
[0171]
6htr3a过表达质粒的表达检测
[0172]
(1)质粒转染细胞方法：对数生长期的293t细胞制成细胞悬液，计数，接种于24-well培养板中(细胞数约为2
×
104，具体根据细胞形态大小而定)，37℃、5％co2培养箱培养至细胞融合度达到约80％；(2)根据细胞转染预实验和invitrogen lipofectamine2000转染试剂使用说明书设计，加入适宜量的质粒和转染试剂；(3)4-6h后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基。转染24-48h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，荧光率大于80％，拍完荧光后补加500μl正常培养基，待长满后收集细胞用于htr3a蛋白质检测。
[0173]
(2)western blot检测目的蛋白htr3a表达情况：收集质粒转染的293t细胞，裂解细胞收集总蛋白，方法与实施例1相同。
[0174]
三western blot筛选外源有效的htr3a-shrna病毒载体质粒
[0175]
1目的基因htr3a过表达质粒和htr3a-shrnai病毒载体质粒共转染293t细胞，实验分组(24孔板)如下表
[0176][0177]
2细胞转染质粒分组和质粒用量
[0178][0179]
组别说明：
[0180]
con：不转染任何质粒的293t细胞组(空细胞组)
[0181]
oe-nc：共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒细胞组(阴性对照组)
[0182]
kd：共转染htr3a过表达质粒和htr3a-shrna病毒载体质粒细胞组
[0183]
kd 1-3：含有针对目的基因htr3a的不同干扰序列的shrna病毒载体质粒
[0184]
oe：htr3a过表达质粒
[0185]
质粒转染量说明：
[0186]
group1、group2转染的过表达质粒量为0.60μg
[0187]
group1转染的rnai质粒量为0.30μg；group2转染的rnai质粒量为0.60μg
[0188]
3质粒转染293t细胞的方法同上，转染后24h收集细胞，用于western blot检测。
[0189]
4western blot检测目的蛋白htr3a表达水平：收集质粒转染的293t细胞，裂解细胞收集总蛋白，方法与实施例1相同。western blot检测htr3a表达水平。
[0190]
四rnai有效的paav-htr3a-shrna腺相关病毒质粒psc63830-1的包装
[0191]
1准备aav-293细胞
[0192]
把10ml dmem生长培养基加入每一个100-mm组细胞培养盘中，加入3
×
106个aav-293细胞。当细胞汇合率达到50％时须传代，传代细胞用于转染。
[0193]
2aav-293细胞的转染：使用磷酸钙转染方法
[0194]
(1)当aav-293细胞生长达到70-80％的汇合度，用于转染；
[0195]
(2)从-20℃冰箱中取出将进行行共转染的质粒，用ph7.5 te缓冲液将质粒的浓度调整到1mg/ml；
[0196]
(3)转染质粒的准备：计算所需的转染体系和质粒用量，如果包装一盘则吸出三种质粒(paav-rc和phelper，aav-htr3a-shrnapsc63830-1)各10ul(10ug每个)到一个1.5ml的ep离心管中，然后加入1ml的0.3m cacl2，轻轻混合；
[0197]
(4)吸取1ml的2
×
hbs溶液到另一个15ml锥底管中，向其中滴加1.03ml的dna/cacl2混合液(上一步)，通过翻转或是反复吹打温和混匀；
[0198]
(5)立即将混合后的dna/cacl2/hbs溶液滴加到细胞培养盘上。加入的同时轻轻晃动细胞培养盘，使得溶液尽量均匀的分布在培养基中；
[0199]
(6)将细胞培养盘放回到37℃度培养箱放置6小时；转染结束后，将盘中的培养基替换为10ml新鲜的培养基；
[0200]
(7).将培养盘送回到孵箱中，另外培养66-72小时。
[0201]
3收获、纯化病毒：转染3天后，收集细胞和培养上清中的病毒，并对aav进行纯化。
[0202]
4病毒保存：在病毒浓缩液中加入甘油使得终浓度为5％。分装保存在-80℃冰箱。
[0203]
5病毒滴度的测定：使用定量pcr的方法测量病毒滴度。
[0204]
实施例4用构建的aav-htr3a-shrna病毒注射到6月龄tgad小鼠海马，一个月后取脑组织观察，海马htr3a蛋白表达显著降低、aβ淀粉样斑显著减少
[0205]
病毒双侧海马注射一个月后取脑组织。western blot实验显示给予aav-htr3a-shrna病毒的tgad小鼠海马htr3a蛋白含量比tgad对照组(给予对照病毒的tgad小鼠)的显著降低但仍高于wt对照组(给予对照病毒的wt小鼠)(图12)。此外，免疫染色显示给予aav-htr3a-shrna病毒的tgad小鼠海马htr3a强阳性中间神经元数量比tgad对照组的显著降低，而皮质htr3a免疫染色没有差异(图13)。这些结果证明tgad小鼠海马htr3a沉默成功、htr3a蛋白表达减少。
[0206]
因此，本发明构建的aav-htr3a-shrna腺相关病毒载体在小鼠脑内能有效沉默htr3a基因，降低htr3a蛋白表达。本发明进一步观察沉默tgad小鼠htr3a基因，降低htr3a蛋白表达对aβ淀粉样斑的影响。
[0207]
对aβ淀粉样蛋白检测，用aβ特异性抗体6e10的western blot分析，结果显示aav-htr3a-shrna病毒注射组的tgad小鼠海马aβ含量比tgad病毒对照组的显著降低(图14)；此外，用6e10的免疫染色，结果显示aav-htr3a-shrna病毒注射组的tgad小鼠海马aβ淀粉样斑沉积比ad病毒对照组的显著降低；而皮质没有差别(图15)。
[0208]
综上，本实施例的这些结果首次证实ad模型小鼠中htr3a强阳性中间神经元是产
生aβ淀粉样蛋白、形成淀粉样斑的神经元之一,沉默htr3a基因降低htr3a蛋白表达，aβ淀粉样斑减少。
[0209]
本发明构建的aav-htr3a-shrna腺相关病毒能有效沉默tgad小鼠htr3a基因、降低htr3a蛋白表达、减少aβ淀粉样斑。
[0210]
本实施例的具体实验步骤如下：
[0211]
制备了aav-htr3a-shrna-egfp病毒，aav-con-shrna
ꢀ‑
egfp病毒为对照。6月龄的wt小鼠和tgad小鼠，给予双侧海马病毒注射。实验分三组：(1)wt小鼠给予2μl的aav-con-shrna
ꢀ‑
egfp(病毒量2.19
×
109v.g/每侧(wt-ctrl-shrna)；(2)tg ad小鼠给予2μl的aav-con-shrna-egfp(病毒量2.19
×
109v.g/每侧)(tg ad-ctrl-shrna)；(3)tgad小鼠给予aav-htr3a-shrna-egfp病毒(2.19
×
109v.g/每侧)(tg ad-htr3a-shrna)。注射后动物饲养4周，过量麻醉、取脑组织，进行western blot蛋白印迹实验和脑片免疫荧光染色。western blot蛋白印迹实验和免疫荧光染色的方法参考实施例1。
[0212]
海马脑立体定位注射：用0.07％戊巴比妥(按0.1mg/10g)腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠固定于脑立体定位仪上，头顶部去除毛发，棉球蘸取70％酒精消毒皮肤，头顶部正中切口，棉球蘸取3％h2o2擦拭前囟和后囟，使其充分暴露，定位前囟和后囟，使其在同一平面，以前囟为坐标原点，设置坐标参数(前囟后-2.2mm，正中线侧
±
1.6mm，深度 2.8mm)，在钻孔后向双侧海马ca1区进针，速度为100mm/h，然后缓慢注入病毒，注射病毒速度为0.2μl/min，注射完毕后留针5min，进行退针100mm/h，退针后，对手术创口进行碘伏消毒，缝合创口，再次进行消毒。将小鼠从脑立体定位仪上取下，放在保温垫上，待苏醒后放回饲养笼。注意掌握好麻醉剂量，若过多小鼠会麻醉致死；钻孔时需控制好速度宁慢勿快；固定头颅时不能太紧，以免刺激迷走神经导致呼吸停止。
[0213]
实施例5观察ad患者脑组织htr3a表达是否增强
[0214]
首先用组织化学染色和western blot分析检测ad患者和正常老人组皮层和海马的aβ淀粉样蛋白和磷酸化tau-蛋白(p-tau)，以证实确实为ad患者。6e10抗体免疫组织化学染色结果显示，ad患者颞叶和海马能观察到大量的aβ斑，但在ad对照组中未见aβ斑(图16)。此外，我们用western blot技术检测ad患者和ad对照组颞叶皮质aβ的含量，蛋白条带清楚显示ad患者颞叶皮质中aβ含量显著高于ad对照组(图17)。p-tau免疫组织化学染色结果显示，ad患者颞叶和海马能观察到大量的tau阳性神经纤维缠结，但在ad对照组未见tau阳性神经纤维缠结(图18)
[0215]
上述实验结果证实，本发明的确获得了正常老人和ad患者的脑组织样本。在此基础上，我们用western blot方法观察正常组和ad患者脑组织的htr3a的蛋白表达，western blot分析结果发现ad患者的皮层和海马htr3a表达显著增加(图19)。此外，用免疫组化染色观察，结果显示ad对照组脑组织没有检测到htr3a阳性细胞；但ad患者皮层和海马可见htr3a阳性细胞(图20)。这些结果证实ad患者脑组织htr3a强表达。
[0216]
因此，本发明申请人发现了ad患者的脑组织htr3a强表达。
[0217]
本实验具体实验方法如下：本实验在中南大学湘雅医学院神经科研究中心进行。通过湘雅医学院的遗体捐献计划，利用美国国家卫生研究院建立的标准化操作规程(sop)，从脑捐献志愿者的颅骨中取出脑，沿矢状缝分成左右大脑半脑，一般左侧脑放入磷酸缓冲液配制成的4％多聚甲醛中后固定，固定2-4周后，沿冠状面切成厚度1cm的脑片，拍摄照片
存档，福尔马林固定的这部分脑组织用于免疫组织化学的研究；右脑沿冠状位从额叶至枕叶切成厚度为1cm的脑片，用简易塑封袋分装标记好后，放入-80℃冰箱中冷冻保存，用于western blot蛋白分析。
[0218]
用组织化学染色和western blot分析检测ad患者和正常组老人皮质和海马的aβ淀粉样蛋白和磷酸化tau-蛋白(p-tau)，以证实确实为ad患者。western blot和组织化学染色的程序与上面相同。其次，htr3a的免疫组织化学染色和脑组织的western blot的方法同实施例1.
[0219]
因此，本技术专利首次观察到ad患者大脑皮质和海马也存在htr3a表达增强。由于在ad小鼠，本技术专利观察到htr3a强表达的中间神经元是产生aβ的神经元之一；利用基因干扰技术特异性沉默htr3a、降低htr3a蛋白表达，aβ淀粉样斑减少。并且htr3a基因在哺乳类动物高度保守，因此本专利发明申请人认为ad患者中htr3a强表达的中间神经元也是产生aβ的神经元之一；aav-htr3a-shrna病毒能有效沉默ad小鼠htr3a基因、降低htr3a蛋白表达，也可能有效沉默ad患者的htr3a基因、降低htr3a蛋白表达，淀粉样斑减少。这些结果显示针对htr3a的基因治疗，可以阻止ad的进程，对ad患者的治疗有巨大的应用前景与社会价值。
[0220]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。