荧光探针、荧光探针试剂盒和硫酸盐还原菌的检测方法

1.本发明涉及硫酸盐还原菌检测技术领域，具体而言，涉及一种荧光探针、荧光探针试剂盒和硫酸盐还原菌的检测方法。


背景技术：

2.硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria，简称srb)是一种厌氧的微生物,广泛存在于土壤、海水、地下管道、城市管网、人体口腔以及油气井等缺氧环境中。它能利用金属表面的有机物作为碳源，并利用细菌生物膜内产生的氢，还原硫酸盐生成硫负离子(硫化氢)，直接造成金属材料腐蚀失效。srb通过新陈代谢活动在各种材料表面形成生物膜，造成物理、化学等灭菌手段失效，严重威胁材料服役安全。在某些环境中，srb能够在管道壁上聚集，使管道可能发生局部点蚀。硫酸盐还原菌与有机物质、硫酸盐反应生成硫化氢、二氧化碳会与管道壁中的铁反应，产生不同形式的硫铁化合物。硫铁化合物和管道中其他形式的沉积物形成大量的黑色粉末，这些黑色粉末比管道碳钢硬度大，故会对管道部件造成严重的腐蚀危害。
3.srb作为油田管道中主要危害菌，腐蚀金属管道，导致管道堵塞、腐蚀穿孔、油气泄漏，给工业生产带来了众多的安全隐患。因此，有必要对管道中srb进行快速检测，以采取有效措施控制其危害。在srb检测分析方面，传统检测技术主要包括以下几种方法：(1)液体培养法：将待测样品进行梯度稀释，利用硫酸盐还原菌选择性培养基培养不同稀释度的待检测样品，获得硫酸盐还原菌培养液，根据培养液性状结合最大可能数法(mpn法)确定细菌浓度；(2)固体培养法：用硫酸盐还原菌选择性固体培养基筛选分离硫酸盐还原菌，根据菌落数确定细菌浓度。(3)血球计数法：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。而常用的方法操作繁琐且周期较长(至少7d)，不能及时反映现场出现的问题，因此，希望能研制出一种简便、快捷、准确的检测方式，从而达到对生物膜、沉积物、铁锈等腐蚀产物中的srb进行快速检测的目的，并在油田工业中推广应用。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于提供一种荧光探针、荧光探针试剂盒和硫酸盐还原菌的检测方法，以解决现有技术中的硫酸盐还原菌检测时间长、方法复杂的问题。
5.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种荧光探针，该荧光探针具有以下结构式i：
[0006][0007]
结构式i。
[0008]
根据本发明的另一方面，提供了一种荧光探针试剂盒，包括荧光探针，该荧光探针为上述的荧光探针。
[0009]
进一步地，上述试剂盒还包括载体和颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，颜色对照表中各颜色对应一个硫酸盐还原菌的菌量值或对应一个硫化氢的浓度值。
[0010]
根据本发明的另一方面，提供了一种硫酸盐还原菌的检测方法，该检测方法包括采用上述的荧光探针试剂盒对硫酸盐还原菌所处环境的腐蚀产物作为待检测物质进行检测。
[0011]
进一步地，上述荧光探针试剂盒中的荧光探针为游离态，检测方法包括：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；建立荧光探针在最大荧光强度荧光波长的响应值与硫化氢浓度的第二标准曲线；在密封空间中，对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，使释放的硫化氢与荧光探针进行反应得到反应体系，检测反应体系的最大荧光强度荧光波长的检测响应值；根据检测响应值和第二标准曲线确定待检测物质中硫化氢浓度；根据硫化氢浓度和第一标准曲线确定待检测物质所处环境中硫酸盐还原菌的菌量。
[0012]
进一步地，上述最大荧光强度荧光波长为460～470nm。
[0013]
进一步地，上述试剂盒包括荧光探针、载体和第一颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，第一颜色对照表中各颜色对应一个硫酸盐还原菌的菌量值，检测方法包括：设定以待检测物质为中心的、半径0～10cm的空间为测试区域，测试区域设置在密封空间中；将荧光探针试纸设置在测试区域中；对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，第一预定时间后荧光探针试纸在响应荧光下变色，优选第一预定时间为0～1min；将变色的荧光探针试纸的颜色和第一颜色对照表进行对照，确定硫酸盐还原菌的菌量值。
[0014]
进一步地，上述检测方法还包括制作第一颜色对照表的过程：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；检测不同硫化氢浓度亲核取代后荧光探针的颜色，建立颜色与硫化氢浓度的对应关系；根据第一标准曲线、颜色与硫化氢浓度的对应关系建立硫酸盐还原菌的菌量与颜色的一一对应关系，进而制作第一颜色对照表。
[0015]
进一步地，上述试剂盒包括荧光探针、载体和第二颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，第二颜色对照表中各颜色对应一个硫化氢的浓度值，检测方法包括：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；设定以待检测物质为中心的、半
径0～10cm的空间为测试区域，测试区域设置在密封空间中；将荧光探针试纸设置在测试区域中；对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，第二预定时间后荧光探针试纸在响应荧光下变色，优选第二预定时间为0～1min；将变色的荧光探针试纸的颜色和第二颜色对照表进行对照，确定待检测物中硫化氢的浓度值；根据待检测物中硫化氢的浓度值和第一标准曲线，确定待检测物质所处环境中硫酸盐还原菌的菌量。
[0016]
进一步地，上述检测方法还包括制作第二颜色对照表的过程：检测不同硫化氢浓度亲核取代后荧光探针的颜色，建立颜色与硫化氢浓度的对应关系建立硫化氢浓度与颜色的一一对应关系，进而制作第二颜色对照表。
[0017]
进一步地，上述响应荧光的波长为460～470nm。
[0018]
应用本发明的技术方案，利用二价硫负离子取代荧光探针中荧光分子，进而使金属离子与荧光分子分离，荧光分子重新表现出荧光特性。而且，经过试验证明，在进一步利用硫化氢(或者说hs-)提供二价硫负离子与荧光探针进行亲核取代时，荧光分子的最大荧光强度与硫化氢浓度呈线性关系，进而可以表征硫化氢的浓度。而上述现有检测方法已经证明，硫化氢的浓度和硫酸盐还原菌的菌含量呈线性关系，进而可以利用上述荧光分子制作荧光探针来检测硫酸盐还原菌的菌含量。以上述荧光探针为基础检测硫酸盐还原菌的方法，不需要对硫酸盐还原菌进行扩大培养，可以对待检测物质进行实施检测，且操作简便。
附图说明
[0019]
构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020]
图1示出了根据本发明的实施例1的l2cu的合成流程图；
[0021]
图2示出了根据本发明的实施例1的产物2和l2cu的荧光光谱图；
[0022]
图3示出了随着hs-浓度的增加l2cu的荧光光谱图；
[0023]
图4示出了荧光探针在最大荧光强度荧光波长的响应值与硫化氢浓度的标准曲线；以及
[0024]
图5示出了硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的标准曲线。
具体实施方式
[0025]
需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0026]
如本技术背景技术所分析的，现有技术中的液体培养法、固体培养法和血球计数法均耗时较长，操作复杂，为了解决该问题，本技术提供了一种荧光探针、荧光探针试剂盒和硫酸盐还原菌的检测方法。
[0027]
在本技术一种典型的实施方式中，提供了一种荧光探针，该荧光探针具有以下结构式i：
[0028][0029]
结构式i。
[0030]
上述荧光探针包含具有荧光特性的荧光分子：
[0031][0032]
利用二价硫负离子取代荧光探针中荧光分子，进而使金属离子与荧光分子分离，荧光分子重新表现出荧光特性。而且，经过试验证明，在进一步利用硫化氢(或者说hs-)提供二价硫负离子与荧光探针进行亲核取代时，荧光分子的最大荧光强度与硫化氢浓度呈线性关系，进而可以表征硫化氢的浓度。而上述现有检测方法已经证明，硫化氢的浓度和硫酸盐还原菌的菌含量呈线性关系，进而可以利用上述荧光分子制作荧光探针来检测硫酸盐还原菌的菌含量。以上述荧光探针为基础检测硫酸盐还原菌的方法，不需要对硫酸盐还原菌进行扩大培养，可以对待检测物质进行实施检测，且操作简便。
[0033]
在本技术另一种典型的实施方式中，提供了一种荧光探针试剂盒，包括荧光探针，该荧光探针为上述的荧光探针。将荧光探针作为试剂盒的形式，便于携带和使用，使用时，按照上述描述的原理可以制定适合现场的检测方法，进而实现对硫酸盐还原菌的快捷、简便检测。
[0034]
本技术的试剂盒可以为盛载有上述荧光探针的试剂瓶，即荧光探针以游离的方式单独存在。在一些实施例中，上述试剂盒还包括载体和颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，颜色对照表中各颜色对应一个硫酸盐还原菌的菌量值或对应一个硫化氢的浓度值。以便于在荧光探针试纸在待检测物质的作用下荧光变色后与颜色对照表进行直接对照，进而快速确定菌量值和硫化氢的浓度值，如果是确定了硫化氢的浓度值，可以根据本领域已经确定的硫化氢的浓度值和硫酸盐还原菌的菌量值之间的线性关系直接确定对应的硫酸盐还原菌的菌量。
[0035]
在本技术又一种典型的实施方式中，提供了一种硫酸盐还原菌的检测方法，该检测方法包括采用上述的荧光探针试剂盒对硫酸盐还原菌所处环境的腐蚀产物作为待检测物质进行检测。将荧光探针作为试剂盒的形式，便于携带和使用，使用时，按照上述描述的原理可以制定适合现场的检测方法，进而实现对硫酸盐还原菌的快捷、简便检测。
[0036]
在一些实施例中，当荧光探针试剂盒中的荧光探针为游离态，上述检测方法可以包括：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；建立荧光探针在最大荧光强度荧光波长的响应值与硫化氢浓度的第二标准曲线；在密封空间中，对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，使释放的硫化氢与荧光探针进行反应得到反应体系，检测反应体系的最大荧光强度荧光波长的检测响应值；根据检测响应值和第二标准曲线确定待检测物质中硫化氢浓度；根据硫化氢浓度和第一标准曲线确定待检测物质所处环境中硫酸盐还原菌的菌量。
[0037]
上述检测方法中，建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线的过程可以参考现有技术，在没有数据基础时利用液体培养法、固体培养法或血球计数法建立上述第一标准曲线，该检测过程虽然同现有技术相同，建立曲线的时间较长，但是并不是每次检测都需要建立一条第一标准曲线；也可以根据已有的数据库建立该第一标准曲线，第一标准曲线建立后可以重复使用，因此，整体来看，本技术的检测方法是可以大大节约检测时间；同理，第二标准曲线建立后也是可以保存反复使用的。然后，在密封空间中对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，使释放的硫化氢与荧光探针进行反应得到反应体系；反应完成后检测反应体系的最大荧光强度荧光波长的检测响应值；根据检测响应值和第二标准曲线确定待检测物质中硫化氢浓度；根据硫化氢浓度和第一标准曲线确定待检测物质所处环境中硫酸盐还原菌的菌量，该过程由于两条标准曲线均可以提前建立或者根据已有数据库建立，后续在测得反应体系的最大荧光强度荧光波长的检测响应值后，直接根据标准曲线即可查找对应的菌量，检测简便快捷。
[0038]
为了提高检测的灵敏性和准确性，优选上述最大荧光强度荧光波长为460～470nm，比如460nm、461nm、462nm、463nm、464nm、464.5nm、465nm、465.5nm、466nm、466.5nm、467nm、467.5nm、468nm、469nm、470nm。
[0039]
在本技术另一些实施例中，上述试剂盒包括荧光探针、载体和第一颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，第一颜色对照表中各颜色对应一个硫酸盐还原菌的菌量值，此时该检测方法可以包括：设定以待检测物质为中心的、半径为0～10cm的空间为测试区域，测试区域设置在密封空间中；将荧光探针试纸设置在测试区域中；对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，第一预定时间后荧光探针试纸在响应荧光下变色，优选第一预定时间为0～1min；将变色的荧光探针试纸的颜色和第一颜色对照表进行对照，确定硫酸盐还原菌的菌量值。
[0040]
在有上述颜色对照表的基础上，直接将变色的荧光探针试纸的颜色和第一颜色对照表进行对照，即可确定硫酸盐还原菌的菌量，更加方便快捷。
[0041]
在一些实施例中，上述检测方法还包括制作第一颜色对照表的过程：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；检测不同硫化氢浓度亲核取代后荧光探针的颜色，建立颜色与硫化氢浓度的对应关系；根据第一标准曲线、颜色与硫化氢浓度的对应关系建立硫酸盐还原菌的菌量与颜色的一一对应关系，进而制作第一颜色对照表。
[0042]
如前所述，在利用硫化氢提供二价硫负离子与荧光探针进行亲核取代时，荧光分子的最大荧光强度与硫化氢浓度呈线性关系，进而可以表征硫化氢的浓度。而上述现有检测方法已经证明，硫化氢的浓度和硫酸盐还原菌的菌含量呈线性关系，进而可以利用上述荧光分子制作荧光探针来检测硫酸盐还原菌的菌含量。而且不同浓度亲核取代后的荧光探
针随着硫化氢浓度的提高探针颜色逐步变为深蓝色，因此，本领域技术人员可以建立荧光颜色和硫酸盐还原菌的对应关系，进而制作颜色对照表。
[0043]
在本技术的一些实施例中，上述试剂盒包括荧光探针、载体和第二颜色对照表，荧光探针负载在载体形成荧光探针试纸，第二颜色对照表中各颜色对应一个硫化氢的浓度值，此时该检测方法可以包括：建立硫酸盐还原菌的菌量和硫化氢浓度的第一标准曲线；设定以待检测物质为中心的、半径为0～10cm的空间为测试区域，测试区域设置在密封空间中；将荧光探针试纸设置在测试区域中；对待检测物质进行酸洗以使其释放硫化氢，第二预定时间后荧光探针试纸在响应荧光下变色，优选第二预定时间为0～1min；将变色的荧光探针试纸的颜色和第二颜色对照表进行对照，确定待检测物中硫化氢的浓度值；根据待检测物中硫化氢的浓度值和第一标准曲线，确定待检测物质所处环境中硫酸盐还原菌的菌量。
[0044]
在有上述第二颜色对照表的基础上，直接将变色的荧光探针试纸的颜色和颜色对照表进行对照，即可确定硫化氢的浓度，在根据第一标准曲线即可得到硫酸盐还原菌的菌量，方便快捷。
[0045]
在一些实施例中，上述检测方法还包括制作第二颜色对照表的过程：检测不同硫化氢浓度亲核取代后荧光探针的颜色，建立颜色与硫化氢浓度的对应关系建立硫化氢浓度与颜色的一一对应关系，进而制作第二颜色对照表。如前所述，在利用硫化氢提供二价硫负离子与荧光探针进行亲核取代时，荧光分子的最大荧光强度与硫化氢浓度呈线性关系，进而可以表征硫化氢的浓度。不同浓度亲核取代后的荧光探针的颜色不同，随着硫化氢浓度的提高探针颜色逐步变为深蓝色，因此，本领域技术人员可以建立荧光颜色和硫化氢浓度值的对应关系，进而制作颜色对照表。
[0046]
上述响应荧光选择本技术的荧光探针可以产生荧光的具有最大荧光强度的波长范围内的荧光，比如优选上述响应荧光的波长为460～470nm，比如460nm、461nm、462nm、463nm、464nm、464.5nm、465nm、465.5nm、466nm、466.5nm、467nm、467.5nm、468nm、469nm、470nm。
[0047]
以下将结合实施例和对比例进一步说明本技术的有益效果。
[0048]
实施例1
[0049]
将3mmol的1,8-萘二甲酸酐(na)溶于30ml dmf中，加热回流至na完全溶解，加入4mmol水合肼，升温至110℃回流约1～2h，将反应后的混合物倒入水中抽滤并用蒸馏水冲洗滤饼，真空干燥得产物1，收率为92％。
[0050]
称取1.2mmol产物1溶于20ml dmf中，滴加3ml溶有水杨醛的乙醇溶液(其中水杨醛2ml，乙醇1ml)，110℃下回流1～1.5h，将反应后的混合物倒入水中抽滤，真空干燥后得到固体产物2，收率为88％。
[0051]
称取1mmol产物2溶于15ml dmf中，滴加溶解有0.5mol cucl2和0.5ml三乙胺的乙醇溶液4ml，70℃下回流1～1.5h，将反应后的混合物倒入水中抽滤，干燥后得固体产物即所需配合物l2cu，收率为88％。
[0052]
l2cu的合成流程图如图1所示。
[0053]
l2cu作为h2s荧光探针，na荧光分子具有荧光特性，而与cucl2结合会进行能量的转移，从而导致荧光被淬灭，使其荧光特性弱化或消失。而加入h2s后，由于h2s具有的强亲核性，能与l2cu发生亲核取代反应，加之铜离子的显色反应，从而使其具有强烈的荧光特征，
上述过程合成了荧光增强型的h2s荧光探针。产物2和l2cu的荧光发射光谱见图2。通过上述实施例1形成配合物的过程可以看出，随着cucl2滴加量增加，荧光强度减弱，且当产物2和氯化铜的摩尔比为2:1时，荧光效果淬灭，说明l2cu的上述结构式的正确性。
[0054]
对比例1
[0055]
称取1mmol产物2溶于15ml dmf中，滴加溶解有0.4mol zncl2和0.5ml三乙胺的乙醇溶液4ml，70℃下回流1～1.5h，将反应后的混合物倒入水中抽滤，干燥后得固体产物即所需配合物l2zn，收率为64％。
[0056]
na荧光分子具有荧光特性，在与zncl2结合也会进行能量的转移，从而导致荧光被淬灭，荧光特性弱化或消失。加入h2s后，由于h2s具有的强亲核性，能与l2zn发生亲核取代反应。但是由于锌离子无色，荧光不是太明显，因此将其作为荧光探针进行硫酸盐还原菌的检测时，检测结果不灵敏。
[0057]
检测过程：
[0058]
荧光探针对硫化氢的检测
[0059]
配制浓度为5mol/l的l2cu溶液，取浓度为5mol/l的nahs水溶液加入至等体积浓度的l2cu溶液中，摇匀待反应充分后，去上层液体测定溶液在300～800nm处的荧光激发、荧光发射光谱。荧光检测硫化氢测试结果见图3，可以看出l2cu中加入nahs后在466nm处有最大发射波长，强度增强了两倍。随着nahs的加入，荧光能量明显变化，说明荧光探针能有效检测h2s。图3中随着hs-浓度的增加，在荧光光谱中可以看到肩峰。在466nm处溶液荧光光谱最大荧光强度与hs-浓度成线性关系，回归方程为y＝0.0541x-0.0490，标准曲线见图4。对比荧光探针中加入h2s后的颜色变化，探针颜色从无色逐步变为深蓝色。
[0060]
菌量与硫化氢定量关系测试
[0061]
将接种有srb的培养液置于恒温培养箱中培养不同时间，通过传统液体培养方法测试出不同菌量条件下瓶子中的硫化氢含量，并做出标准曲线，如图5所示，由此可知不同菌量条件下srb产生的硫化氢。
[0062]
采用实施例1的荧光探针试纸测试腐蚀产物中菌量：
[0063]
将荧光探针负载在滤纸上，制作成类ph试纸型，可方便携带、快捷检测，根据图4和图5的标准曲线，确定不同颜色对应的srb的菌量，建立颜色对照表。
[0064]
取胜利油田的管道钢中腐蚀产物取至密封箱中，将酸洗喷雾作用于腐蚀产物上(酸洗喷雾成分为：每25ml浓盐酸中加入0.5g的sb2o3和50g的sncl2)，将负载有荧光探针的检测试纸贴近腐蚀产物测量(二者相距约5cm)，20秒左右通过颜色深浅对比可以直接读出菌量数值为106个/ml。
[0065]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。