靶向ENSG00000203930基因的反义寡核苷酸及其应用的制作方法

靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸及其应用
技术领域
1.本发明属于基因药物技术领域，具体涉及一种靶向ensg00000203930基因 的反义寡核苷酸(aso)，以及使用该aso抑制ensg00000203930基因表达 的方法，以及施用包含这种aso的药物治疗疾病的方法。


背景技术：

2.反义寡核苷酸(aso)调控特定目标基因表达来源于rna干扰技术，是基 于碱基互补配对原理有效调节特定基因表达的技术。通过结构修饰和改造，包括 对核苷酸骨架的修饰改造比如硫代磷酸取代3’，5
’‑
磷酸二脂质键，对构成单核苷 酸改造比如用锁核酸替代等，极大程度提高了aso类药物的成药性。目前已有 多种aso类药物获批用于临床治疗各种疾病，并有许多aso类药物处于临床开 发的不同阶段。
3.ensg00000203930基因为人基因组包含的基因，其转录产物为长链非编码 rna(lncrna)。在人基因组里面只有不到2％的基因组转录产物编码产生蛋 白，而至少有75％的基因组转录为没有编码潜能的转录本，其中多数为超过200 个碱基的长链非编码rna(lncrna)。近些年的研究提示lncrna参与调控包 括癌症在内的多种疾病发生发展的各个方面。因而被视为潜在的治疗包括癌症等 疾病的药靶。以癌症为例，超过90％的癌症病人死亡是由于癌症转移到其它脏器 破坏正常脏器功能导致的。脑部是主要的癌症转移病灶之一，所有癌症病人中有 20％的病人最终会发生脑转移。虽然各种治疗手段不断进步，但目前仍然缺乏对 脑转移病人的有效治疗手段。导致目前脑转移癌症病人的中位生存期少于一年。 现有技术已有正在开发的治疗癌症脑转移的药物，其中包括cpg。cpg是一类 包含cpg模体的寡核苷酸，目前已经进入治疗癌症脑转移病人临床实验各个阶 段。我们研究发现ensg00000203930基因表达的长链非编码rna产物驱动肿 瘤脑转移。
4.由于lncrna不产生蛋白产物，现有针对蛋白的药物开发手段包括小分子抑 制剂和生物大分子抗体等不适用于靶向lncrna的分子靶向药物开发。因而aso 类药物(直接合成或载体表达)是实现靶向lncrna药物开发的重要方式。
5.本发明公开了抑制长链非编码rna基因-ensg00000203930基因表达方法 及其应用。为治疗癌症脑转移提供了新的方法。
6.参考文献：
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技术实现要素：

18.发明目的：本发明需要解决的技术问题是提供一种克隆制备了人脑转移癌细胞mda-mb-231-bm中ensg00000203930基因表达的非编码长链rna的转录本，并测序公开了该转录本的反义全序列。
19.本发明还要解决的技术问题是提供一种靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸。
20.本发明最后要解决的技术问题是提供上述靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸在制备治疗脑肿瘤转移药物中的应用。
21.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
22.ensg00000203930基因表达转录本，所述ensg00000203930基因表达转录本的反义核苷酸序列如seqidno.1所示。
23.靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸，其序列为seqidno.：1中连续15～30个核苷酸序列的反义序列，或与seqidno.：1中连续15～30个核苷酸序列的反义序列具有至少85％同一性的序列。
24.进一步地，所述反义寡核苷酸的序列如seqidno.2～4任一所示，或与seqidno.2～4任一具有至少85％同一性的序列；作为优选所述反义寡核苷酸的序列如seqidno.2～4任一所示。
25.进一步地，所述反义寡核苷酸的5’端和3’端分别由1～5个锁核酸修饰，所述锁核
酸是一种结构中2
’‑
o、4
’‑
c位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲 基桥或胺亚甲基桥的特殊双环状核苷酸衍生物。
26.进一步地，所述反义寡核苷酸中的核苷酸为硫代磷酸修饰的核苷酸。
27.作为优选，所述反义寡核苷酸的结构如式(ⅰ)所示；
28.(x)a*(n)b*(y)c29.式(ⅰ)
30.其中，x、y为锁核酸；n为反义寡核苷酸主链；
31.a、b、c分别表示x、n、y的核酸数；a、b、c为自然数，其中，1≤a≤5、 1≤c≤5；10＜a b c＜30；
32.*表示反义寡核苷酸主链中的核苷酸为硫代磷酸修饰的核苷酸；
33.式(ⅰ)中，2≤a≤3、2≤c≤3；15＜a b c＜22，优选a＝3，c＝3。
34.式(ⅰ)中，n的序列为seq id no.：2～4任一所示序列，或与seq id no.： 2～4任一所示序列具有至少85％同一性的序列。
35.式(ⅰ)中，所述锁核酸的结构如式(ⅱ)所示；
[0036][0037]
其中，base为碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧 啶或这些碱基衍生物。
[0038]
作为优选，所述x、y的的结构式选自(a)～(d)中的一种：
[0039][0040]
最优选式(a)所示的结构。
[0041]
本发明还公开了结构式(ⅰ)的一个合成的实验反义寡核酸(aso)序列和 相关修饰信息。本发明中aso包含本发明公开的ensg00000203930基因转录本 反义序列中的16个连续核苷酸，其序列为：caaaggcgcggactta(seq idno.2)；这一实验aso，特征为其主链包含硫代磷酸酯修饰，还包含锁核酸。 本发明中aso为gapmer,其特征为aso两端为锁核酸包裹中间非锁核酸的连续核 苷酸。
[0042]
上述靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸在制备细胞 ensg00000203930基因表达抑制剂中的应用在本发明的保护范围之内。本发明 还提供了如上所述aso用于抑制
细胞ensg00000203930基因表达的方法。在 相关实施实例中，实验aso配置成脂质制剂。在相关实施例中，aso剂量为 50nm，可以将细胞中ensg00000203930基因表达水平降低约50％。
[0043]
上述靶向ensg00000203930基因的反义寡核苷酸在制备治疗脑转移癌症药 物中的应用在本发明的保护范围之内。在相关实施实例中，实验aso剂量为 2mg/kg,可以实现显著的治疗效果,包括显著延长生存期和抑制体重减轻。
[0044]
一种药物组合物，其包含权利要求2～10任一所述反义寡核苷酸及其药学上 可接受的载体、稀释剂或赋形剂；或任选地与另一种治疗剂组合。
[0045]
进一步地，所述的治疗剂为cpg或cpg类似物。
[0046]
一种表达载体，所述表达载体中包括seq id no.：2～4任一所示的序列， 或包含与seq id no.：2～4任一所示的序列具有至少85％同一性的序列。
[0047]
作为优选，所述的表达载体为慢病毒载体、腺病毒载体、或其他非病毒质粒 载体，最优选慢病毒载体。
[0048]
靶向ensg00000203930基因表达的aso和药学上课接受的载体的药物组 合物、使用这种aso抑制ensg00000203930基因表达的方法、以及使用包含 这种aso的药物(单独或联合)治疗ensg00000203930基因引起的疾病的应 用。在实施实例中，公开了治疗脑转移癌症的应用。
[0049]
为方便起见，下面提供说明书、示例和所附权利要求书中使用的某些术语和 短语的含义。
[0050]
如果本说明书其他部分中术语的用法与本节提供的定义之间存在明显差异， 则以本节中的定义为准。“g”“c”“a”，“u”和“t”分别代表分别以鸟嘌呤、胞嘧 啶、腺嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶为碱基的核苷酸。除非特定说明核苷酸不特指其 为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，比如“g”指的是其中核苷酸碱基是胸腺嘧啶， 糖骨架可为脱氧核糖或核糖。应当理解，术语“核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核苷 酸”也可以指修饰的核苷酸，如下面进一步详细描述的，或替代替换部分。本领 域技术人员很清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶可 以被其他基团取代，而不会实质上改变包括带有这种取代基团的核苷酸的寡核苷 酸的碱基配对性质。例如，但不限于，以肌苷为碱基的核苷酸可以与含腺嘌呤、 胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本发明的核苷酸序列中包含尿嘧啶、 鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被包含，例如肌苷的核苷酸所取代。
[0051]
如本文所用ensg00000203930基因位于人x号染色体，如本领域技术人员 所理解，基因可能会有不同命名的名称和转录产物加工产生的不同转录本。反义 寡核苷酸(aso)为基于碱基互补配对原理降低基因表达的长度小于30个核苷 酸的单链或双链序列，其核苷酸可为修饰或未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷 酸。本领域技术人员很清楚，基于核心种子序列的aso，单链或双链，核苷酸 修饰或不修饰，调整核苷酸长度(通常不超过30个核苷酸)，可以同样达到敲 低靶基因的效果。不修饰或修饰的核苷酸形成的各种aso可以通过本领域中已 知的标准方法合成，如下面进一步讨论的，例如通过使用自动dna合成器，例 如可从例如biosearch应用生物系统公司获得的自动dna合成器。已知的修 饰包括修饰aso主链，比如但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸盐(包括3
‘‑
亚烷基磷 酸盐和手性膦酸酯)、膦酸盐、包括3
’‑
氨基磷酰亚胺和氨基烷基磷酰胺酸盐的磷 酸盐、硫代磷酰胺酸盐、硫代烷基膦酸盐和亚硫酸盐、2
‘‑5’
连接的这些和那些) 具有反转极性的类似物、相邻的核苷单元对连接3
‘‑5’
至5
‘‑3’
或2
‘‑5’
至5
‘‑2’
、各 种盐类、混合盐类和游离酸形式；核苷酸核糖修饰，比如但不限与包含一个或多 个取代糖基，aso在2
‘
位置加oh：f：o-、s-或n-烷基；o-、s或n-烯基， o-、s-或n-炔基，或o-烷基-o-烷基等；核苷酸碱基修饰，比如但不限于5-甲基 胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基 和其他腺嘌呤和鸟嘌呤的烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生 物、2-硫代胞嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤尿嘧啶和胞嘧啶。8-羟 基肛门，其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代，特别是5-溴，5-三氟甲基和其他 5-取代尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌 呤，7-去氮鸟嘌呤和7-达扎德烯宁以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤；将一个或 多个基团或结合物化学连接到aso上的轭合物修饰，比如但不限于脂质部分。 给定化合物中的所有位置不需要被统一修饰。aso还可以通过dna质粒或病毒 载体表达发挥作用。化学修饰可以改善aso的稳定性和其它方面的可成药属性。 因而部分或全部包含基于本文所公开的ensg00000203930基因转录本的aso 序列的其它类型修饰或不修饰的aso相关应用，涉及本发明公开内容。本领域 技术人员将会理解这一点。
[0052]
本发明实施实例中，aso和cpg单独或联合使用的剂量可以根据实际施用 对象和疾病严重程度，进行调整优化。例如从细胞培养分析和动物研究中获得的 数据可以用来制定一系列用于人类的剂量。本发明特征的组合物的剂量一般在正 常细胞包括毒性很小或没有毒性的ed50的循环浓度范围内。这样的信息可以用 来更准确地获得最优的有效剂量。根据所用剂型和给药途径的不同，剂量在此范 围内可能会有所不同。基于使用本领域公知的或在此描述的标准功效测量观察到 的结果来调整优化本发明公开的aso给药量、次数和时间治疗 ensg00000203930基因表达引起的疾病，其中包括但不局限于脑转移癌症。
[0053]
本发明具体涉及靶向ensg00000203930基因的aso和包含这种aso的药物或 药物组合物治疗ensg00000203930基因表达引起的疾病，比如但不局限脑转移 癌症。
[0054]
在本发明的实施实例中，包含实验aso的药物通过颅内注射的方式给药。 当待治疗的生物体是诸如人类的哺乳动物时，该组合物可以通过本领域中已知的 任何方式给药，包括但不限于口服或肠外途径，包括颅内(例如，脑室内、实质 内和鞘内)、静脉、肌肉内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻腔、直肠和局部(包 括口腔和舌下)给药。
[0055]
本领域技术人员很清楚，基于基因转录本的反义序列除了直接合成aso外， 还可以通过构建表达aso的表达载体来实现。表达载体一般为dna质粒或病 毒载体。表达产物为双链的双链核糖核酸(dsrna)类的aso。表达aso病毒 载体可以使用但不限于慢病毒。在另一实施实例中，基于本发明公开的 ensg00000203930基因表达的非编码长链rna的转录本的反义序列，设计制备 了四种的基于慢病毒的shrna载体。这四种载体为分别包含本发明公开的 ensg00000203930基因表达的非编码长链rna的转录本的反义序列中的如下序 列：atatttacaatgactgcaagt(实验shrna1)， aaatgttggtcttctcacagg(实验shrna2)，tttattgtatgatgtgtaggt (实验shrna3)和tttataactttccatccagat(实验shrna4)。在另一 实施实例中，施用实验shrna1和实验shrna2载体表达aso同样可以有效抑 制细胞中ensg00000203930基因的表达，抑制癌症脑转移疾病进程。
[0056]
本技术领域的技术人员很清楚的知道，aso类药物为寡核苷酸类药物，化合 物具
有足够的官能团，并因此可与多种无机碱、无机酸和有机酸中的任何一种反 应以形成盐。通常用于形成酸加成盐的酸是无机酸，例如但不限于盐酸、氢溴酸、 氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸，例如对甲苯磺酸、甲基烷磺酸、草酸、对 溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸，苯甲酸、乙酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、 焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢 盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、 辛酸盐、丙烯酸酯、甲酸盐、异丁酸盐、辛酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙 二酸盐、琥珀酸盐、，亚硝酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁烯-1,4
‑ꢀ
二甲酸盐、环氧-1,6-二甲酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基 苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐，二甲苯磺 酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙 醇酸盐、酒石酸盐、甲烷磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁 桃酸盐等。
[0057]
除非另有定义，这里使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的 普通技术人员通常理解的含义相同。
[0058]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0059]
本发明首次发现长链非编码rna基因-ensg00000203930基因表达特定转录本 序列作为脑转移治疗靶点，并公开了该转录本反义序列，还基于这一公开反义序 列设计的aso，通过合成或基于载体表达的aso可以显著抑制 ensg00000203930基因表达，对脑转移抑制效果明显，提出了抑制长链非编码 rna基因-ensg00000203930基因表达方法在制备抑制或治疗癌症脑转移的药 物中的应用。
附图说明
[0060]
图1制备脑转移癌细胞mda-mb-231-bm中ensg00000203930基因表达长 链非编码rna转录本载体表达验证。
[0061]
图2合成实验aso序列结构信息。
[0062]
图3与对照aso相比，实验aso转染在脑转移癌细胞mda-mb-231-bm后 ensg00000203930基因表达水平。
[0063]
图4与对照aso相比，实验aso和cpg单独或联合治疗脑转移小鼠后的小鼠 体重曲线。
[0064]
图5与对照aso相比，与对照相比，实验aso和cpg单独或联合治疗脑转移 小鼠后的小鼠生存曲线。
[0065]
图6实验shrna1-4包含ensg00000203930基因表达长链非编码rna转录本 反义核苷酸序列区域。
[0066]
图7与对照shrna相比，脑转移癌细胞mda-mb-231-bm实施实验shrna1 和实验shrna2通过慢病毒载体表达aso后ensg00000203930基因表达水平。
[0067]
图8与对照shrna相比，脑转移癌细胞mda-mb-231-bm实施实验shrna1 和实验shrna2通过慢病毒载体表达aso后注射小鼠四周时在小鼠中脑转移病灶 形成核磁共振nmr图像。
[0068]
图9与对照shrna相比，脑转移癌细胞mda-mb-231-bm实施实验shrna1 和实验shrna2通过慢病毒载体表达aso后对小鼠体重的影响。
[0069]
图10与对照shrna相比，脑转移癌细胞mda-mb-231-bm实施实验shrna1 和实验shrna2通过慢病毒载体表达aso后对小鼠生存的影响。
具体实施方式
[0070]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0071]
一、实验材料
[0072]
1.细胞系
[0073]
本文中所用到的细胞均列于表2-1细胞系：
[0074]
表2-1细胞系
[0075][0076]
2.实验动物及饲养相关材料
[0077]
本文实验所使用免疫缺陷小鼠购买自江苏集萃药康生物科技有限公司，合格 证号：202013227；本文的所有实验小鼠均饲养于南京师范大学动物实验中心的 spf(specific pathogen free)级实验房内。根据饲养要求，所有实验小鼠的饲养 密度小于或等于5只每笼，室温保持在20-25摄氏度的范围间，湿度保持在50％ 上下，自动光控(12h明/12h暗)。小鼠的饲料和垫料均购自京江宁区青龙山动 物繁殖场。
[0078]
3.表达载体
[0079]
表达ensg00000203930基因在脑转移癌细胞中转录本载体：pcdna3.1
[0080]
基于慢病毒表达aso的shrna载体：plko.1
[0081]
二、实验方法
[0082]
1.细胞复苏
[0083]
(1)从用液氮中取出冻存的细胞，立即放入37度的水浴锅中融化一分钟；
[0084]
(2)在生物安全柜中用1000μl移液枪吸出细胞悬液，转移至1.5ml离心管 中，900xg，离心1min，弃去上清；
[0085]
(3)在离心管中加入1ml完全培养基，重悬细胞并吹打均匀后，转移至已 经预先加好8-10ml完全培养基的100mm培养皿中，轻轻晃动使细胞分布均匀， 置于37度，5％co2培养箱中静置培养，次日清晨观察细胞生长情况，并更换培 养液。
[0086]
2.细胞传代
[0087]
待细胞处于对数生长期，长至整个细胞培养皿90％时，进行传代培养。细胞 培养前需对实验所需试剂进行70％酒精消毒和30min紫外灭菌。
[0088]
(1)取出待传代的细胞，在生物安全柜中，吸去培养皿中旧的培养基，沿 培养皿侧壁加入1mlpbs清洗细胞，然后吸除pbs。
[0089]
(2)沿培养皿侧壁加入1ml胰酶，水平翻转培养皿以确保胰酶均匀覆盖细 胞层，然后弃去胰酶，将培养皿置于37℃细胞培养箱消化，适当时间后取出用 倒置显微镜观察细胞是否完全分散(适当时间指正好使细胞皱缩变圆变亮，间隙 增大的时间，一般为2-5min,mcf10a细胞为10-12min)；
[0090]
(3)取出培养皿并向培养皿加入1ml的细胞培养基终止胰酶的消化作用， 用1000μ
l移液枪反复吹打分散细胞，将细胞悬液转移至1.5ml离心管，1000xg 离心1min。
[0091]
(4)吸去上清，向离心管中加入1ml的细胞培养基，重新悬浮细胞沉淀。
[0092]
(5)细胞计数：根据情况将细胞稀释10-100倍，吹打均匀后，取10μl加 入血球计数板，在显微镜下进行肉眼计数上下左右四个小室内细胞总数，重复三 次，计算其平均值x，根据公式原管1ml中细胞总数＝x/4*稀释倍数*104计算出 细胞总数；
[0093]
(6)根据后一步实验需要取出适量的细胞悬液加入细胞培养皿，再加入一 定量的完全培养基(配方：dmem 10％fbs)，置于37℃，5％co2细胞培养 箱中培养。
[0094]
3.细胞冻存
[0095]
(1)配制1ml细胞冻存液(90％fbs 10％dmso)；
[0096]
(2)按照上方细胞传代步骤(1)-(3)操作；
[0097]
(3)用刚配制好的细胞冻存液重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至冻存 管中，标记好冻存者姓名，细胞名称和冻存时间等相关信息；
[0098]
(4)按照4度30min，-20度2h，-80度1w，液氮的顺序冻存细胞。
[0099]
4.化学合成aso细胞给药和活性评价
[0100]
将实验或对照aso化合物溶解于te buffer(配方：10mm tris,ph 7.5,0.1 mm edta)配置成50μm的浓缩液。脂质体配方：n-[1-2，3-dioleyoxy， propyl]-n，n，n-trimethylammonium chloride(dotma)和dioleoylphotidye-thanolamine(dope)的混合物[1：1(w/w)]。脂质体：aso为1：1(w/w)。 剂量：aso终溶度50nm。aso脂质体37℃孵育细胞10小时后更换无药完全 培养基，48小时后，通过rt-qpcr检测其对ensg00000203930基因表达的影 响。
[0101]
5.基于慢病毒shrna表达aso细胞给药和活性评价
[0102]
用293t细胞制备慢病毒，收集慢病毒感染细胞，10小时后更换无病毒完全 培养基，48小时后，通过rt-qpcr检测其对ensg00000203930基因表达的影 响。
[0103]
6.脑转移小鼠模型构建、给药和治疗脑转移活性评价
[0104]
(1)化学合成aso和cpg单独或联合使用
[0105]
脑转移小鼠模型：直接脑部注射10万个mda-mb-231-bm细胞到小鼠脑室 构建脑转移小鼠模型。
[0106]
给药：同位置注射生理盐水、aso、cpg或aso和cpg。aso剂量2mg/kg； cpg剂量2mg/kg。每只小鼠注射药物或生理盐水总体积为10μl。
[0107]
治疗脑转移活性评价：在试验过程中，每天监测小鼠体重和存活情况。
[0108]
(2)基于慢病毒shrna表达aso
[0109]
脑转移小鼠模型：心室注射10万个mda-mb-231-bm细胞到小鼠脑室构建 脑转移小鼠模型。
[0110]
给药：用表达aso的慢病毒预处理mda-mb-231-bm细胞
[0111]
脑转移活性评价：在试验过程中，每天监测小鼠体重和存活情况，每周用核 磁共振(nrm)成像扫描小鼠脑部观测脑部转移病灶形成情况。
[0112]
7.rna提取—trizol法
[0113]
a：细胞rna提取(全过程使用rnaase-free的枪头和离心管)
[0114]
(1)取长满至90％-100％的细胞，弃去培养液，1ml pbs洗一遍，弃去pbs， 加1ml胰
酶消化，将细胞尽量完全吹打下来，收集至1.5ml离心管内，再用pbs 洗一遍，1000xg离心后，弃去pbs。
[0115]
(2)加入1ml trizol(100mm培养皿的细胞量)重悬细胞沉淀，室温静置 5min。
[0116]
(3)加入200μl氯仿，涡旋混匀，静置5min。
[0117]
(4)将混合溶液于4度，13000xg离心15分钟，离心结束后出现分层，从 上往下为无色水样上层，乳白色中间层，红色酚氯仿层。转移无色透明的水样上 层于新的离心管内(约500μl)。
[0118]
(5)再加入500μl异丙醇，充分混匀后静置5min。
[0119]
(6)将混合溶液于4度，13000xg离心10分钟，弃去上清，保留白色沉淀， 即rna。
[0120]
(7)用300μl 70％乙醇重悬清洗沉淀两次，每次离心13000xg，2min。
[0121]
(8)弃去上清，在超净工作台内开盖吹风5-10min，使乙醇挥发干净，加入 30μl rna-free的水溶解rna，测量rna浓度。
[0122]
b：组织rna提取(全过程使用rnaase-free的枪头和离心管)
[0123]
(1)在1.5ml离心管中加入100μl trizol，研磨组织至发白，再补加900μl trizol。
[0124]
(2)室温孵育5min，4度12000xg离心15min。将上清转移至新的离心管 内。
[0125]
(3)加入200μl氯仿，剧烈摇晃3min，再室温孵育3min，然后4度12000 xg离心15min。
[0126]
(4)离心结束后出现分层，从上往下为无色水样上层，乳白色中间层，红 色酚氯仿层。将无色水样上层转移至新的离心管内(约500μl)。
[0127]
(5)再加入500μl异丙醇，充分混匀后静置10min。
[0128]
(6)4度1200xg离心10min，弃去上清，保留白色沉淀，即rna。
[0129]
(7)加入500μl 75％冰乙醇洗涤，涡旋后，室温7500xg离心5min，弃上 清。
[0130]
(8)重复步骤(7)。
[0131]
(9)在超净工作台内开盖吹风5-10min，使乙醇挥发干净，加入30μl rna-free的水溶解rna，测量rna浓度。
[0132]
8.rna逆转录
[0133]
(1)按下方表2-8rna逆转录为cdna体系加入所需试剂(全程需使用 rnaase-free的枪头)，混合均匀后，瞬时离心20秒，放入pcr仪中进行逆转 录反应，反应程序是：50℃，15min；85℃，5sec。反应结束后，cdna存放于-20 度。
[0134]
表2-8 rna逆转录为cdna体系
[0135][0136]
9.实时定量pcr
[0137]
(1)在八连排管中按下方表2-9q-pcr体系加入所需试剂，混合均匀后，瞬 时离心20秒，放入实时定量pcr仪中。
[0138]
表2-9 q-pcr体系
[0139][0140]
(2)实时定量pcr仪的反应程序按照下方表2-10q-pcr反应程序进行
[0141]
表2-10 q-pcr反应程序
[0142][0143]
实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0144]
实施例1：表达人脑转移癌症细胞系mda-mb-231-bm中ensg00000203930 基因转录长链非编码rna转录本载体制备及该转录本其反义链全序列。
[0145]
通过提取mda-mb-231-bm细胞中的rna、逆转录、3
’‑
race、5
’‑
race、 测序、全才pcr、构建并制备表达载体、测序分析，鉴定并公开了 ensg00000203930基因长链非编码rna转录本反义链全序列。图1制备获得的mda-mb-231-bm中ensg00000203930基因转录长链非编码rna转录本载体 转染细胞可以表达。seq id no.1所示的序列为本发明鉴定的mda-mb-231-bm 中ensg00000203930基因转录长链非编码rna产物反义全序列包含有1,257个 碱基，其中a为30.23％，g为24.42％，t为26.81％，c为18.54％。
[0146]
实施例2：实验aso设计和合成。
[0147]
依据本发明鉴定的ensg00000203930基因长链非编码rna转录本序列， 设计合成实验aso。图2显示实验aso的序列为caaaggcgcggactta，含 有修饰核苷酸有5'-硫代磷酸酯基的核苷酸和锁核酸的gapmer。合成aso化合 物通过hplc分析和质谱鉴定，分子量为5310.24da。
[0148]
实施例3：:实验aso抑制细胞中ensg00000203930基因表达。
[0149]
通过制备实验aso脂质体，施用实验aso剂量为50nm，rt-qcp检测细胞 中ensg00000203930基因的表达。图3显示实验aso与对照aso对比，可以 显著抑制细胞中ensg00000203930基因表达，50nm实验aso可以降低 ensg00000203930基因表达约50％。
[0150]
实施例4：包含实验aso的药物治疗脑转移癌症的活性。
[0151]
在小鼠脑转移癌症模型中，施用包含实验aso的药物(单独或联合cpg)， 其中aso剂量为2mg/kg，cpg剂量为2mg/kg，观测包含实验aso的药物治疗脑 转移癌症的活性。图4显
示，与对照相比，实验aso单独治疗，显著缓解模型 脑转移小鼠体重减轻，效果优于cpg；施用实验aso可以进一步增强cpg在其 缓解模型脑转移小鼠体重减轻的效果。图5显示与对照相比，实验aso单独治 疗，显著延长模型脑转移小鼠生存，效果优于cpg；并且施用实验aso可以进 一步增强cpg在其延长模型脑转移小鼠生存，。
[0152]
实施例5：:载体表达aso的制备及其活性
[0153]
基于本发明公开的ensg00000203930基因表达的非编码长链rna的转录 本的反义全序列，制备了4个基于慢病毒载体表达aso的实验shrna(即实验shrna1-4)。图6显示，实验shrna-1和实验shrna-2中包含 ensg00000203930基因表达的非编码长链rna的转录本反义序列区域。图7显 示，与对照相比，实验基于慢病毒载体表达的实验shrna-1和实验shrna-2可 以显著抑制细胞内ensg00000203930基因表达，降低ensg00000203930基因 表达约80％。图9-10显示，与对照相比，脑转移mda-mb-231-bm细胞施用 慢病毒载体表达的实验shrna-1和实验shrna-2后，其形成脑转移病灶的能力 明星减弱(图8)；其减轻小鼠体重的能力显著减弱(图9)；其导致小鼠死亡 的能力显著减弱(图10)。