检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用与流程

专利检索2022-05-11  6



1.本发明涉及生物检测技术领域,进一步地说,是涉及一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用。


背景技术:

2.传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,ihhnv)为单链dna病毒,其基因组序列大小为4.1kb左右,病毒粒子的大小仅仅为20-22nm,为二十面的球状类结构。
3.ihhnv,在二十世纪八十年代初首次发现于美国一个养殖场内,最早爆发在于细角滨对虾中(litopenaeus stylirosiris),随后在美洲和亚洲的养殖对虾中也有发现,ihhnv几乎可以对所有的对虾造成感染。ihhnv最敏感宿主是红额角对虾,能够对其造成高的致病率和死亡率(90%),还可以使斑节对虾以及凡纳滨对虾等出现“矮小残缺综合症”(runt-deformity syndrome,rds)。
4.ihhnv主要感染神经索、前后肠上皮细胞、表皮、鳃以及中胚层器官如横纹肌的细胞核、结缔组织、淋巴器官、性腺、触角腺和外胚层组织如神经节等,病情严重时通常是由于内胚层器官如肝胰腺和肠等也受到了感染。
5.ihhnv能够导致红额角对虾出现急性感染的症状,患病对虾行为异常,虾体翻转静卧水底或慢浮水面,其腹部朝上,并且不断重复该行为,直至被其它虾吞食攻击。病虾活力减弱,不能敏锐的感受外界刺激,通常于脱壳时或刚刚脱壳后死亡,病虾表皮上皮尤其是甲壳腹部出现淡黄色或者白色的斑点,继而该斑点会慢慢消失,其中斑节对虾与细角滨对虾濒临死亡时虾体颜色呈现为蓝色,肌肉发白,肠道空肠,细胞核肿大,且细胞核内出现包涵体,感染后未死亡的虾常常静卧不动,在恢复后急性期内仍然不可以正常生长摄食,而且,不能够很好的应对不良环境,在附肢与鳃出现黑斑,不能和正常虾一样按时的蜕壳,ihhnv还能够使日本囊对虾、斑节对虾和凡纳滨对虾呈现“矮小残缺综合症”(rds),患病虾吻部和角质层出现畸形、永久不能长大等,大大降低养殖产量,造成巨大的经济损失。
6.现有的ihhnv检测方法包括组织病理学法、酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay,elisa)、荧光定量pcr检测技术、组织学、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,lamp)、普通pcr等,以上几种技术均可以实现在样品中的检测。
7.但现有的ihhnv检测技术检测主要是通过pcr方法,但是该方法对仪器的依赖性太大,同时耗时长,不利于现场快速检测。
8.因此,若能开发建立一种简便的检测ihhnv的方法具有重要的意义。


技术实现要素:

9.为解决现有技术中出现的问题,本发明提出了一种用于检测对虾传染性皮下及造
血组织坏死病毒的引物对、扩增试剂、试剂盒、检测方法和应用,可以明显缩短对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测时间;同时检测环节操作更加简单,灵敏度高和特异性更好。满足快速检测及使用方便的试剂需求。
10.本发明的目的之一是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对,所述引物对由引物ihhnv-f和ihhnv-r组成,
11.所述ihhnv-f为seq id no.1所示的单链dna分子;
12.所述ihhnv-r为seq id no.2所示的单链dna分子;
13.ihhnv-f:cttcaccattacagatcatggtgaccactggca(seq id no.1)
14.ihhnv-r:caagagatggatactctatcttatcagatacg(seq id no.2)
15.本发明的目的之二是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂,所述扩增试剂含有权利要求1所述引物对。
16.优选的,所述扩增试剂还包括荧光探针ihhnv-p,所述荧光探针ihhnv-p如seq id no.3所示。
17.所述荧光探针ehp-p如下:
[0018]5’‑
accaataagaccagacatagagctacaatcctchcctatttgggagttac-3’(seq id no.3)
[0019]
其中,32位碱基t标记荧光基团(fam-dt),34位碱基h表示四氢呋喃连接子(thf),37位碱基t标记荧光淬灭基团bhq1-dt,3'末端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团(如c3-spacer),在rpa体系中引入带荧光标记的探针,配合相应扩增引物,可以有效提高rpa检测的特异性。
[0020]
优选的,所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
[0021]
本发明的目的之三是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂盒,所述扩增试剂盒含有本发明的目的之一的引物对,或本发明的目的之二的扩增试剂。
[0022]
优选的,所述试剂盒还含有酶混合液;所述酶混合液中包括重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶。
[0023]
优选的,所述酶混合液中包括t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs x和uvs y、单链结合蛋白gp32和bsu dna聚合酶。
[0024]
优选的,所述扩增试剂盒中,所述引物ihhnv-f的浓度为0.44μmol/l;所述引物ihhnv-r的浓度为0.44μmol/l;所述探针ihhnv-p的浓度为0.2μmol/l。
[0025]
本发明的目的之四是提供一种本发明的目的之一的引物对或本发明的目的之二的扩增试剂或本发明的目的之三的扩增试剂盒在对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测中的应用。
[0026]
本发明的目的之五是提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的rpa检测方法,采用本发明的目的之三的扩增试剂盒进行检测,包括如下步骤:
[0027]
1)提取待测对虾的dna;
[0028]
2)以该dna为模板,采用所述引物对和荧光探针进行rpa扩增,在扩增过程中用荧光检测装置同时检测反应体系荧光信号变化,根据荧光信号变化的时间和强度对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒进行定性和定量检测。
[0029]
优选的,所述rpa扩增的条件为37~41℃,反应15~50min。
[0030]
优选的,所述rpa扩增的条件为37℃,反应30min。
[0031]
发明原理
[0032]
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase poly-merase amplification,rpa)是恒温核酸扩增技术的一种,rpa利用t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvs x和uvs y、单链结合蛋白gp32和bsu dna聚合酶三种酶在37~42℃对目标片段进行等温扩增,可以在20~40min完成数十亿的dna拷贝。rpa与荧光探针相结合,向反应体系中加入特异性的特定类型探针,可以达到实时荧光检测。进行检测时应用twistamp exo探针,此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭剂,分别与一个胸腺嘧啶结合,中间由一个四氢呋喃(thf)碱基隔开,当此结构完整时,荧光强度低。探针的3'端予以封闭,阻断以此寡核苷酸序列充当引物进行扩增。当探针与靶序列结合时,连接荧光基团和淬灭基团的thf碱基位点就会被核酸内切酶识别并酶解,下游的淬灭基团被释放,荧光强度增强;酶切后产生的游3'-oh作为dna聚合酶的靶点并扩增此探针,荧光强度也会随着其扩增而增强,检测时间也大大缩短。
[0033]
有益效果
[0034]
现有主流的检测方法是荧光定量pcr方法。荧光定量pcr方法需要使用荧光定量pcr仪,设备价格昂贵;设备需要使用220v交流电源,需要在实验室环境下使用,不利于在野外实施检测;同时荧光定量pcr方法需要循环升降温,检测时间比较长,一般需要1-1.5小时。
[0035]
本发明主要是建立一种简便的检测ihhnv的方法,在单一的温度下(恒温)就可以完成检测,设备结构简单,成本更低,更适合畜牧,水产类对成本敏感的客户使用。
[0036]
本发明不需要使用复杂的设备,使用的仪器结构简单,能耗更低,适合在野外开展检测,如在养殖场现场即可以检测,有实际的使用需求。
[0037]
本发明的检测时间更短,一般情况下15-30分钟左右能够完成一次检测。
附图说明
[0038]
图1为ihhnv荧光rpa检测体系的灵敏度评价结果;
[0039]
图2为ihhnv荧光rpa检测体系检测临床样本的测试结果。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体附图及实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
[0041]
本发明的一个具体实施方式中,是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的引物对,所述引物对由引物ihhnv-f和ihhnv-r组成,
[0042]
所述ihhnv-f为seq id no.1所示的单链dna分子;
[0043]
所述ihhnv-r为seq id no.2所示的单链dna分子;
[0044]
本发明的又一个具体实施方式中,是提供一种用于检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的扩增试剂,所述扩增试剂含有权利要求1所述引物对。
[0045]
优选的,所述扩增试剂还包括荧光探针ihhnv-p,所述荧光探针ihhnv-p如seq id no.3所示。
[0046]
优选的,所述扩增试剂还包括缓冲液、醋酸镁和无菌水。
[0047]
实施例1
[0048]
原料来源:
[0049]
引物、探针设计后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成制备;
[0050]
rpa反应液和rpa冻干粉采购自英国twistdx inc公司。
[0051]
rpa冻干粉中包括重组酶蛋白uvs x和uvs y、单链结合蛋白gp32和bsu dna聚合酶三种酶。
[0052]
对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒荧光rpa检测试剂盒及方法的建立:
[0053]
1、引物探针的设计及制备
[0054]
根据af218266.2,ef633688.1,ay355307.1的非结构蛋白1、非结构蛋白2区基因序列进行比对分析,确定保守的扩展区序列,根据rpa引物探针设计原则,设计引物探针。引物探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。设计引物对和探针如表1所示:
[0055]
表1引物对和探针
[0056][0057]
2、样本:由本实验室保存的患传染性皮下和造血器官坏死病的南美白对虾阳性样品。
[0058]
3、基因组dna提取
[0059]
所有组织样本,先经过研磨、离心后取上清提取基因组dna。采用dneasy blood and tissue kit(qiagen,德国)提取试剂盒,按照试剂盒说明书进行操作。
[0060]
4、检测方法的建立
[0061]
按照以下组成和组分用量建立荧光rpa反应体系,其中:
[0062]
[0063]
混匀后瞬时离心后上机检测。
[0064]
在购买的twist dx试剂盒中进行检测,测试温度在37-41℃,分别测试了37℃,38℃,39℃,40℃,41℃不同反应温度,并且将检测时间设置为30分钟,结果显示在37℃是检测结果最好。
[0065]
在确定37℃扩增温度后,我们测试了5分钟,10分钟,15分钟,20分钟,25分钟,30分钟,35分钟,40分钟,45分钟,50分钟的检测,结果表明,在30分钟是能是最合适的检测时间。
[0066]
确定最优条件为:扩增反应设定温度在37℃的检测仪中进行,反应检测时间设定为30分钟,每分钟检测一次荧光信号,荧光信号检测通道设置为fam。检测结束后对结果进行分析。
[0067]
实施例2
[0068]
ihhnv荧光rpa检测的灵敏度评价
[0069]
用ihhnv标准物质(初始浓度为12.5ng/ul)进行3倍倍比稀释,选取9倍,243倍,2187倍浓度的样本进行检测,同时用ddh2o作为阴性对照。结果如图1所示,9倍,243倍浓度的样本检测结果为阳性,2187倍浓度的样本和ddh2o的检测结果为阴性。
[0070]
为测试检测方法的准确性,及临床应用有效性,用该方法和荧光pcr方法对一批临床样本进行检测。ihhnv荧光rpa检测体系的扩增结果见图2,检测临床样本结果与荧光pcr的对比图见下表2。
[0071]
表2ihhnv荧光rpa临床样本结果和荧光pcr临床样本结果的对比
[0072][0073]
从图2和表2中可以看出,综上所述,本发明涉及的试剂盒可以快速检测虾传染性皮下及造血组织坏死病毒,且该方法简单、快速,检测结果和荧光pcr法相当。
[0074]
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