基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用

专利检索2022-05-11  13


streptomyces albulus using ph shock strategy in the level of transcriptomics)一文中,利用转录组学分析,敲除了信号转导系统中的有关基因,说明了其对ε-聚赖氨酸的产量存在着重要的作用。
9.如上所述,目前虽然有报道将基因工程技术用于菌株的改造上,但对于通过基因敲除构建工程菌提高ε-聚赖氨酸产量的报道较少。因此,需要一种基于抑制支路代谢途径的策略,利用基因敲除手段改造ε-聚赖氨酸产生菌以提高ε-聚赖氨酸产量的方法,而不单单局限于对代谢途径中关键基因的过表达。
10.通过对比,本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。


技术实现要素:

11.本发明目的在于克服现有技术中的不足之处,提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用。
12.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
13.一种淀粉酶产色链霉菌,名称为:6#-7,分类命名为:淀粉酶产色链霉菌streptomyces diastatochromogenes,保藏编号为:cgmcc no.22261,保藏日期:2021年4月30日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
14.一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌,所述淀粉酶产色链霉菌通过将脂肪酸合成代谢通路中的关键基因脂肪酸acp合酶基因fabf在streptomyces diastatochromogenes6#-7中分别敲除得到的。
15.进一步地,所述streptomyces diastatochromogenes6#-7的名称为6#-7,分类名称为streptomyces diastatochromogenes,保藏编号为:cgmcc no.22261,保藏日期:2021年4月30日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;敲除的基因序列分别为fabf1、fabf2、fabf3,基因碱基序列与seq no.32、no.33、no.34相似性达90%以上。
16.如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法,步骤如下:
17.(1)提取原始s.diastatochromogenes 6#-7的基因组;
18.(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板,采用pcr技术扩增目的基因上下游同源片段;
19.(3)利用soe-pcr,将步骤(2)得到的上下游同源片段与用于替换目的基因的抗性片段连接,得到用于敲除目的基因的敲除组件;
20.(4)将纯化后的融合片段即敲除组件和出发载体pjtu 412分别进行ecor i单酶切,16℃条件下,在t4 dna ligase作用下与融合片段进行过夜连接,得到携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒;
21.(5)将步骤(4)构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌et12567/puz8002中,通过接合转移法将所述的表达载体整合入s.diastatochromogenes6#-7的基因组中,获得基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。
22.进一步地,所述步骤(3)中抗性为安普霉素抗性。
23.进一步地,所述步骤(4)中携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒的具体构建步骤如下:
24.(1)敲除组件的获得:敲除组件包含fabf基因的等位位点,即该基因的上游同源片段及下游同源片段,以及用于替换目的基因的抗性即安普霉素抗性片段作为筛选标记;
25.以s.diastatochromogenes6#-7的基因组为模板,根据fabf基因分别设计上下游同源片段引物序列fabf-f/fabf-r;以pset152质粒为模板,根据安普霉素apr抗性基因设计引物序列apr-f/apr-r;
26.在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸,形成限制性内切酶ecor i的酶切位点;
27.(2)重组质粒的构建:将纯化后的融合片段和出发载体pjtu 412分别进行ecor i单酶切,16℃条件下,在t4 dna ligase作用下与融合片段进行过夜连接,连接产物通过化学转化的方法转入到e.coli dh5α感受态筛选转化子,保存。
28.进一步地,所述步骤(4)中pjtu 412质粒不仅包含来源于大肠杆菌质粒的复制起始位ori colei点,也包含来源于链霉菌质粒的复制起始位点oripij101,因此该质粒可以在大肠杆菌和链霉菌中能够进行自主复制。
29.如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。
30.利用如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的方法,步骤如下:
31.将基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上,在28-37℃培养直至产生孢子;然后,将孢子接种至m3g培养基摇瓶中,在28-37℃,150-200r/min,培养24-30h,将培养好的种子转接到m3g培养基中进行发酵直至72h,即得含ε-聚赖氨酸发酵液。
32.进一步地,每1lm3g培养基的组成为:(nh4)2so410g/l,kh2po41.36g/l,k2hpo40.8g/l,酵母提取物5g/l,用氨水调节ph到7.2,加水定容至900ml,121℃单独灭菌20min;在使用m3g培养基时,每取90ml m3g,再加入10ml10
×
的葡萄糖母液;
33.10
×
的葡萄糖母液:每称取100g葡萄糖,加入2ml20g/lznso4·
7h2o和2ml250g/lmgso4·
7h2o,用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min;
34.每1l贝纳特培养基的组成为:葡萄糖10g/l,蛋白胨2g/l,酵母浸粉1g/l,牛肉膏1g/l,琼脂15-20g/l,naoh调ph 7.7,加水补充至1l,121℃灭菌20min。
35.本发明取得的优点和积极效果为:
36.1.本发明通过敲除脂肪酸合成代谢途径中关键基因获得基因工程重组菌株,经过实验证实,该链霉菌基因工程菌株在相同情况下较原始菌株淀粉酶产色链霉菌6#-7生产ε-聚赖氨酸的能力均有提高,为ε-聚赖氨酸生产提供了优良菌种。
37.2.本发明在一株产ε-聚赖氨酸的淀粉酶产色链霉菌基础上,敲除了脂肪酸合成途径中关键酶-脂肪酸acp合酶(3-oxoacyl-acpsynthase)基因fabf,构建了基因工程菌株,通过抑制支路代谢改变代谢流分布,提高了ε-聚赖氨酸的产量,使终产物浓度增高,提升了菌株产酸效率。
38.3.本发明方法通过分别敲除脂肪酸acp合酶fabf1、fabf2、fabf3来提高ε-聚赖氨
酸发酵水平。
39.4.本发明通过敲除脂肪酸acp合酶fabf1、fabf2、fabf3,发现淀粉酶产色链霉菌聚赖氨酸生物合成中脂肪酸合成途径对ε-聚赖氨酸的生产有重要影响。
40.5.本发明选择一株淀粉产色链霉菌s.diastatochromogenes 6#-7作为分子生物学操作的出发菌株,该菌株的保藏编号为cgmcc no.22261。
41.通过同源双交换的原理从s.diastatochromogenes6#-7菌株的基因组上分别敲除了脂肪酸acp合酶fabf1、fabf2、fabf3三个基因,成功构建了缺失目的基因的工程菌。该工程菌可以高效利用碳源合成更多的ε-聚赖氨酸,经摇瓶发酵产量分别提高了63.3%、42.2%、40%。从发酵角度进一步证实缺失支路代谢关键基因可以更好的提高发酵液碳源的利用,使菌株能很好的合成ε-聚赖氨酸,有效解决了发酵过程中引起的的问题,有良好的工业应用前景。
附图说明
42.图1为本发明中以pjtu 412为基础构建pjtu 412-δfabf1重组质粒的构建图;
43.图2为本发明中以pjtu 412为基础构建pjtu 412-δfabf2重组质粒的构建图;
44.图3为本发明中以pjtu 412为基础构建pjtu 412-δfabf3重组质粒的构建图;
45.图4为本发明中获得基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf1阳性转化子提基因组,用目的基因fabf1两端引物验证结合转移是否成功的验证图;其中,泳道m:2kb marker;泳道1:验证δfabf1基因工程菌株中已敲除fabf1基因;泳道2:对照6#-7中存在fabf1基因;
46.图5为本发明中获得基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf2阳性转化子提基因组,用目的基因fabf2两端引物验证结合转移是否成功的验证图;其中,泳道m:2kb marker;泳道1:验证δfabf2基因工程菌株中已敲除fabf2基因;泳道2:对照6#-7中存在fabf2基因;
47.图6为本发明中获得基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf3阳性转化子提基因组,用目的基因fabf3两端引物验证结合转移是否成功的验证图;其中,泳道m:2kb marker;泳道1:验证δfabf3基因工程菌株中已敲除fabf3基因;泳道2:对照6#-7中存在fabf3基因;
48.图7为本发明中工程改造菌株在产量达到顶峰时的摇瓶发酵ε-聚赖氨酸相对产量图;以原始菌株6#-7作比较,纵坐标表示为高产菌株相对提高值,横坐标表示具体菌株;其中δfabf1为基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf1,δfabf2为基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf2,δfabf3为基因工程菌株streptomyces diastatochromogenesδfabf3。
具体实施方式
49.下面详细叙述本发明的实施例,需要说明的是,本实施例是叙述性的,不是限定性的,不能以此限定本发明的保护范围。
50.本发明中所使用的原料,如无特殊说明,均为常规的市售产品;本发明中所使用的方法,如无特殊说明,均为本领域的常规方法。
51.一种淀粉酶产色链霉菌,名称为:6#-7,分类命名为:淀粉酶产色链霉菌streptomyces diastatochromogenes,保藏编号为:cgmcc no.22261,保藏日期:2021年4月30日,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
52.一种基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌,所述淀粉酶产色链霉菌通过将脂肪酸合成代谢通路中的关键基因脂肪酸acp合酶基因fabf在streptomyces diastatochromogenes6#-7中分别敲除得到的。
53.较优地,所述streptomyces diastatochromogenes6#-7的名称为6#-7,分类名称为streptomyces diastatochromogenes,保藏编号为:cgmcc no.22261,保藏日期:2021年4月30日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所;敲除的基因序列分别为fabf1、fabf2、fabf3,基因碱基序列与seq no.32、no.33、no.34相似性达90%以上。
54.如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法,步骤如下:
55.(1)提取原始s.diastatochromogenes6#-7的基因组;
56.(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板,采用pcr技术扩增目的基因上下游同源片段;
57.(3)利用soe-pcr,将步骤(2)得到的上下游同源片段与用于替换目的基因的抗性片段连接,得到用于敲除目的基因的敲除组件;
58.(4)将纯化后的融合片段即敲除组件和出发载体pjtu 412分别进行ecori单酶切,16℃条件下,在t4 dna ligase作用下与融合片段进行过夜连接,得到携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒;
59.(5)将步骤(4)构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌et12567/puz8002中,通过接合转移法将所述的表达载体整合入s.diastatochromogenes6#-7的基因组中,获得基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。
60.较优地,所述步骤(3)中抗性为安普霉素抗性。
61.较优地,所述步骤(4)中携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒的具体构建步骤如下:
62.(1)敲除组件的获得:敲除组件包含fabf基因的等位位点,即该基因的上游同源片段及下游同源片段,以及用于替换目的基因的抗性即安普霉素抗性片段作为筛选标记;
63.以s.diastatochromogenes6#-7的基因组为模板,根据fabf基因分别设计上下游同源片段引物序列fabf-f/fabf-r;以pset152质粒为模板,根据安普霉素apr抗性基因设计引物序列apr-f/apr-r;
64.在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸,形成限制性内切酶ecori的酶切位点;
65.(2)重组质粒的构建:将纯化后的融合片段和出发载体pjtu 412分别进行ecori单酶切,16℃条件下,在t4 dna ligase作用下与融合片段进行过夜连接,连接产物通过化学转化的方法转入到e.coli dh5α感受态筛选转化子,保存。
66.较优地,所述步骤(4)中pjtu 412质粒不仅包含来源于大肠杆菌质粒的复制起始
位ori colei点,也包含来源于链霉菌质粒的复制起始位点ori pij101,因此该质粒可以在大肠杆菌和链霉菌中能够进行自主复制。
67.如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε-聚赖氨酸制备方面中的应用。
68.利用如上所述的基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的方法,步骤如下:
69.将基因工程高产ε-聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上,在28-37℃培养直至产生孢子;然后,将孢子接种至m3g培养基摇瓶中,在28-37℃,150-200r/min,培养24-30h,将培养好的种子转接到m3g培养基中进行发酵直至72h,即得含ε-聚赖氨酸发酵液。
70.较优地,每1lm3g培养基的组成为:(nh4)2so410g/l,kh2po41.36g/l,k2hpo40.8g/l,酵母提取物5g/l,用氨水调节ph到7.2,加水定容至900ml,121℃单独灭菌20min;在使用m3g培养基时,每取90ml m3g,再加入10ml10
×
的葡萄糖母液;
71.10
×
的葡萄糖母液:每称取100g葡萄糖,加入2ml20g/lznso4·
7h2o和2ml250g/lmgso4·
7h2o,用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min;
72.每1l贝纳特培养基的组成为:葡萄糖10g/l,蛋白胨2g/l,酵母浸粉1g/l,牛肉膏1g/l,琼脂15-20g/l,naoh调ph 7.7,加水补充至1l,121℃灭菌20min。
73.本发明中使用的培养基组成可以如下:
74.每1lm3g培养基的组成为:(nh4)2so410g/l,kh2po41.36g/l,k2hpo40.8g/l,酵母提取物5g/l,用氨水调节ph 到7.2,加水定容至900ml,121℃单独灭菌20min。;
75.葡萄糖母液:称取100g葡萄糖,加入2ml20g/lznso4·
7h2o和2ml250g/lmgso4·
7h2o,用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min。
76.m3g培养基用之前,加10ml葡萄糖母液于90mlm3g培养基中。
77.每1l贝纳特培养基的组成为:葡萄糖10g/l,蛋白胨2g/l,酵母浸粉1g/l,牛肉膏1g/l,琼脂15-20g/l,naoh调ph 7.7,加水定容至1l,121℃灭菌20min;
78.每1l lb培养基:酵母提取物5g/l,胰蛋白胨10g/l,葡萄糖1g/l,nacl5g/l,ph自然,加水定容至1l,121℃灭菌20min。
79.本发明中使用的pcr反应体系和条件可以如下:
80.pcr反应体系:2
×
phanta max buffer 25μl,dntp mixture(10mm)1μl,模板(20ng/ul)1μl,上、下游引物((10μm))各2μl,dmso2μl,phanta max
×
super-fidelity dna polymerase1μl,补超纯水至50μl。
81.pcr反应条件:95℃预变性5min;95℃变性15s,50-65℃退火15s,72℃延伸1min,共循环30次,72℃延伸5min,16℃结束反应。
82.更为具体地,通过相关实施例来具体说明:
83.实施例1
84.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌δfabf1(streptomyces diastatochromogenesδfabf1),构建步骤如下:
85.(1)敲除组件的获得:敲除组件包含fabf1基因的等位位点,即该基因的上游同源片段及下游同源片段,以及用于替换目的基因的抗性片段(安普霉素抗性)作为筛选标记。
86.以s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板,根据fabf1基因分别设计上下游同源片段引物序列fabf1-l-f/fabf1-l-r和fabf1-r-f/fabf1-r-r;以pset152质粒为模板,根据安普霉素抗性基因(apr)设计引物序列fabf1-apr-f/fabf1-apr-r。
87.在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸,形成限制性内切酶ecori的酶切位点。
88.所述引物的序列为:
89.fabf1-l-f:seq no.2,即5
’‑
cggaattcgctaccgcccgacccgtgt-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
90.fabf1-l-r:seq no.3,即5
’‑
gtggtttgtttgccggatcaagggaattcttactccacgg-3’;
91.fabf1-r-f:seq no.5,即5
’‑
gatcggtcttgccttgctcgtggccccaccaggccgcgcc-3’;
92.fabf1-r-r:seq no.6,即5
’‑
cggaattcagccctgggacgacgagctgga-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
93.fabf1-apr-f:seq no.8,即5
’‑
ccgtggagtaagaattcccttgatccggcaaacaaaccac-3’;
94.fabf1-apr-r:seq no.9,即5
’‑
ccggggtggtccggcgcggacgagcaaggcaagaccgatc-3’。
95.所述脂肪酸acp合酶1基因fabf1上游同源片段的序列为seq no.1,脂肪酸acp合酶1基因fabf1下游同源片段的序列为seq no.4,安普霉素抗性基因(apr)的序列为seq no.7。
96.(2)含有fabf1基因敲除组件的质粒pjtu 412-δfabf1的构建:
97.以s.diastatochromogenes6#-7的基因组为模板,分别扩增目的基因上下游约1.5kb长的片段,以pset 152质粒为模板扩增安普霉素抗性(apr)片段,利用soe-pcr将同源左臂、同源右臂以及安普霉素抗性基因片段进行融合。将纯化后的融合片段和出发载体pjtu 412分别进行ecor i单酶切,16℃条件下,在t4dnaligase作用下与融合片段进行过夜连接,得到连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf1。如图1所示。
98.(3)重组质粒pjtu 412-δfabf1的转化:
99.取连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf1加入到在冰浴中已融化的含有e.colidh5α感受态细胞的离心管中,轻弹管壁,混匀,冰浴30min。42℃热激90s,然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下,向离心管中加入900μl lb培养基,吹打混匀后,37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min,移除900μl上清,用移液器将剩余液体吹打混匀,涂布到含有安普霉素的lb固体抗性平板上。将lb平板37℃倒置培养过夜,至单菌落清晰可辨,挑取阳性转化子进行菌落pcr验证正确后,重组质粒pjtu 412-δfabf1已成功转化到转化子中。
100.(4)基因工程菌株的获得:
101.利用结合转移的方法将质粒pjtu 412-δfabf1整合到淀粉酶产色链霉菌6#-7(streptomyces diastatochromogenes 6#-7)基因组中。
102.首先提取e.coli dh5α转化子中的pjtu 412-δfabf1重组质粒,将重组质粒按化学方法转化至辅助e.coliet12567/puz8002中,将转化子涂布于含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml安普霉素和25μg/ml氯霉素的lb抗性平板中,37℃倒置培养24h。挑选e.coli阳性转化子单菌落于5ml lb(含有三种抗生素,浓度与上一步相同)中,37℃恒温震荡过夜培养,之后
按照1%的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50ml lb液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同),180r/min37℃振荡培养至od
600
=0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40ml菌液,用新鲜的lb洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素,重悬至1ml lb中置于冰上备用,得到处理过的e.coli阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子生长良好的平板上加入10ml ph 8.0的tes缓冲液,用无菌接种环刮下孢子,倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶中,30℃,180r/min振荡2h,打断孢子链,然后用无菌脱脂棉过滤,除去菌丝。50℃水浴热激10min,立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mlm3g培养基,于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发,5000r/min离心5min收集孢子,用tes缓冲液重悬孢子,得到萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子备用。
103.将处理过的e.coli阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子等体积混合,均匀涂布于含有5mm mgcl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后,用含25μl萘啶酮酸(浓度为25mg/ml)及25μl安普霉素(浓度为25mg/ml)的1ml无菌水对平板进行覆盖,吹干平板后继续倒置培养3-5天,挑选阳性结合子单克隆提基因组,用目的基因fabf1两端引物验证结合转移是否成功。上游引物fabf1-f5
’‑
gtgaacgcgaccaatcgcaccgt-3’(seq no.10),下游引物fabf1-r5
’‑
tcaggccgtgcggaaggcgag-3’(seq no.11),经过pcr验证,fabf1基因(seq no.32)已成功从6#-7的基因组中敲除,淀粉酶产色链霉菌δfabf1基因组中并未获得相应条带(如图4所示)。
104.实施例2
105.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌δfabf2(streptomyces diastatochromogenesδfabf2),构建步骤如下:
106.(1)敲除组件的获得:敲除组件包含fabf2基因的等位位点,即该基因的上游同源片段及下游同源片段,以及用于替换目的基因的抗性片段(安普霉素抗性)作为筛选标记。
107.以s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板,根据fabf2基因分别设计上下游同源片段引物序列fabf2-l-f/fabf2-l-r和fabf2-r-f/fabf2-r-r;以pset152质粒为模板,根据安普霉素抗性基因(apr)设计引物序列fabf2-apr-f/fabf2-apr-r。
108.在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸,形成限制性内切酶ecori的酶切位点。
109.所述引物的序列为:
110.fabf2-l-f:seq no.13,即5
’‑
cggaattccggtgcggtgagcgtcaacctg-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
111.fabf2-l-r:seq no.14,即5
’‑
gtggtttgtttgccggatcaattgctttcctttcgcacgactc-3’;
112.fabf2-r-f:seq no.16,即5
’‑
gatcggtcttgccttgctcgtcgacgcgcgacgtgcgact-3’;
113.fabf2-r-r:seq no.17,即5
’‑
cggaattccggcgccgtggcgcgcggcga-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
114.fabf2-apr-f:seq no.18,即5
’‑
gagtcgtgcgaaaggaaagcaattgatccggcaaacaaaccac-3’;
115.fabf2-apr-r:seq no.19,即5
’‑
gctgcgcgctgcacgctgaacgagcaaggcaagaccgatc-3’。
116.所述脂肪酸acp合酶2基因fabf2上游同源片段的序列为seq no.12,脂肪酸acp合酶2基因fabf2下游同源片段的序列为seq no.15,安普霉素抗性基因(apr)的序列为seq no.7。
117.(2)含有fabf2基因敲除组件的质粒pjtu 412-δfabf2的构建:
118.以s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板,分别扩增目的基因上下游约1.5kb长的片段,以pset152质粒为模板扩增安普霉素抗性基因(apr)片段,利用soe-pcr将同源左臂、同源右臂以及安普霉素抗性基因片段进行融合。将纯化后的融合片段和出发载体pjtu 412分别进行ecori单酶切,16℃条件下,在t4dnaligase作用下与融合片段进行过夜连接,得到连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf2。如图2所示。
119.(3)重组质粒pjtu 412-δfabf2的转化:
120.取连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf2加入到在冰浴中已融化的含有e.colidh5α感受态细胞的离心管中,轻弹管壁,混匀,冰浴30min。42℃热激90s,然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下,向离心管中加入900μl lb培养基,吹打混匀后,37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min,移除900μl上清,用移液器将剩余液体吹打混匀,涂布到含有安普霉素的lb固体抗性平板上。将lb平板37℃倒置培养过夜,至单菌落清晰可辨,挑取阳性转化子进行菌落pcr验证正确后,重组质粒pjtu 412-δfabf2已成功转化到转化子中。
121.(4)基因工程菌株的获得:
122.利用结合转移的方法将质粒pjtu 412-δfabf2整合到淀粉酶产色链霉菌6#-7(streptomyces diastatochromogenes 6#-7)基因组中。
123.首先提取e.coli dh5α转化子中的pjtu 412-δfabf2重组质粒,将重组质粒按化学方法转化至辅助e.coli et12567/puz8002中,将转化子涂布于含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml安普霉素和25μg/ml氯霉素的lb抗性平板中,37℃倒置培养24h。挑选e.coli阳性转化子单菌落于5ml lb(含有三种抗生素,浓度与上一步相同)中,37℃恒温震荡过夜培养,之后按照1%的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50ml lb液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同),180r/min37℃振荡培养至od
600
=0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40ml菌液,用新鲜的lb洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素,重悬至1ml lb中置于冰上备用,得到处理过的e.coli阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子生长良好的平板上加入10ml ph 8.0的tes缓冲液,用无菌接种环刮下孢子,倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶中,30℃,180r/min振荡2h,打断孢子链,然后用无菌脱脂棉过滤,除去菌丝。50℃水浴热激10min,立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mlm3g培养基,于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发,5000r/min离心5min收集孢子,用tes缓冲液重悬孢子,得到萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子备用。
124.将处理过的e.coli阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子等体积混合,均匀涂布于含有5mm mgcl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后,用含25μl萘啶酮酸(浓度为25mg/ml)及25μl安普霉素(浓度为25mg/ml)的1ml无菌水对平板进行覆盖,吹干平板后继续倒置培养3-5天,挑选阳性结合子单克隆提基因组,用目的基因fabf1两端引物验证结合转移是否成功。上游引物fabf2-f5
’‑
gtgacaccccacatacccaacg-3’(seq no.20),下游引物fabf2-r 5
’‑
tcatggccgcgctccccc-3’(seq no.21),经过pcr验证,
fabf2基因(seq no.33)已成功从6#-7的基因组中敲除,淀粉酶产色链霉菌δfabf2基因组中并未获得相应条带(如图5所示)。
125.实施例3
126.一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌δfabf3(streptomyces diastatochromogenesδfabf3),构建步骤如下:
127.(1)敲除组件的获得:敲除组件包含fabf3基因的等位位点,即该基因的上游同源片段及下游同源片段,以及用于替换目的基因的抗性片段(安普霉素抗性)作为筛选标记。
128.以s.diastatochromogenes6#-7的基因组为模板,根据fabf3基因分别设计上下游同源片段引物序列fabf3-l-f/fabf3-l-r和fabf3-r-f/fabf3-r-r;以pset152质粒为模板,根据安普霉素抗性基因(apr)设计引物序列fabf3-apr-f/fabf3-apr-r。
129.在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸,形成限制性内切酶ecori的酶切位点。
130.所述引物的序列为:
131.fabf3-l-f:seq no.23,即5
’‑
cggaattccctgtgcctcgccccgctggt-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
132.fabf3-l-r:seq no.24,即5
’‑
gtggtttgtttgccggatcaatgacggttgcacgtgttgtcctt-3’;
133.fabf3-r-f:seq no.26,即5
’‑
gatcggtcttgccttgctcgtgcggcgcggatttcctcccgta-3’;
134.fabf3-r-r:seq no.27,即5
’‑
cggaattcctgccgagccccgacttcacc-3’,下划线序列为ecor i酶切位点;
135.fabf3-apr-f:seq no.28,即5
’‑
aaggacaacacgtgcaaccgtcattgatccggcaaacaaaccac-3’;
136.fabf3-apr-r:seq no.29,即5
’‑
tacgggaggaaatccgcgccgcacgagcaaggcaagaccgatc-3’。
137.所述脂肪酸acp合酶3基因fabf3上游同源片段的序列为seq no.22,脂肪酸acp合酶3基因fabf3下游同源片段的序列为seq no.25,安普霉素抗性基因(apr)的序列为seq no.7。
138.(2)含有fabf3基因敲除组件的质粒pjtu 412-δfabf3的构建:
139.以s.diastatochromogenes 6#-7的基因组为模板,分别扩增目的基因上下游约1.5kb长的片段,以pset 152质粒为模板扩增安普霉素基因(apr)片段,利用soe-pcr将同源左臂、同源右臂以及安普霉素片段进行融合。将纯化后的融合片段和出发载体pjtu 412分别进行ecor i单酶切,16℃条件下,在t4 dna ligase作用下与融合片段进行过夜连接,得到连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf3。如图3所示。
140.(3)重组质粒pjtu 412-δfabf3的转化:
141.取连接产物重组质粒pjtu 412-δfabf3加入到在冰浴中已融化的含有e.coli dh5α感受态细胞的离心管中,轻弹管壁,混匀,冰浴30min。42℃热激90s,然后立即冰浴5min(此过程不要移动)。无菌条件下,向离心管中加入900μl lb培养基,吹打混匀后,37℃、200r/min振荡培养45min。将离心管12000r/min离心1min,移除900μl上清,用移液器将剩余
液体吹打混匀,涂布到含有安普霉素的lb固体抗性平板上。将lb平板37℃倒置培养过夜,至单菌落清晰可辨,挑取阳性转化子进行菌落pcr验证正确后,重组质粒pjtu 412-δfabf3已成功转化到转化子中。
142.(4)基因工程菌株的获得:
143.利用结合转移的方法将质粒pjtu 412-δfabf3整合到淀粉酶产色链霉菌6#-7(streptomyces diastatochromogenes 6#-7)基因组中。
144.首先提取e.coli dh5α转化子中的pjtu 412-δfabf3重组质粒,将重组质粒按化学方法转化至辅助e.coliet12567/puz8002中,将转化子涂布于含有100μg/ml卡那霉素、50μg/ml安普霉素和25μg/ml氯霉素的lb抗性平板中,37℃倒置培养24h。挑选e.coli阳性转化子单菌落于5ml lb(含有三种抗生素,浓度与上一步相同)中,37℃恒温震荡过夜培养,之后按照1%的转接量转接至含有三种抗生素的新鲜50ml lb液体培养基中(抗生素浓度与上一步相同),180r/min37℃振荡培养至od
600
=0.4至0.6之间。8000r/min离心5min收集40ml菌液,用新鲜的lb洗涤菌体2-3次以除去残余的抗生素,重悬至1ml lb中置于冰上备用,得到处理过的e.coli阳性转化子细胞。向淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子生长良好的平板上加入10ml ph 8.0的tes缓冲液,用无菌接种环刮下孢子,倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶中,30℃,180r/min振荡2h,打断孢子链,然后用无菌脱脂棉过滤,除去菌丝。50℃水浴热激10min,立即将孢子悬液冷却至室温。之后加入10mlm3g培养基,于37℃条件下震荡培养2-3h使孢子萌发,5000r/min离心5min收集孢子,用tes缓冲液重悬孢子,得到萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子备用。
145.将处理过的e.coli阳性转化子细胞和萌发的淀粉酶产色链霉菌6#-7孢子等体积混合,均匀涂布于含有5mm mgcl2的贝纳特培养基上。30℃倒置培养。倒置培养14-18h后,用含25μl萘啶酮酸(浓度为25mg/ml)及25μl安普霉素(浓度为25mg/ml)的1ml无菌水对平板进行覆盖,吹干平板后继续倒置培养3-5天,挑选阳性结合子单克隆提基因组,用目的基因fabf1两端引物验证结合转移是否成功。上游引物fabf3-f5
’‑
gtggagatgggcatcgtc-3’(seq no.30),下游引物fabf3-r5
’‑
tcagacttcgatcagcgtgcag-3’(seq no.31),经过pcr验证,fabf3基因(seq no.34)已成功从6#-7的基因组中敲除,淀粉酶产色链霉菌δfabf3基因组中并未获得相应条带(如图6所示)。
146.利用如上所述的四种基因工程菌株发酵产生聚赖氨酸的方法,具体步骤如下:
147.将基因工程菌株接种在贝纳特培养平板上,在28-37℃培养7天左右直至产生孢子;然后,将孢子接种至含有100ml m3g培养基的500ml容量摇瓶中,在28-37℃,150-200r/min发酵30h。以6-10%的接种量转移到新的m3g培养基中发酵直至72h,即得含ε-聚赖氨酸发酵液,产量均较原始菌株淀粉酶产色链霉菌6#-7有不同程度的提高;
148.结果如图7所示,经过144小时的摇瓶发酵,三种基因工程菌株ε-聚赖氨酸产量在96h达到顶峰,与原始出发菌株6#-7相比各有不同程度的提升。其中菌株δfabf1产量比原始菌株提高了63.3%,菌株δfabf2ε-聚赖氨酸产量与6#-7相比提高了42.2%,菌株δfabf3产量较出发菌株明显提高了40%。以上结果充分说明敲除了ε-聚赖氨酸生物合成途径支路代谢,即脂肪酸合成途径中关键酶脂肪酸acp合酶对ε-聚赖氨酸产量有一定的提高效果。
149.尽管为说明目的公开了本发明的实施例,但是本领域的技术人员可以理解:在不
脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内,各种替换、变化和修改都是可能的,因此,本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
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