使用曲美替尼和标志物治疗神经退化性疾病的给药方法和剂量方案与流程

1.本发明涉及一种使用曲美替尼治疗神经退化性疾病的给药方法和剂量方案。本发明还包括一种治疗神经退化性疾病或与溶酶体功能障碍、自噬潮、神经损伤、髓鞘损伤或神经纤维脱髓鞘有关的其他疾病的方法，其使用曲美替尼和一种或更多种标志物，其水平通过给药曲美替尼而改变。


背景技术：

2.诸如阿尔茨海默病(alzheimer's disease：ad)和帕金森病(parkinson's disease：pd)等的神经退化性疾病在老年人人口中普遍存在，并且随着社会老龄化，患者数量迅速增加。此外，关于早发性神经退化性疾病的报道并不少见。因此，人们对开发有助于阻止疾病进展的治疗方法和恢复受损脑组织的治疗方法非常感兴趣。
3.此类神经退化性疾病的确切原因尚未确定。据目前所知，大脑中特定位置(例如，海马体或黑质)的神经元细胞受损，导致数量减少的神经元之间的神经网络出现缺陷，从而导致神经退化性疾病的各种症状。
4.已经在各个领域进行了研究以寻找治疗方法。尽管一些药物已被批准用于缓解与阿尔茨海默病、帕金森病和其他神经退化性疾病的疾病相关的症状，但这些药物仅限于短期效果，并且与副作用有关没有受损的脑组织得到修复或恢复。最近，曲美替尼(snr1611，)被证明能有效诱导神经元分化并促进神经元和神经干细胞(nscs)的存活，即使在体外存在aβ1‑
42
的细胞毒性寡聚体的情况下，如美国授权前公开号2018/0169102中所述，并且通过引用整体并入本文。因此，已经提出给药曲美替尼和其他mek 1/2抑制剂为一种保护神经元免受神经元丢失或损伤并诱导神经发生的方法，从而治疗神经退化性疾病的症状并恢复由此损伤的脑组织。
5.mek 1/2抑制剂被设计用作抗癌剂，并且对这些药物的大量研究一直用于治疗癌症。对于mek 1/2抑制剂在神经退化性疾病中的治疗用途，尤其是对老年患者的给药，需要开发引起对神经退化性疾病的有效治疗和可接受的副作用的合适的给药方法和剂量方案。


技术实现要素：

技术问题
6.本公开内容依赖于以下发现：给药有效量的曲美替尼超过四周可诱导与神经再生相关的遗传、结构和功能变化，并使在阿尔茨海默病(ad)动物模型的脑中分化的神经元样细胞能够存活。由于曲美替尼靶向促进退化脑神经元功能恢复的多种通路，这些数据预测每天给药有效量的曲美替尼至少四周可逆转与神经退化性疾病相关的功能缺陷，并可用于治疗ad以及其他神经退化性疾病。技术方案
7.因此，在第一方面，提供通过每天给药曲美替尼至少四周来治疗神经退化性疾病
(例如，ad)的方法。
8.在一些实施例中，所述方法包括对诊断患有神经退化性疾病的患者每天给药曲美替尼至少四周的步骤。
9.在一些实施例中，给药曲美替尼至少五周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少六周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少七周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少八周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少九周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少三个月。
10.在一些实施例中，曲美替尼以每天口服剂量给药，所述每天口服剂量有效诱导患者大脑或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平在给药至少四周后与给药曲美替尼前相比发生至少1.3倍的变化。在一些实施例中，所述每天口服剂量有效诱导患者大脑或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平发生至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍的变化。
11.在一些实施例中，曲美替尼以每天口服剂量给药，所述每天口服剂量有效使患者大脑或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平在给药至少四周后与给药曲美替尼前相比降低至少20％。在一些实施例中，所述每天口服剂量有效使患者大脑或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
12.在一实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcx d3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。所述小鼠基因的人类同源物可以是gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl6、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap1
‑
gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。
13.在一些实施例中，所述一种或更多种标志物是与溶酶体活性相关的蛋白质。在一些实施例中，所述与溶酶体活性相关的蛋白质是糖基水解酶或蛋白酶。在一些实施例中，所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
14.在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.25ng/g的平均峰值曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.5ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.75ng/g的
平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少1ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少1.5ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少2ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少5ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少10ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少15ng/g的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供介于0.25和20ng/g之间的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供介于0.25和5ng/g之间的平均峰值脑中曲美替尼浓度(c
max
)的剂量给药。
15.在一些实施例中，曲美替尼以0.5和2mg/天之间的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.5且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于1且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75且小于1.25mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以0.5mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1.5mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以片剂给药。
16.在一些实施例中，所述患者没有braf v600e或v600k突变。在一些实施例中，所述患者没有癌症。
17.在一些实施例中，所述神经退化性疾病选自：阿尔茨海默病(ad；alzheimer's disease)、轻度认知障碍(mci；mild cognitive impairment)、痴呆、血管性痴呆、老年性痴呆、额颞痴呆(ftd；frontotemporal dimentia)、路易体痴呆(lbd；lewy body dimentia)、帕金森病(pd；parkinson's disease)、多系统萎缩(msa；multiple system atrophy)、皮质基底节变性(cbd；corticobasal degeneration)、进行性核上性麻痹(psp；progressive supranuclear palsy)、亨廷顿病(hd；huntington's disease)、肌萎缩侧索硬化(als，葛雷克氏症(lou
‑
gehrig's disease))、原发性侧索硬化(pls；primary lateral sclerosis)、进行性延髓麻痹(pbp；progressive bulbar palsy)、进行性肌萎缩(pma；progressive muscular atrophy)、假性球麻痹、遗传性痉挛性截瘫(hsp；hereditary spastic paraplegia)、小脑共济失调、克雅氏病(cjd；creutzfeldt
‑
jakob disease)、多发性硬化(ms；multiple sclerosis)和吉兰
‑
巴雷综合症(gbs；guillian
‑
barre syndrome)。在一些实施例中，所述神经退化性疾病是阿尔茨海默病(ad)。
18.在一些实施例中，所述方法进一步包括检测从所述患者获得的样品中的一种或更多种标志物的水平的步骤。在一实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、
rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。
19.在一些实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个是与溶酶体活性相关的蛋白质。在一些实施例中，所述与溶酶体活性相关的蛋白质是糖基水解酶或蛋白酶。在一些实施例中，所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
20.在一些实施例中，所述样品在所述给药曲美替尼的步骤之后获得。在一些实施例中，所述样品在所述给药曲美替尼的步骤之后的多个时间点获得。在一些实施例中，所述方法还包括获得所述样品的步骤。在一些实施例中，所述方法进一步包括在所述给药曲美替尼的步骤之前检测从所述患者获得的对照样品中的一种或更多种标志物的水平的步骤。在一些实施例中，所述方法还包括获得所述对照样品的步骤。在一些实施例中，所述样品通过脑活检获得。在一些实施中，所述样品是从包括体液、身体组织、细胞、分泌物或其他来源的个体获得的任何生物样品。在一些实施中，体液或分泌物包括血液、尿液、唾液、粪便、胸水、淋巴液、痰、腹水、前列腺液、脑脊髓液(csf；cerebrospinal fluid)或任何其他身体分泌物或其衍生物。在一些实施中，血液选自全血、血浆、血清、外周血单核细胞(pbmc；peripheral blood mononuclear cells)或血液的任何成分。
21.在一些实施中，所述方法进一步包括基于所述一种或更多种标志物的水平的变化确定给药所述患者的曲美替尼的治疗功效的步骤。在一些实施中，所述方法进一步包括确定随后给药曲美替尼的持续时间或剂量的步骤。在一些实施中，所述方法进一步包括基于所确定的治疗功效中止给药曲美替尼的步骤。在一些实施中，所述方法进一步包括基于所确定的治疗功效继续给药曲美替尼的步骤。在一些实施中，所述方法进一步包括基于所确定的治疗功效调整给药曲美替尼的步骤。在一些实施中，所述方法进一步包括：(a)检测在给药曲美替尼后从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平、(b)将在(a)中检测到的水平与在给药曲美替尼之前从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平进行比较或(c)将在(a)中检测到的水平与从没有感兴趣的疾病的健康对象获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平进行比较。
22.在另一方面，本发明公开了一种增强靶组织中溶酶体活性的方法，其包括向对象给药美替尼的步骤，其中，所述对象被诊断患有与溶酶体功能障碍或自噬潮相关的疾病。
23.在一些实施例中，所述疾病选自:溶酶体贮积病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑萎缩症、眼咽型肌营养不良、朊病毒疾病、致命性家族性失眠症、α
‑
1抗胰蛋白酶缺乏、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、x连锁脊髓延髓肌萎缩症、神经元核内透明包涵体病、多发性硬化、青光眼和年龄相关性黄斑变性。
24.在一些实施例中，所述溶酶体贮积病选自：甘露糖苷贮积症、天冬氨酰氨基葡糖尿、幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(jncl，幼年巴顿并(juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis)或cln3病)、胱氨酸病、法布里病、戈谢病ⅰ、ⅱ和ⅲ型、糖原贮积症ii型(庞贝氏症)、gm2
‑
神经节苷脂贮积病ⅱ型(山德霍夫氏病)、异染性脑蛋白质营养不良、黏脂病ⅰ、ⅱ/ⅲ和ⅳ型、粘多糖贮积病(贺勒氏疾病及其变种、亨特氏病、sanfilippo a、b、c和d综合征、莫尔基奥a和b综合征、maroteaux
‑
lamy和sly综合征)、尼曼
‑
匹克病a/b、c1和c2型以
及辛德勒病i和ii型。
25.在一方面，本公开提供了一种在靶组织中诱导轴突新生的方法，其包括向对象给药曲美替尼的步骤，其中，所述对象被诊断患有与神经元损伤相关的疾病。
26.在一些实施例中，所述疾病选自：青光眼、中风、头部外伤、脊髓损伤、视神经损伤、局部缺血、缺氧、神经退化性疾病、多发性硬化和多系统萎缩。在一些实施例中，所述疾病选自：糖尿病神经病变；病毒相关的神经病变；获得性艾滋病(aids；acquired immunodeficiency syndrome)相关的神经病变；传染性单核细胞增多症伴多发性神经炎；病毒性肝炎伴多发性神经炎；吉兰
‑
巴雷综合症；肉毒中毒相关的神经病变；包括铅和酒精相关的神经病变的中毒性多发性神经病变；包括亚急性联合变性的营养性神经病变；包括系统性红斑狼疮相关的神经病变的血管病性神经病变；结节病相关的神经病变；癌性神经病变；压迫性神经病变(例如，腕管综合症)；遗传性神经病变如腓骨肌萎缩症；以及与脊髓损伤相关的周围神经损伤。
27.在一些实施例中，所述疾病是选自以下的眼外伤、眼疾病或视神经病变：中毒性弱视、视神经萎缩、高位视路病变、眼球运动障碍、第三脑神经麻痹、第四脑神经麻痹、第六脑神经麻痹、核间性眼肌麻痹、凝视麻痹、自由基对眼睛的伤害、缺血性视神经病变、中毒性视神经病变、眼缺血综合征、视神经炎症、视神经感染、视神经炎、视神经病变、视神经乳头水肿、视神经盘炎、球后视神经炎、视网膜震荡、青光眼、黄斑变性、视网膜色素变性、视网膜脱离、生牵拉性撕裂孔、糖尿病性视网膜病变、医源性的視網膜病變和视神经玻璃膜疣。
28.在一方面，本公开提供一种治疗与髓鞘损伤或神经纤维脱髓鞘相关的疾病的方法，其包括向对象给药曲美替尼的步骤，其中，所述对象被诊断患有与髓鞘损伤或神经纤维脱髓鞘相关的疾病。
29.在一些实施例中，所述疾病选自：多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、谢耳德氏病、巴娄氏病、临床孤立综合征、亚历山大病、卡纳万病、科凯恩综合征、佩梅病、视神经炎、视神经脊髓炎、htlv
‑
i相关性脊髓病、遗传性白质脑病、吉兰
‑
巴雷综合症、脑桥中央髓鞘溶解症、深部脑白质缺血、进行性多病灶脑白质病、脱髓鞘性hiv脑炎、脱髓鞘性放射损伤、获得性毒性代谢紊乱、可逆性后部脑病综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、krabbe球形细胞病和/或异染性脑蛋白质营养不良。其中发生脱髓鞘的其他疾病包括由颈椎狭窄引起的脊髓型颈椎病、脑或脊髓的创伤性损伤以及包括中风和新生儿缺氧性损伤的中枢神经系统的缺氧性损伤。
30.在上述方面的一些实施例中，给药曲美替尼至少四周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少五周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少六周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少七周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少八周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少九周。在一些实施例中，给药曲美替尼至少三个月。
31.在一些实施例中，曲美替尼以每天口服剂量给药，所述每天口服剂量有效诱导患者靶组织或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平在给药至少四周后与给药曲美替尼前相比发生至少1.3倍的变化。在一些实施例中，所述每天口服剂量有效诱导患者靶组织或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平发生至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍的变化。
32.在一些实施例中，曲美替尼以每天口服剂量给药，所述每天口服剂量有效使患者靶组织或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平在给药曲美替尼后与给药前相比降低至少20％。在一些实施例中，所述每天口服剂量有效使患者靶组织或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
33.在一些实施例中，所述一种或更多种标志物由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
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1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。
34.在一些实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。优选地，所述蛋白酶是组织蛋白酶b。
35.在一些实施例中，给药曲美替尼在靶组织中提供至少0.25ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少0.5ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少0.75ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少1ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少1.5ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少2ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少5ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少10ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为至少15ng/g。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为介于0.25和20ng/g之间。在一些实施例中，靶组织中的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)为介于0.25和5ng/g之间。
36.在一些实施例中，所述靶组织是脑。
37.在一些实施例中，曲美替尼以介于0.5和2mg/天之间的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.5且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于1且小于2mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75且小于1.25mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以0.5mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1.5mg/天的口服剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以2mg/天的口服剂量给药。
38.在另一方面，提供了包括曲美替尼的药物组合物用于上述方法。
39.本发明的另一方面提供了用于确定mek 1/2抑制剂例如曲美替尼对神经退化性疾病、与溶酶体功能障碍或自噬潮相关的疾病、与神经元损伤相关的疾病、或与髓鞘损伤或神
经纤维脱髓鞘相关的疾病的治疗功效的组合物，其包括与上述一种或更多种标志物特异性结合的探针或抗体。
40.在一些实施例中，所述mek抑制剂的治疗功效是通过比较在给药曲美替尼后从诊断患有所述疾病或病症的患者中获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平和(a)在开始给药曲美替尼之前从所述患者中获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平，或和(b)从没有所述疾病或病症的健康对象获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平确定的。
41.另一方面包括使用与上述一种或更多种标志物特异性结合的探针或抗体检测标志物水平以提供关于mek 1/2抑制剂例如曲美替尼对神经退化性疾病、与溶酶体功能障碍或自噬潮相关的疾病、与神经元损伤相关的疾病、或与髓鞘伤或神经纤维脱髓鞘相关的疾病的治疗功效的信息的方法。有益效果
42.本公开内容依赖于以下发现：给药有效量的曲美替尼超过四周可诱导与神经再生相关的遗传、结构和功能变化，并使在阿尔茨海默病(ad)动物模型的脑中分化的神经元样细胞能够存活。由于曲美替尼靶向促进退化脑神经元功能恢复的多种通路，这些数据预测每天给药有效量的曲美替尼至少四周可逆转与神经退化性疾病相关的功能缺陷，并可用于治疗ad以及其他神经退化性疾病。
附图说明
43.图1示出在小鼠中单次口服给药曲美替尼后曲美替尼在脑(顶部)和血浆(底部)的浓度
‑
时间曲线。
44.图2提供小鼠全脑裂解物中perks和erks的蛋白质印迹分析的代表性图像。erks被包括作为上样内参。
45.图3a和b示出从以时间依赖性方式给药曲美替尼的正常小鼠的脑裂解物分析中获得的数据。图3a和b以基因本体论术语追踪与大脑中每个时间点的生物过程相关的上调基因(图3a)和下调基因(图3b)。
46.图4a至c和4d至g示出与载体治疗组相比通过给药曲美替尼而表现显着的mrna表达水平变化的涉及突触活动、神经发生、溶酶体活动和自噬体活动的基因。图4d至g中的值代表与载体治疗组相比的曲美替尼治疗组的mrna表达水平的倍数变化(fc)。
47.图5a示出来自ca1记录电极的ltp记录中标准化的epsc斜率，其中，测量在tbs诱导(红色箭头)前的3分钟时的基线平衡和在wt
‑
载体(黑色圆圈；n＝6只小鼠的8个切片)、5xfad
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载体(蓝色方块；n＝3只小鼠的4个切片)和5xfad
‑
曲美替尼(红色三角形；n＝3只小鼠的6个切片)中的随后20分钟记录。每种类型的代表性epsc都显示为基线(浅色)和20分钟时的响应(鲜艳的颜色)。比例尺：20ms，100pa。图5b是比较从15.5分钟到20分钟的标准化epsc斜率的平均值的图表。
48.图6a示出在y
‑
迷宫测试中测量的3分钟内交替的平均比率。图6b提供在新奇物识别试验中测量和计算的3分钟内调查次数的平均比率。p值是通过方差分析(anova；analysis of variance)测试获得的。*p<0.05，在wt
‑
载体组(n＝5)、5xfad
‑
载体组(n＝4)和5xfad
‑
曲美替尼组(n＝5)之间。
49.图7提供八个月龄的5xfad小鼠的皮质层v中的神经突/轴突长度和肿胀轴突区域的免疫荧光染色图像和量化。对五个月龄的小鼠给药载体和0.1mg/kg/天的曲美替尼，持续3个月。来自每只小鼠的n＝3个矢状切面，每组n＝3只小鼠。标准化为wt
‑
载体组。比例尺，50μm。比例尺，50μm。p值通过t检验获得。*p<0.05、**p<0.005和***p<0.001在wt
‑
载体组和5xfad
‑
载体组之间。#p<0.05，##p<0.005和###p<0.001在5xfad
‑
载体组和5xfad
‑
曲美替尼组之间。
50.图8提供来自十三个月龄的5xfad小鼠的皮质层v中的神经突/轴突长度和肿胀轴突区域的免疫荧光染色图像和量化。对十二个月龄的5xfad小鼠给药载体和曲美替尼1个月。来自每只小鼠的n＝3个连续矢状切片，每组n＝3只小鼠。标准化为5xfad
‑
载体组比例尺，50μm。p值通过t检验获得。*p<0.05，**p<0.005和***p<0.001在5xfad
‑
载体组和5xfad
‑
曲美替尼组之间。
51.图9是来自图7的小鼠的脑皮质裂解物的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。
52.图10是来自图8的小鼠的脑皮质裂解物的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。
53.图11a和b提供显示由曲美替尼(snr1611)在原代皮层神经元中引起的树突棘的变化的免疫荧光染色图像和量化。p值通过t检验获得。与对照组相比，*p<0.05，***p<0.001。与aβ
42
‑
处理组(n＝17)相比，###p<0.001。
54.图12是小鼠脑皮质裂解物的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。
55.图13a是sh
‑
sy5y细胞裂解物的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。图13b显示与未治疗的对照组相比，用曲美替尼(tra)和/或aβ1‑
42
治疗的细胞中的lc3ii/lc3i(左)和成熟组织蛋白酶b(右)的量化。p值通过t检验获得。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.005。与
‑
aβ
42
处理组相比，###p<0.001(lc3ii/lc3i：n＝5，组织蛋白酶b：n＝6)。
56.图14a是原代皮层神经元的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。图14b示出与未治疗的对照相比，用曲美替尼(snr1611)和/或aβ1‑
42
治疗的神经元中成熟组织蛋白酶b的量化。p值通过t检验获得。与未处理的对照组相比，*p<0.05。与aβ
42
‑
处理组(n＝5)相比，#p<0.05。
57.图15a和b提供lc3、lamp1和溶酶体探针(lysotracker)的免疫荧光图像以及sh
‑
sy5y细胞中细胞的溶酶体探针色斑(puncta)的共染色比率和数量的量化。比例尺，10μm。p值通过t检验获得。*p<0.05、**p<0.005和***p<0.001在对照组与曲美替尼或对照与aβ1‑
42
之间。##p<0.005和###p<0.001在aβ1‑
42
与aβ1‑
42
/曲美替尼之间。
58.图16a和b是lc3、lamp1和溶酶体探针的免疫荧光图像(图16a)以及lc3和lamp1抗体染色的细胞比率的量化(图16b顶部)和原代皮层神经元中每个细胞的溶酶体探针色斑的数量(图16b底部)。比例尺，20μm。p值通过t检验获得。*p<0.05、**p<0.005和***p<0.001在对照组与曲美替尼或对照组与aβ1‑
42
之间。#p<0.05、##p<0.005和###p<0.001在aβ1‑
42
与aβ1‑
42
/曲美替尼之间。
59.图17a、b和c是sh
‑
sy5y细胞裂解物的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析。
60.图18a是原代皮层神经元的对指定蛋白质的代表性蛋白质印迹分析的图像。图18b和c示出与未治疗的对照组相比，用曲美替尼(snr1611)和/或aβ1‑
42
寡聚体治疗的神经元中
p
‑
mtor/mtor和p
‑
ulk1(s757)/ulk1的量化。p值通过t检验获得。与未治疗的对照组相比，*p<0.05。与aβ
42
‑
处理组相比，#p<0.05(图18b；n＝5，图18c；n＝4)。
61.图19提供皮质层v中凋亡细胞、lc3和lamp1的免疫荧光图像(左)和量化(右)。lc3/lamp1图中的箭头表示共染色区域。来自每只小鼠的n＝3个矢状切面，每组n＝3只小鼠。比例尺，10或50μm。p值通过t检验获得。#p<0.05和##p<0.005在5xfad
‑
载体组和5xfad
‑
曲美替尼组之间，***p<0.001在wt
‑
载体组和5xfad
‑
载体组之间。
62.图20a和b是在给药曲美替尼(snr0.05：曲美替尼0.05mg/kg/天，snr0.1：曲美替尼0.1mg/kg/天)和多奈哌齐后的八个月龄的5xfad小鼠(图20a)和十三个月龄的5xfad小鼠(图20b)的血浆中的组织蛋白酶b(ctsb)水平。p值通过t检验获得。与5xfad
‑
载体组相比，*p<0.05。
63.图21是来自成年tg2576小鼠的神经干细胞(nsc)中的aβ、活性半胱天冬酶3和tau蛋白质的免疫荧光染色图像。nsc在未分化或分化条件下用100nm的曲美替尼处理48小时。用于未分化的细胞培养基条件包含10ng/ml egf和10ng/ml bfgf。分化条件中排除了生长因子。比例尺，20μm。
64.图22a和b提供lamp1和lc3的免疫荧光图像以及来自成年tg2576小鼠的nsc中两种信号的合并(图22a)和合并图像的放大倍数(图22b)。nsc在未分化(“ud”)或分化(“d”)条件下用100nm的曲美替尼处理48小时。用于未分化的细胞培养基条件包含10ng/ml egf和10ng/ml bfgf。分化条件中排除了生长因子。黄色箭头表示lamp1和lc3的合并信号。白色箭头仅表示lamp1信号。
65.图23示出在给药曲美替尼(snr0.05：曲美替尼0.05mg/kg/天，snr0.1：曲美替尼0.1mg/kg/天)和多奈哌齐后的八个月龄的5xfad小鼠的皮质中的髓鞘碱性蛋白质(mbp)染色。
66.附图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施例。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到，在不脱离本文描述的本发明的原理的情况下，可以采用本文所示的结构和方法的替代实施例。
具体实施方式
67.1.定义
68.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，以下术语具有以下赋予它们的含义。
69.如本文所用，术语“mek 1/2抑制剂”是指抑制mek 1和mek 2两者功能的化合物。
70.示例性的mek 1/2抑制剂是曲美替尼(gsk
‑
1120212、gsk1120212、jtp74057或jtp
‑
74057)。曲美替尼的化学名称是乙酰胺，n
‑
[3
‑
[3
‑
环丙基
‑5‑
[(2
‑
氟
‑4‑
碘苯基)氨基]
‑
3,4,6,7
‑
四氢
‑
6,8
‑
二甲基
‑
2,4,7
‑
三氧代吡啶并[4,3
‑
d]嘧啶
‑
1(2h)
‑
基]苯基]。它的分子式为c
26
h
23
fin5o4，且分子量为615.39。曲美替尼具有式1的化学结构。
[0071][0072]
式1
[0073]
在市售产品中，曲美替尼呈二甲亚砜溶剂化物形式。在本文所述的发明中，曲美替尼可以以游离碱或药学上可接受的盐或溶剂化物的形式使用，包括二甲基亚砜溶剂化物。可能的溶剂化物的例子是水合物、二甲亚砜、乙酸、乙醇、硝基甲烷、氯苯、1
‑
戊醇、异丙醇、乙二醇、3
‑
甲基
‑1‑
丁醇等。
[0074]
如本文所用，术语“治疗有效剂量”或“有效量”是指产生所需效果的给药剂量或量。在本方法的上下文中，治疗有效量是有效治疗患有神经退化性疾病的对象的症状或改善其疾病状态的量。如本文所用，术语“足够量”是指足以产生所需效果的量。
[0075]
2.其他解释惯例
[0076]
此处所述的范围被理解为该范围内所有值的简写，包括所列举的端点。例如，1到50的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组的任何数字、数字组合或子范围。
[0077]
除非另有说明，提及具有一个或多个立体中心的化合物是指其每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。
[0078]
3.治疗神经退化性疾病的方法
[0079]
在第一方面，提出了用于治疗患有神经退化性疾病的患者的方法。所述方法包括每天对诊断出患有神经退化性疾病的患者给药曲美替尼至少四周。在一些实施例中，给药曲美替尼以在脑中提供至少0.25ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)。
[0080]
多种递送方法可用于在本文所述的方法中给药曲美替尼。在当前优选的实施例中，曲美替尼通过口服给药递送。
[0081]
3.1.接受曲美替尼治疗的对象
[0082]
3.1.1.患有神经退化性疾病的患者
[0083]
在下面的实施例中，我们证明曲美替尼具有促进退化脑神经元功能恢复的多方面治疗作用。因此，本文所述的方法可用于治疗以皮质变性为特征的神经退化性疾病，例如阿尔茨海默病。在下面的实施例中，我们还表明曲美替尼促进溶酶体活性；因此，曲美替尼可
用于治疗以溶酶体功能障碍或自噬潮功能障碍为特征的疾病。在下面的实施例中，我们还表明曲美替尼在神经系统中诱导轴突生成(axogenesis)；因此，曲美替尼可用于治疗可通过诱导轴突生成来控制或治愈的疾病，例如以神经元损伤为特征的疾病，包括神经元死亡、神经变性、物理损伤的神经和/或神经突损伤、轴突病变和轴突生长的潜力减弱。在下面的实施例中，我们还表明曲美替尼保护或修复神经细胞轴突周围的髓鞘；因此，曲美替尼可用于治疗与髓鞘损伤或神经纤维脱髓鞘有关的疾病。
[0084]
可以用本文提供的方法治疗的神经退化性疾病包括，但不限于，痴呆、血管性痴呆、老年性痴呆、额颞痴呆(ftd；frontotemporal dementia)、路易体痴呆(lbd；lewy body dementia)、帕金森病(pd；parkinson's disease)、多系统萎缩(msa；multiple system atrophy)、皮质基底节变性(cbd；corticobasal degeneration)、进行性核上性麻痹(psp；progressive supranuclear palsy)、亨廷顿病(hd；huntington's disease)、肌萎缩侧索硬化(als，葛雷克氏症(lou
‑
gehrig's disease))、原发性侧索硬化(pls；primary lateral sclerosis)、进行性延髓麻痹(pbp；progressive bulbar palsy)、进行性肌萎缩(pma；progressive muscular atrophy)、假性球麻痹、遗传性痉挛性截瘫(hsp；hereditary spastic paraplegia)、小脑共济失调、克雅氏病(cjd；creutzfeldt
‑
jakob disease)、多发性硬化(ms；multiple sclerosis)、吉兰
‑
巴雷综合症(gbs；guillain
‑
barre syndrome)和轻度认知障碍(mci；mild cognitive impairment)。
[0085]
在一些实施例中，选择用于治疗的患者患有阿尔茨海默病(ad)。ad患者可患有轻度ad、中度ad或重度ad。在一些实施例中，患者患有早发性ad。在一些实施例中，患者患有迟发性ad。在一些实施例中，ad患者表现出高血清白蛋白与球蛋白比率和高水平的c
‑
反应蛋白，这表明炎症。在一些实施例中，ad患者不表现出升高的炎症生物标志物例如crp或升高的血清白蛋白与球蛋白比率。在一些实施例中，患者在整个大脑的各个区域表现出锌缺乏。在一些实施例中，ad患者表现出高血浆蛋白酶水平。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶b。
[0086]
在一些实施例中，患者具有一种或更多种症状，例如记忆丧失、语言问题、不可预测的行为以及个性和行为改变。在一些实施例中，患者没有任何行为症状。在一些实施例中，患者的与ad相关的一种或更多种生物标志物发生变化。
[0087]
在一些实施例中，患者具有轻度认知障碍(mci)。在一些实施例中，患者有记忆障碍和记忆困难。在一些实施例中，患者有异常的记忆功能，其记录具有得分低于来自韦氏记忆量表
‑
修订版的逻辑记忆ⅱ子量表(延迟段落回忆)的教育调整临界值(最高分25分)：a)对于16年及以上教育小于或等于8、b)对于8至15年教育小于或等于4、c)对于0至7年教育小于或等于2。在一些实施例中，患者的简易智力状况检查法(mmse；mini
‑
mental state exam)分数在24和30(包括)之间。在一些实施例中，患者的临床痴呆评定量表评分为0.5以及记忆盒评分为至少0.5。在一些实施例中，患者的一般认知和功能表现得到充分保护，因此不能诊断为ad。
[0088]
在一些实施例中，神经退化性疾病涉及mapk的异常激活。在一些实施例中，神经退化性疾病涉及mapk/erk通路的异常激活。在一些实施例中，神经退化性疾病涉及异常的内体
‑
溶酶体功能。
[0089]
在优选的实施例中，患者没有braf v600e或v600k突变并且患者没有癌症。
[0090]
3.1.2.患有与溶酶体功能障碍或自噬潮相关的疾病的患者
[0091]
在实施例中，我们证实曲美替尼通过调节雷帕霉素靶蛋白(mtor；mammalian target of rapamycin)和转录因子eb(tfeb；transcription factor eb)通路诱导自噬体
‑
溶酶体融合来促进溶酶体活性。因此，曲美替尼可用于治疗以溶酶体功能障碍或自噬潮功能障碍为特征的疾病。所述疾病包括，但不限于，溶酶体贮积病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑萎缩症、眼咽型肌营养不良、朊病毒疾病、致命性家族性失眠症、α
‑
1抗胰蛋白酶缺乏、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、x连锁脊髓延髓肌萎缩症、神经元核内透明包涵体病、多发性硬化、青光眼和年龄相关性黄斑变性。溶酶体贮积病包括，但不限于，甘露糖苷贮积症、天冬氨酰氨基葡糖尿、幼年神经元蜡样质脂褐质沉积症(jncl，幼年巴顿并或cln3病)、胱氨酸病、法布里病、戈谢病ⅰ、ⅱ和ⅲ型、糖原贮积症ⅱ型(庞贝氏症)、gm2
‑
神经节苷脂贮积病ⅱ型(山德霍夫氏病)、异染性脑蛋白质营养不良、黏脂病ⅰ、ⅱ/ⅲ和ⅳ型、粘多糖贮积病(贺勒氏疾病及其变种、亨特氏病、sanfilippo a、b、c和d综合征、莫尔基奥a和b综合征、maroteaux
‑
lamy和sly综合征)、尼曼
‑
匹克病a/b、c1和c2型以及辛德勒病ⅰ和ⅱ型。
[0092]
3.1.3.患有与神经元损伤相关的疾病的患者
[0093]
在实施例中，我们证实曲美替尼在神经系统中诱导轴突生成(axogenesis)。因此，曲美替尼可用于治疗可通过诱导轴突生成控制或治愈的疾病，例如以神经元损伤为特征的疾病，包括，但不限于，神经元死亡、神经变性、物理损伤的神经和/或轴突损伤、轴突病变或轴突生长潜力减弱。所述疾病包括，但不限于，青光眼中风、头部外伤、脊髓损伤、视神经损伤、局部缺血、缺氧、神经退化性疾病、多发性硬化和多系统萎缩。所述疾病还包括糖尿病神经病变；病毒相关的神经病变；包括获得性免疫缺陷综合征(aids)相关的神经病变；传染性单核细胞增多症伴多发性神经炎；病毒性肝炎伴多发性神经炎；吉兰
‑
巴雷综合症；肉毒中毒相关的神经病变；包括铅和酒精相关的神经病变的中毒性多发性神经病变；包括亚急性联合变性的营养性神经病变；包括系统性红斑狼疮相关的神经病变的血管病性神经病变；结节病相关的神经病变；癌性神经病变；压迫性神经病变(例如，腕管综合症)；遗传性神经病变如腓骨肌萎缩症；以及与脊髓损伤相关的周围神经损伤。所述疾病还包括眼部损伤或疾病(例如，中毒性弱视、视神经萎缩、高位视路病变、眼球运动障碍、第三脑神经麻痹、第四脑神经麻痹、第六脑神经麻痹、核间性眼肌麻痹、凝视麻痹、自由基对眼睛的伤害等)或视神经病变(例如，缺血性视神经病变、中毒性视神经病变、眼缺血综合征、视神经炎症、视神经感染、视神经炎、视神经病变、视神经乳头水肿、视神经盘炎、球后视神经炎、视网膜震荡、青光眼、黄斑变性、视网膜色素变性、视网膜脱离、生牵拉性撕裂孔、糖尿病性视网膜病变、医源性的視網膜病變和视神经玻璃膜疣等)
[0094]
3.1.4.患有与受损髓鞘相关疾病的患者
[0095]
在实施例中，我们证实曲美替尼保护或修复围绕神经细胞轴突的髓鞘。因此，曲美替尼可用于治疗以髓鞘受损或神经纤维脱髓鞘为特征的疾病，例如多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、横贯性脊髓炎、谢耳德氏病、巴娄氏病、临床孤立综合征、亚历山大病、卡纳万病、科凯恩综合征、佩梅病、视神经炎、视神经脊髓炎、htlv
‑
i相关性脊髓病、遗传性白质脑病、吉兰
‑
巴雷综合症、脑桥中央髓鞘溶解症、深部脑白质缺血、进行性多病灶脑白质病、脱
髓鞘性hiv脑炎、脱髓鞘性放射损伤、获得性毒性代谢紊乱、可逆性后部脑病综合征、脑桥中央髓鞘溶解症、脑白质营养不良、肾上腺脑白质营养不良、krabbe球形细胞病和/或异染性脑蛋白质营养不良。其中发生脱髓鞘的其他疾病包括由颈椎狭窄引起的脊髓型颈椎病、脑或脊髓的创伤性损伤以及包括中风和新生儿缺氧性损伤的中枢神经系统的缺氧性损伤。
[0096]
3.2.曲美替尼的给药
[0097]
3.2.1.期间
[0098]
对所选患者每天给药治疗有效量的曲美替尼至少四周。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导神经分化的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导神经再生的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导溶酶体活性的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以增强自噬体
‑
溶酶体融合的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导轴突生成的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以保护神经系统中新形成的轴突的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导修复或保护髓鞘的时间段。
[0099]
在某些实施例中，给药曲美替尼至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周或至少十周。在某些实施例中，给药曲美替尼至少一个月、至少两个月、至少三个月或四个月。在一些实施例中，给药曲美替尼约六周、七周、八周、九周、十周或更长时间。在一些实施例中，给药曲美替尼约一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、十二个月或更长时间。
[0100]
在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与脑中突触形成的基因表达的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与脑中成神经细胞增殖的基因表达的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与脑中轴突生长的基因表达的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与脑中免疫反应的基因表达的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与溶酶体和/或自噬体活性的基因表达的时间段。在一些实施例中，给药曲美替尼足以诱导参与脑中突触形成、成神经细胞增殖、轴突生长、溶酶体活性和自噬体活性的基因表达的时间段。
[0101]
在一些实施例中，给药曲美替尼直至检测到一种或更多种标志物的水平变化。在一实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。在一些实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个是与溶酶体活性相关的蛋白质。在一些实施例中，所述与溶酶体活性相关的蛋白质是糖基水解酶或蛋白酶。在一些实施例中，所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述在组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。这些蛋白质可用作测量mek 1/2抑制剂(如曲美替尼)的功效的标志物。
[0102]
在一些实施例中，给药曲美替尼直至一种或更多种标志物的水平达到在给药曲美
替尼之前或不给药的水平的至少1.3x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x或1000x。在一些实施例中，给药曲美替尼直至一种或更多种标志物的水平达到在给药曲美替尼之前或不给药的水平的至多0.8x、0.7x、0.6x、0.5x、0.4x、0.3x、0.2x、0.1x、0.05x或0.01x。
[0103]
在一些实施例中，给药曲美替尼直至一种或更多种标志物的水平达到固定或预定水平的至少1.3x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、20x、30x、40x、50x、100x、200x或1000x。在一些实施例中，给药曲美替尼直至一种或更多种标志物的水平达到固定或预定水平的至多0.8x、0.7x、0.6x、0.5x、0.4x、0.3x、0.2x、0.1x、0.05x或0.01x。
[0104]
在一些实施例中，给药曲美替尼直至检测到所需的治疗结果。在一些实施例中，所述所需的治疗结果是患者行为症状的改变。在一些实施例中，给药曲美替尼直至出现不可接受的毒性。
[0105]
3.2.2.剂量
[0106]
曲美替尼以治疗有效剂量给药。在本文所述的方法中，治疗有效剂量是有效治疗对象的神经退化性疾病的剂量。在一特定的实施例中，治疗有效剂量是有效治疗对象的ad的剂量。
[0107]
在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导神经分化的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导神经再生的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导溶酶体活性的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导轴突生成的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以增强受试者中自噬体
‑
溶酶体融合的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以保护神经系统中新形成的轴突的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导髓鞘修复或保护的剂量。
[0108]
在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与脑中突触形成的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与脑中成神经细胞增殖的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与脑中轴突生长的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与轴突生成的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与增强溶酶体活性的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与脑中免疫反应的基因表达的剂量。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与溶酶体和/或自噬体活性的基因表达。在一些实施例中，治疗有效剂量是足以诱导参与脑中突触形成、成神经细胞增殖、轴突生长、溶酶体活性和自噬体活性的基因表达的剂量。
[0109]
在一些实施例中，以足以诱导一种或更种标志物水平变化的剂量给药曲美替尼。在一些实施例中，以足以引起患者靶组织或从患者获得的生物样品中的一种或更多种标志物的水平变化的剂量给药曲美替尼。在一实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、
rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。所述小鼠基因的人类同源物可以是gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl6、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap1
‑
gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。在一些实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个是与溶酶体活性相关的蛋白质。在一些实施例中，所述与溶酶体活性相关的蛋白质是糖基水解酶或蛋白酶。在一些实施例中，所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。这些蛋白质可用作测量mek 1/2抑制剂(如曲美替尼)效果的标志蛋白质。
[0110]
在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.25ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.5、0.75、1、1.25、1.50、1.75或2ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供至少0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供0.25至20、0.25至10、0.25至5、0.5至5、2.5至10和1至5ng/g之间的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。
[0111]
在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供至少0.25ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供至少0.5、0.75、1、1.25、1.50、1.75或2ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供至少0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供0.25至20、0.25至10、0.25至5、0.5至5、2.5至10和1至5ng/ml之间的曲美替尼的平均峰值浓度(cmax)的剂量给药。
[0112]
在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供不超过4.4ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供不超过2ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在脑中提供不超过1.8ng/g、不超过1.6ng/g、不超过1.4ng/g、不超过1.2ng/g、不超过1ng/g、不超过0.8ng/g、不超过0.6ng/g或不超过0.4ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。
[0113]
在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供不超过4.4ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供不超过2ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在csf中提供不超过
1.8ng/ml、不超过1.6ng/ml、不超过1.4ng/ml、不超过1.2ng/ml、不超过1ng/ml、不超过0.8ng/ml、不超过0.6ng/ml或不超过0.4ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。
[0114]
在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供不超过22.2ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供不超过20ng/ml、不超过18ng/ml、不超过16ng/ml、不超过14ng/ml、不超过12ng/ml、不超过10ng/ml、不超过8ng/ml、不超过6ng/ml或不超过4ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。
[0115]
在一些实施例中，曲美替尼以提供至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100ng
·
h/g的曲美替尼在脑中的浓度曲线(auc)下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300ng
·
h/g的曲美替尼在脑中浓度曲线下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供约20至约700ng
·
h/g、约20至约600ng
·
h/g、约30至约500ng
·
h/g、约50至约400ng
·
h/g、约50至约300ng
·
h/g、约50至约200ng
·
h/g、约50至约100ng
·
h/g、约60至约300ng
·
h/g、约30至约200ng
·
h/g的曲美替尼的脑浓度曲线下的面积的剂量给药。
[0116]
在一些实施例中，曲美替尼以提供至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100ng
·
h/ml的曲美替尼在csf中的浓度曲线(auc)下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300ng
·
h/ml的曲美替尼在csf中浓度曲线下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供约20至约700ng
·
h/ml、约20至约600ng
·
h/ml、约30至约500ng
·
h/ml、约50至约400ng
·
h/ml、约50至约300ng
·
h/ml、约50至约200ng
·
h/ml、约50至约100ng
·
h/ml、约60至约300ng
·
h/ml、约30至约200ng
·
h/ml的曲美替尼的csf浓度曲线下的面积的剂量给药。
[0117]
在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供至少0.25ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供至少0.5、0.75、1、1.25、1.50、1.75、2、2.25、2.50、2.75、3、3.25、3.50、3.75、4、4.25、4.50、4.75或5ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供至少0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30ng/ml的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以在血浆中提供1至200、1至150、1至100、2至100、3至100、4至100、5至100、10至100、15至100、15至90、20至80、2.5至50、2.5至25、2.5至10和3至50ng/ml之间的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的剂量给药。
[0118]
在一些实施例中，曲美替尼以提供至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200ng
·
h/ml的曲美替尼在血浆浓度曲线下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供约70、75、80、85、90、95、
100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400或500ng
·
h/ml的曲美替尼在血浆浓度曲线下的面积的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以提供约20至约700ng
·
h/ml、约20至约600ng
·
h/ml、约30至约500ng
·
h/ml、约50至约400ng
·
h/ml、约50至约300ng
·
h/ml、约50至约200ng
·
h/ml、约50至约100ng
·
h/ml、约100至约500ng
·
h/ml的曲美替尼在血浆浓度曲线下的面积的剂量给药。
[0119]
在一些实施例中，曲美替尼以介于0.5和2mg/天之间的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以介于0.75和2mg/天之间的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以介于1和2mg/天之间的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以介于0.75和1.25mg/天之间的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以介于0.5和1mg/天之间的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以0.5mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以1.5mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以2mg/天的剂量给药。
[0120]
在一些实施例中，曲美替尼以大于0.5mg/天且小于2mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75mg/天且小于2mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于1mg/天且小于2mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.75mg/天且小于1.25mg/天的剂量给药。在一些实施例中，曲美替尼以大于0.5mg/天且小于1mg/天的剂量给药。
[0121]
在一个优选的实施例中，每个剂量是作为单次口服摄入递送的每天剂量。在一些实施例中，每个剂量被分成若干次口服摄取。在一些实施例中，每个剂量被分成相等的摄取剂量。在一些实施例中，每个剂量被分成不相等的摄取剂量。在优选的实施例中，每个剂量以规则的间隔给药。
[0122]
4.标志物的检测
[0123]
在另一方面，提供了一种测试药物(例如，mek 1/2抑制剂，如曲美替尼)在神经退行化的对象中的治疗结果的方法。所述方法包括测量从所述对象获得的样品中的一种或更多种标志物的水平的步骤。
[0124]
在一些实施例中，本文提供的所述方法进一步包括测试从所述对象获得的样品中的一种或更多种标志物的表达的步骤。可使用本领域已知的方法通过测量蛋白质或通过测量mrna、使用诸如蛋白质印迹、酶联免疫吸附剂测定(elisa；enzyme
‑
linked immunosorbent assay)、rt
‑
pcr、qpcr、免疫电泳法、蛋白质免疫沉淀和蛋白质免疫染色的方法来测试一种或更多种标志物的表达。所述方法可采用各种测量mrna或蛋白质的量的方法。
[0125]
在一些实施例中，本文提供的所述方法进一步包括测量从对象获得的样品中的一种或更多种标志蛋白质的水平的步骤。可使用本领域已知的各种蛋白质测定来测量一种或更多种标志蛋白质的水平。例如，所述样品可在足以形成抗体
‑
标志物复合物的条件下与对所述标志物特异的抗体接触，然后检测所述复合物。可通过多种方式检测蛋白质生物标志物的存在，例如蛋白质印迹、elisa、免疫电泳法、蛋白质免疫沉淀、蛋白质免疫染色、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)、荧光激活细胞分选(facs；fluorescence activated cell sorting)和流式细胞仪。
[0126]
可在多个时间点测量一种或更多种标志物的水平，并且可比较在不同时间点测量
的量。一种或更多种标志物的水平随时间的变化可用于确定mek 1/2抑制剂(例如曲美替尼)对患者的治疗效果。
[0127]
在一实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。
[0128]
在一些实施例中，所述一种或更多种标志物中的每一个是与溶酶体活性相关的蛋白质。与溶酶体活性相关的蛋白质可以是糖基水解酶或蛋白酶。所述糖基水解酶所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶可以是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶可选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0129]
在一些实施例中，测量一种或更多种先前已知与神经退化性疾病相关的标志物的水平。
[0130]
在一些实施例中，一个或更多个标志物选自：(1)先前已知与神经退化性疾病(例如ad)相关的标志物；(2)由选自下组的小鼠基因的人类同源物编码的蛋白质或mrna：gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a,chrnb3,slc6a3,slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1；以及(3)与溶酶体活性相关的蛋白质，如糖基水解酶或蛋白酶。所述糖基水解酶选自：β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶。在一些实施例中，所述蛋白酶可以是组织蛋白酶。在一些实施例中，所述组织蛋白酶可选自：组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0131]
在一些实施例中，在开始给药曲美替尼的步骤之后获得的样品中测量一种或更多种标志物的水平。样品可在开始给药曲美替尼的步骤之后的一个或多个时间点获得。例如，在开始给药曲美替尼后的一周、两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周、十周、十一周、十二周、十三周、十四周或十五周获得样品。在一些实施例中，在开始给药曲美替尼后的一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月获得样品。在一些实施例中，在开始给药曲美替尼的步骤之后立即获得样品。在一些实施例中，在开始给药曲美替尼的步骤之后的两个不同时间点获得样品。在一些实施例中，在开始给药曲美替尼后的三个不同时间点获得样品。在一些实施例中，在开始给药曲美替尼的步骤后的四、五、六、七或八个不同时间点获得样品。
[0132]
在一些实施例中，在开始给药曲美替尼之前获得的对照样品中测量一种或更多种
标志物的水平。在一些实施例中，在从没有感兴趣疾病的健康对象中获得的生物样品中测量一种或更多种标志物的水平。在一些实施例中，所述方法进一步包括将在开始给药曲美替尼之前获得的对照样品中的一种或更多种标志物的水平与给药曲美替尼之后获得的样品进行比较的步骤。在一些实施例中，所述方法进一步包括将没有感兴趣疾病的健康对象中的一种或更多种标志物的水平与在开始给药曲美替尼之前或之后从患者获得的样品中的水平进行比较的步骤。一种或更多种标志物水平的比较可用于确定曲美替尼的治疗效果。在一些实施例中，一种或更多种标志物水平可用于确定适当的曲美替尼给药持续时间或剂量以实现所需的治疗结果。在一些实施例中，进行一种或更多种标志物的时程分析。在一些实施例中，一种或更多种标志物的水平可用于确定随后给药曲美替尼的方法，例如曲美替尼的持续时间和剂量。在一些实施例中，一种或更多种标志物的水平可用于确认与没有生物标志物类似的个体相比更可能经历暴露于曲美替尼的有利影响的个体。
[0133]
用于测试标志物的样品可通过本领域已知的任何方法获得。例如，样品可通过脑活检获得。在一些实施例中，样品通过立体定向脑活检获得。在一些实施例中，样品从患者的体液或分泌物，例如血液、脑脊液(csf；cerebrospinal fluid)、尿液、体液、唾液、粪便、胸水、淋巴液、痰、腹水、前列腺液或任何其他身体分泌物或其衍生物获得。血液样品包括全血、血浆、血清、外周血单核细胞(pbmc；peripheral blood mononuclear cells)或任何血液成分。
[0134]
在另一方面，公开了用于确定mek 1/2抑制剂例如曲美替尼的治疗效果的组合物，其包括用于特异性检测标志物的探针。在另一方面，还提供了用于这种目的的试剂盒。此类试剂盒可包括被分隔开以在密闭空间中接收一个或更多个容器的载体，例如小瓶、管等，并且每个容器包括在所述方法中使用的单独组件之一。例如，容器之一可包括被可检测地标志或有可能被可检测地标志的探针。这种探针可以分别是对蛋白质或mrna特异的抗体或多核苷酸。此类试剂盒通常包括上述容器和一个或更多个其他容器，其包括从商业和用户角度看需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装说明书。标签可存在于容器上以指示组合物用于特定应用，并且还可指示体内或体外使用的方向，例如上述内容。
[0135]
一个典型的实施例是一种包括容器的试剂盒、所述容器上的标签以及包括在所述容器内的组合物，其中，所述组合物包括与蛋白质或自身抗体生物标志物结合的一抗，并且所述容器上的标签表明所述组合物可用于评估样品中的此类蛋白质或抗体的存在，其中，所述试剂盒包括使用所述抗体评估特定样品类型中的生物标志物蛋白质的存在的说明。所述试剂盒还可包括一组用于制备样品和将抗体应用于所述样品的说明书和材料。所述试剂盒可包括一抗和二抗，其中二抗与标签偶联。
[0136]
5.药物组合物和单位剂型
[0137]
在又另一方面，本公开提供了用于治疗神经退化性疾病(例如，ad)的包括曲美替尼的药物组合物和单位剂型。
[0138]
在典型的实施例中，曲美替尼被制剂成用于口服给药。在一些实施例中，曲美替尼是具有惰性稀释剂或具有可食用载体的制剂。在各种实施例中，曲美替尼被封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，压制成片剂，或直接掺入饮食中的食物。对于口服治疗给药，活性化合物可与赋形剂混合并以可摄取片剂、口服片剂、包衣片剂、含片、胶囊、酏剂、分散剂、混悬剂、
溶液、糖浆、威化剂、贴剂、用于口服的粉剂等的形式使用。
[0139]
片剂、含片、丸剂和胶囊等还可包括以下一种或更多种：诸如黄蓍树胶、金合欢树、玉米淀粉或明胶等粘合剂；如磷酸二钙的赋形剂；如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等的分裂剂；如硬脂酸镁等的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可包括液体载体。各种其他材料可作为包衣存在，例如片剂、丸剂或胶囊可以以虫胶、糖或两者包覆。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味剂，例如樱桃或橙香料。可期望剂型或药物组合物中的材料在所使用的量下是药学纯的并且基本上无毒。
[0140]
一些组合物或剂型可以是液体，或者可包括分散在液体中的固相。
[0141]
在一些实施例中，口服剂型可包括硅化微晶纤维素，例如例如，约20％(wt/wt)至约70％(wt/wt)、约10％(wt/wt)至约20％(wt/wt)、约20％(wt/wt)至约40％(wt/wt)、约25％(wt/wt)至约30％(wt/wt)、约40％(wt/wt)至约50％(wt/wt)、或约45％(wt/wt)至约50％(wt/wt)的硅化微晶纤维素可存在于口服剂型或口服剂型的单位中。
[0142]
在一些实施例中，口服剂型可包括交联聚乙烯吡咯烷酮，例如交聚维酮。例如，约1％(wt/wt)至10％(wt/wt)、约1％(wt/wt)至5％(wt/wt)或约1％(wt/wt)至约3％(wt/wt)的交联聚乙烯吡咯烷酮可存在于口服剂型或口服剂型的单位中。
[0143]
在一些实施例中，口服剂型可包括诸如的气相二氧化硅。例如，约0.1％(wt/wt)至约10％(wt/wt)、约0.1％(wt/wt)至约1％(wt/wt)或约0.4％(wt/wt)至约0.6％(wt/wt)的气相二氧化硅可存在于口服剂型或口服剂型的单位中。在一些实施例中，口服剂型可包括硬脂酸镁。例如，约0.1％(wt/wt)至10％(wt/wt)、约0.1％(wt/wt)至1％(wt/wt)或约0.4％(wt/wt)至约0.6％(wt/wt)的硬脂酸镁可存在于口服剂型或口服剂型的单位中。包括唑来膦酸或另一种二磷酸盐的口服剂型可包括在药物产品中，其包括多于一个单位的口服剂型。
[0144]
曲美替尼可制剂成用于其他给药方法，例如舌下、直肠、鼻内、肠胃外、经皮或局部给药，或注射。作为游离酸或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散剂还可具有分散在其中或分散在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中的油。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物生长。
[0145]
在优选的实施例中，口服剂型的每个单位含有每天给药的有效量。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.1至3mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.2至3mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.3至3mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.4至3mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.5至3mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.5至2.5mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.5至2mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.75至2.5mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有1至2mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.75至1.25mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.2mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有0.25mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型
的每个单位含有0.5mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有1mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有1.5mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有2mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有2.5mg的曲美替尼。在一些实施例中，口服剂型的每个单位含有3mg的曲美替尼。
[0146]
在一些实施例中，口服剂型的每个单位是mekinist片剂，其含有0.5mg、1mg或2mg的曲美替尼。在一些实施例中，每0.5mg片剂含有0.5635mg的曲美替尼二甲基亚砜，相当于0.5mg的曲美替尼非溶剂化母体。在一些实施例中，每1mg片剂含有1.127mg的曲美替尼二甲基亚砜，相当于1mg的曲美替尼非溶剂化母体。在一些实施例中，每2mg片剂含有2.254mg的曲美替尼二甲基亚砜，相当于1mg的曲美替尼非溶剂化母体。
[0147]
在一些实施例中，所述片剂含有约25％至约89％重量的一种或更多种赋形剂。在一些实施例中，所述赋形剂基本上不含水。所述一种或更多种赋形剂可选自微晶纤维素、粉状纤维素、预胶化淀粉、淀粉、乳糖、磷酸氢钙、乳糖醇、甘露醇、山梨糖醇和麦芽糖糊精。在一些实施例中，未溶剂化的曲美替尼的量不超过约20％。通过引用以其整体并入在美国专利号8,580,304和9,271,941中描述的药物组合物可用于本公开的各种实施例。
[0148]
所述片剂还可包括片芯，其含有胶态二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁(蔬菜来源)、甘露醇、微晶纤维素和十二烷基硫酸钠。所述片剂还可包括包衣，其含有羟丙基甲基纤维素、氧化铁红、氧化铁黄、聚乙二醇、聚山梨酯80和/或二氧化钛。
[0149]
6.实施例
[0150]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制作和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人视为其发明的范围，也不旨在表示以下试验是全部或唯一进行的试验。已努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性。但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。可以使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸等。
[0151]
除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法
[0152]
6.1.实施例1：穿越血脑屏障
[0153]
对正常小鼠单次口服给药后，证实曲美替尼可穿透血脑屏障(bbb；blood
‑
brain barrier)。最高剂量组的脑/血浆暴露比(auc)为47.7％(图1)。还发现曲美替尼通过引起perk表达的显着降低，从而在口服给药后的正常小鼠的大脑中发挥其mek1/2抑制(图2)。与载体治疗组相比，p
‑
erks/erks比率在给药一周、两周、三周和四周后分别降低了22.5％、33.7％、50％和45.6％。这些结果表明曲美替尼穿透bbb。
[0154]
6.2.实施例2：给药曲美替尼后大脑中基因表达变化的时间过程
[0155]
为了评估大脑中的转录谱，使用在口服给药曲美替尼后的正常小鼠的全脑进行了大量rna
‑
seq。基因本体术语在每周的每个时间点得到丰富，其表明细胞功能的相关性，例如突触电位、神经系统发育、免疫反应和时间模式中错误的蛋白质折叠(图3a)。通过fgf受体信号和gpcr信号相关基因表达的降低，可间接证实在给药第一周和第二周期间通过给药曲美替尼减少mek
‑
erk信号。在给药曲美替尼的第四周观察到的端粒相关基因表达减少(图
3b)表明它与神经元成熟或通过神经发生激活的终末分化神经元密切相关。
[0156]
我们的结果表明，给药曲美替尼的第一周似乎是建立神经元通讯的关键时期，其由突触形成的转录变化证明。在第二周，我们观察到成神经细胞增殖相关和轴突生长相关基因的表达，然后在第三周和第四周分别观察到免疫反应和错误蛋白修饰反应的基因的表达。重要的是要注意与神经发生相关的基因集的增加和溶酶体活性的诱导都发生在四周期间，如基因表达热图所示(图4a至g)。图4a至g中列出的基因是在一周、两周、三周或四周给药中的至少一个中在载体治疗组和曲美替尼治疗组之间显示出至少1.3的倍数变化(fc)绝对值的基因。其fc介于
‑
2.26和3.71之间。
[0157]
由图4a至g中所示基因的人类同源物或与蛋白质受体(gaba、谷氨酸、乙酰胆碱、如多巴胺的单胺类等)相关的神经递质编码的蛋白质或mrna可用作生物标志物，其确定在接受曲美替尼治疗神经退化性疾病的个体中是否发生了有益作用。所述基因为gabrb1、gabrr2、glra3、nr3c2、cdkl5、grin2a、grin2b、plcxd3、chrm2、chrna3、chrna7、chrnb2、nefl、pld1、adra1a、chrnb3、slc6a3、slc18a2、cdh1、neurod1、nkx6
‑
1、cxcl5、rest、syt2、disc1、irx3、mdm4、sox14、grip1、pax2、bmp5、cpne1、numb、atp8a2、trim67、otp、il1rapl1、cpeb3、tnfrsf12a、hspb1、oprm1、lmx1a、clcf1、aspm、mecp2、ntf3、vegfa、lrp2、fez1、atp6v0c、rnase6、ctsk、acr、prss16、lamp5、prdx6、unc13d、bag3、tial1、adrb2、hps4、ass1、cckar、gimap5、hmox1、sesn3、pcsk9、capn1、rnf152、vps13c、dcn和hmgb1。所述基因与突触形成、神经发生、溶酶体功能和/或自噬体有关。
[0158]
6.3.实施例3：给药曲美替尼后大脑功能变化的时间过程
[0159]
为了验证神经网络的功能恢复，我们测试了5xfad小鼠皮质的神经活动。ad中的认知功能障碍与神经元丢失和神经网络崩溃引起的皮质萎缩和记忆障碍密切相关。海马结构(hpf)和相应的皮质区域之间的精细相互作用负责信息传递和合并。为了检查海马中记忆形成的能力，在海马ca1区域记录了兴奋性突触后电流(epscs；excitatory postsynaptic currents)，以比较八个月龄的野生型和5xfad小鼠之间的长时程增强(ltp；long
‑
term potentiation)。在口服给药的曲美替尼的动物中，5xfad小鼠的ltp显着降低恢复到几乎与野生型对照相当的水平(图5a和b)。
[0160]
这与使用y
‑
迷宫和新奇物识别试验的行为研究的结果一致，这证实了给药曲美替尼的小鼠中记忆形成的恢复(图6a和b)。
[0161]
6.4.实施例4：给药曲美替尼后大脑的结构变化
[0162]
为了确定曲美替尼对大脑的功能恢复是否由于神经元的结构恢复，我们检查了轴突和树突的形态恢复，其是构成神经元网络的关键成分。树突和轴突标志物map2和tau的染色表明曲美替尼治疗导致八个月龄和十三个月龄的5xfad小鼠皮质中的树突和轴突长度恢复，而使用载体给药的5xfad小鼠则显示出长度缩短的畸形。此外，与载体给药组相比，在曲美替尼给药组中球状肿胀轴突，其为由于ad患者和老年猴脑中aβ斑块积聚而引起的轴突恶化的指标，也显着减少(图7和8)。突触前标志物突触素和突触后标志物psd
‑
95的表达增加也揭示了曲美替尼在突触连接恢复中的贡献(图9和10)。这些结果表明，曲美替尼除了通过增强轴突和树突对抗淀粉样斑块毒性来赋予神经保护作用外，还诱导神经元突触的形成。
[0163]
我们还通过检查树突棘形成的变化来检查曲美替尼对来自icr小鼠胚胎的原代皮层神经元中突触形成的影响。树突棘是大量存在于树突表面的小突起。它们是大多数兴奋
性突触的突触后成分。树突棘的数量、大小和形状决定了神经元功能，并为突触可塑性提供了结构基础。与载体治疗组相比，曲美替尼(100nm)使树突棘的数量增加了24％。在aβ1‑
42
寡聚体诱导的神经毒性条件下，树突棘的数量与载体治疗组(ctl)相比减少了24％，而与aβ1‑
42
单独治疗组相比，曲美替尼治疗中的数量增加了80％(图11a和11b)。曲美替尼引起的树突棘数量增加表明由aβ1‑
42
诱导的突触功能障碍被曲美替尼恢复。
[0164]
6.5.实施例5：曲美替尼通过自噬体
‑
溶酶体融合增强溶酶体活性
[0165]
我们检查了曲美替尼在5xfad小鼠大脑皮质层v中减少细胞凋亡和增强溶酶体活性的可能性。自噬溶酶体活性的增强通过八个月龄的5xfad小鼠脑中的几个标志物证明(图12)。自噬体标志物lc3
‑ⅱ
在载体给药组中增加，并在曲美替尼给药组中进一步增加。溶酶体蛋白酶之一的成熟组织蛋白酶b的水平在载体给药的5xfad小鼠中降低。相反，在曲美替尼给药组中观察到成熟组织蛋白酶b的水平增加，这表明神经毒性蛋白质的溶酶体降解可由曲美替尼诱导(图12)。
[0166]
在神经元细胞系(sh
‑
sy5y)中也证实了曲美替尼诱导自噬溶酶体活性的能力(图13a和b)。与用5xfad小鼠获得的结果相似，用aβ1‑
42
寡聚体处理的sh
‑
sy5y细胞中的perk和lc3
‑ⅱ
水平增加。当用曲美替尼处理aβ1‑
42
细胞时，lc3
‑ⅱ
/lc
‑ⅰ
的水平比aβ1‑
42
单独处理的细胞增加65％，并且成熟组织蛋白酶b的水平比aβ1‑
42
单独处理的细胞增加44％(图13b)。即使在存在aβ1‑
42
寡聚体的情况下，用曲美替尼处理也观察到作为自噬通量标志物的p62的降解(图13a)。在原代皮层神经元中观察到类似的结果(图14a)。特别地，与载体处理的对照(ctl)相比，成熟组织蛋白酶b的水平随着处理增加了54％。当用aβ1‑
42
寡聚体处理原代皮层神经元时，成熟组织蛋白酶b的水平与未处理的神经元(ctl)相比降低了26％，但与aβ1‑
42
单独处理组相比，由曲美替尼处理的水平增加了73％。
[0167]
然后我们进行了免疫细胞化学分析，以确认sh
‑
sy5y细胞中自噬体
‑
溶酶体融合对溶酶体活性的诱导。我们发现，即使在aβ1‑
42
寡聚体存在的情况下，用曲美替尼处理的细胞也显示出增加的lc3
‑
lamp1共染色(图15a和b)。为了评估溶酶体酸化，我们测量了溶酶体探针
‑
阳性酸性斑点。在存在aβ1‑
42
寡聚体的情况下，曲美替尼处理导致溶酶体探针
‑
阳性酸性斑点增加(图15a和b)。
[0168]
我们还研究了这些对原代皮层神经元的影响。即使在aβ1‑
42
寡聚体存在的情况下，用曲美替尼处理的神经元也显示出lc3
‑
lamp1和溶酶体探针
‑
阳性酸性斑点的共染色增加(图16a和b)。这些结果意味着曲美替尼通过诱导自噬
‑
溶酶体融合来激活神经毒素的溶酶体降解。曲美替尼参与自噬体
‑
溶酶体融合的进一步证实由使用巴弗洛霉素a1提供，其通过抑制v
‑
atpase中断自噬体和溶酶体的融合。在aβ1‑
42
寡聚体存在的情况下，用曲美替尼和巴弗洛霉素a1治疗消除了曲美替尼对增加成熟组织蛋白酶b和减少p62的影响(图17a)。
[0169]
为了检查曲美替尼触发自噬通量的机制，在sh
‑
sy5y细胞中使用蛋白质印迹测量了自噬下游介质的变化。mtor的失活导致ulk1对ser758(在人中，在小鼠中为ser757)去磷酸化和随后的自噬诱导。实际上，我们观察到曲美替尼在aβ1‑
42
寡聚体存在下抑制了sh
‑
sy5y细胞中ser758上的mtor和ulk1磷酸化(图17b)。在aβ1‑
42
寡聚体处理的原代皮层神经元中观察到类似的结果(图18a至c)。与未处理组相比，通过aβ1‑
42
治疗，p
‑
mtor/mtor比率增加了2倍。在用曲美替尼(100nm)和aβ1‑
42
共同处理的组中，与aβ1‑
42
单独治疗组相比，该比率降低了67％(图18b)。此外，与未治疗的神经元相比，由aβ1‑
42
处理的神经元中ser757(pulk1
(s757))上酸化的ulk1与总ulk1的比率增加了51％，而与aβ1‑
42
单独处理的神经元相比，该比率在用曲美替尼和aβ1‑
42
共同处理的神经元中降低了29％。我们还测试了曲美替尼是否影响tfeb的易位，tfeb是一种调节溶酶体基因和自噬相关基因的转录因子eb。erk2和mtorc1可磷酸化ser142上的tfeb，从而抑制从细胞质到细胞核的易位并阻止溶酶体和自噬相关基因的转录。我们证实曲美替尼在存在aβ1‑
42
寡聚体的情况下诱导tfeb的核易位(图17c)，并表明曲美替尼使tfeb去磷酸化并将其定位于细胞核。
[0170]
除了自噬体
‑
溶酶体融合增加外，在曲美替尼给药组中还观察到细胞凋亡减少。为了确定自噬潮的增加是否诱导有毒蛋白质的减少并导致细胞凋亡减少，我们检查lc3
‑
lamp1的共染色和5xfad小鼠皮质中凋亡标志物活性半胱天冬酶3的表达。在曲美替尼给药组中观察到lc3
‑
lamp1共染色细胞增加和细胞凋亡减少(图19)。
[0171]
总之，这些发现表明曲美替尼通过增加自噬体
‑
溶酶体融合和下调mtor通路促进溶酶体活性来抑制aβ1‑
42
诱导的细胞死亡，同时诱导nsc分化为神经元谱系。
[0172]
在存在毒性aβ1‑
42
寡聚体或淀粉样斑块的条件下，已知自噬潮和溶酶体活性降低，导致最终细胞死亡。在这项研究中，我们证明曲美替尼通过诱导自噬体
‑
溶酶体融合恢复有毒环境中的自噬潮和溶酶体活性。至于其作用机制，曲美替尼抑制mtor酸化并降低ser758处的ulk1磷酸化，这反过来可能会增加ulk1与ampk的相互作用以诱导自噬。通过溶酶体激活维持蛋白质稳态不仅通过去除神经毒素诱导保护，而且通过细胞内代谢激活逆转与年龄相关的表型(回春作用)。因此，溶酶体激活和神经发生的诱导可能协同作用以在ad患者的大脑中产生恢复效果。
[0173]
我们还检查了是否可以在用曲美替尼处理的5xfad小鼠的血浆中检测到与溶酶体活性相关的内源性分子水平的变化。血浆组织蛋白酶b水平在以0.05和0.1mg/kg/天给药曲美替尼(snr0.05，snr0.1)的八个月龄的5xfad小鼠中呈下降趋势，并在0.1mg/kg/天处理组中下降达到统计学显着性(与载体处理的5xfad小鼠组相比，在0.05mg/kg/天组中降低了56.16％，并且在0.1mg/kg/天组中降低了99.2％)(图20a)。与5xfad
‑
载体相比，多奈哌齐给药组也表现出组织蛋白酶b水平的统计学显着降低(与载体处理的5xfad小鼠组相比降低97.13％)(图20a)。在十三个月龄的5xfad小鼠中，与5xfad
‑
载体组(veh)相比，在以0.1mg/kg/天处理曲美替尼(snr 0.1)的5xfad小鼠的血浆组织蛋白酶b水平呈下降趋势，尽管没有统计学意义(图20b)。
[0174]
有报道称，与健康对照相比(morena，f.等人.轻、重度阿尔茨海默病与mci患者外周血溶酶体酶表达水平的比较：对再生医学方法的影响.int j mol sci 18，doi:10.3390/ijms18081806(2017)；sundelof，j.等人.与健康对照相比的阿尔茨海默病患者血浆中的组织蛋白酶b水平更高.阿尔茨海默症杂志22，1223
‑
1230，doi:10.3233/jad
‑
2010
‑
101023(2010))，阿尔茨海默病患者的血浆组织蛋白酶b水平升高。
[0175]
我们的结果表明，与溶酶体活性相关的内源性分子可用作确定曲美替尼是否对患有神经退化性疾病的个体产生有益作用的生物标志物。所述分子包括糖基水解酶，例如β
‑
氨基己糖苷酶、β
‑
半乳糖苷酶、β
‑
半乳糖脑苷脂酶和β
‑
葡糖苷酸酶，以及蛋白酶，例如组织蛋白酶，其包括组织蛋白酶s、组织蛋白酶d、组织蛋白酶b、组织蛋白酶k和组织蛋白酶l。
[0176]
6.6.实施例6：轴突生成的诱导和新形成轴突的保护
[0177]
在从tg2576 ad模型小鼠分离的nsc中，曲美替尼降低了活性半胱天冬酶3并强烈
诱导nsc分化为神经元样细胞(图21)。tg2576衍生的nsc表达人类转基因蛋白aβ并被认为是一种类似于体内观察到的一些细胞改变的体外ad模型(世界干细胞杂志2013；5(4)：229
‑
237)。
[0178]
我们观察到在曲美替尼处理的tg2576 nsc中具有双极形态的细胞显着增加，并具有延长的神经突(图21)。自噬体和溶酶体的表达在曲美替尼处理的nsc中显着增加，如lc3和lamp1染色增加所示(图22a)。自噬体
‑
溶酶体融合在轴突样细长元件以及曲美替尼处理的nsc的胞体中显着增加(图22b中的黄色箭头)。这些结果意味着曲美替尼诱导轴突生成并激活新形成的轴突中的溶酶体降解，这显示了其作为与轴突病相关的疾病的治疗剂的潜力。
[0179]
6.7.实施例7：髓鞘的恢复
[0180]
髓鞘是围绕神经细胞轴突的绝缘层，其允许电脉冲沿着神经细胞快速有效地传输。我们使用针对作为髓鞘的主要成分的髓鞘碱性蛋白(mbp；myelin basic protein)的抗体检查了曲美替尼对髓鞘的影响(图23)。与相同年龄的野生型小鼠相比，以载体处理的八个月龄的5xfad小鼠显示出髓鞘明显受损。然而，以0.05mg/kg/天(snr 0.05)或0.1mg/kg/天处理曲美替尼(snr 0.1)的八个月龄的5xfad小鼠的mbp水平恢复到与野生型小鼠相当的水平。相比之下，用多奈哌齐处理的5xfad小鼠的mbp水平与以载体处理的5xfad小鼠的mbp水平一样低。这些结果表明5xfad小鼠中受损的髓鞘可通过曲美替尼治疗恢复。髓鞘的恢复可增强大脑皮质中神经细胞通讯的激活。
[0181]
6.8.实施例8：曲美替尼对人类的治疗效果
[0182]
曲美替尼以在脑中提供至少0.25ng/g的曲美替尼的平均峰值浓度(c
max
)的量给药于患有阿尔茨海默病的患者。每天进行给药持续至少四周。以该量给药曲美替尼并在此期间减少与阿尔茨海默病相关的行为和/或生理症状
[0183]
6.9.试验方法
[0184]
动物：b6sjl
‑
tg(appswfllon，psen1*m146l*l286v)(5xfad)小鼠购自杰克森实验室(the jackson laboratory)(mmrrc股票号：34840
‑
jax)，并根据kpclab(批准号：p171011)或medifron dbt inc.(批准号：medifron 2017
‑
1)的实验动物管理与使用委员会(iacuc)批准的协议进行试验程序。c57bl/6小鼠获自orientbio inc.，并且符合相关伦理法规和动物程序由首尔国立大学医院iacuc(批准号：16
‑
0043
‑
c1a0)或延世生物医学研究所iacuc(批准号：2017
‑
0107)审查和批准。用于药物代谢动力学分析的icr小鼠获自orientbio inc.，并且试验程序经kpclab的iacuc批准(批准号：p171011)。
[0185]
曲美替尼处理：将曲美替尼(medchemexpress，蒙茅斯章克申，新泽西州)微粉化并悬浮在含有5％甘露醇、1.5％羟丙基甲基纤维素和0.2％十二烷基硫酸钠的载体中。对于药物代谢动力学分析，将0.05、0.2和0.8mg/kg的曲美替尼口服给药至七周龄的正常小鼠(icr，每组n＝5)作为单次给药。在每个相同的时间点处死小鼠。对于正常小鼠的perk表达变化的研究和全细胞rna测序研究，将0.1mg/kg/天的曲美替尼(在4％的二甲基亚砜(dmso) 96％玉米油中)口服给药至六周龄的c57bl/6小鼠(每组n＝3)。给药一周、两周、三周或四周后处死小鼠。将5xfad小鼠(雄性，每组n＝7至10)分为载体和曲美替尼治疗组。十二个月龄的小鼠通过每天一次经口管饲接受载体或0.1mg/kg的曲美替尼持续1个月(这些小鼠在实施例中被称为“13个月龄的5xfad小鼠”)。五个月龄的小鼠每天一次经口服管饲受载体、
0.05mg/kg或0.1mg/kg的曲美替尼或2mg/kg的多奈哌齐持续3个月(这些小鼠在实施例中被称为“八个月龄的5xfad小鼠”)。治疗结束后取血。将血液样品收集在乙二胺四乙酸(edta)管中，对其进行离心得到血浆。通过灌流法处死所有小鼠，并对脑样品进行生化和免疫组织化学分析。
[0186]
全细胞rna测序：从小鼠全脑中分离rna，并根据制造商的指南(1)使用truseq stranded mrna prep试剂盒(illumina,圣地亚哥，加利福尼亚州)制备用于rna测序的cdna文库。文库在illumina nextseq500平台上测序，使用tophat v2.0.13将读数映射到参考小鼠mm10基因组。映射到转录组的读数总数为24,532个基因，在差异表达分析之前，至少一个样品中计数为0的基因被去除。去除计数为0的基因后，共有18,727个基因。为了定义差异表达基因(deg)，我们设置了≥1.3的折叠变化(fc)的严格统计截止值和错误发现率(fdr)<0.05。在第一周，载体治疗组和曲美替尼治疗组之间共鉴定出500个degs，在第二周共鉴定出498个degs，在第三周共鉴定出446个基因，在第四周共鉴定出538个基因。基因本体论是通过基因本体论联盟的基因本体论程序进行的。热图分析由使用与突触、神经发生和溶酶体相关的deg列表的r studio进行。
[0187]
电生理学：
[0188]
脑切片制备：人工脑脊液(ascf；artificial cerebrospinal fluids)按以下组分所述制备：高蔗糖acsf(mm)：0.5cacl2、2.5kcl、1.25nah2po4、5mgso4、205蔗糖、5羟乙基哌嗪乙硫磺酸(hepes)、10葡萄糖、26nahco3(ph＝7.3
‑
7.4,mosm＝300
‑
310)，而记录acsf的制备如下：126nacl、3.5kcl、1.25nah2po4、1.6cacl2、1.2mgso4、10葡萄糖，26nahco3、5hepes(ph＝7.3
‑
7.4,mosm＝300
‑
310)。根据需要每天新鲜制备acsf。
[0189]
所有试验使用八个月龄的5xfad小鼠进行。将高蔗糖acsf维持在冰上并通过95％o2/5％co2的气体注入饱和至少20分钟。用二氧化碳对动物实施安乐死，在不到四分钟的时间内迅速收获大脑，并在预充氧的高蔗糖ascf中冷藏两分钟。为了制作切片，大脑半球被矢状分割。对于每个半球，通过vf
‑
200振动切片机(precisionary instrument，美国)将皮质和海马部分冠状切片至300μm。对于切片的培养，将它们浸入尼龙网中，在95％o2/5％co2的含氧ascf中在32至34℃下培养30分钟，并在首次记录前在室温下再培养30分钟。
[0190]
全细胞膜片钳ltp记录：在28至30℃的膜片钳室中开始试验之前，记录切片在2ml/min的充氧acsf中灌流30分钟。对于全细胞膜片钳，我们使用从micropipette puller p
‑
1000(sutter instrument，美国)拉出的4至8mω硼硅酸玻璃电极(a
‑
m systems，美国)。细胞内溶液包括(以mm计)：在290mosm的140k
‑
葡萄糖酸盐、10kcl、1egta、10hepes、4na2atp、0.3na2gtp，并且ph 7.3由koh调节。应用heka epc
‑
10双放大器(heka elektronik，德国)。切片图像在直立式eclipse fn1显微镜(尼康，日本)下通过400x放大倍数的红外线差干涉对比(ir
‑
dic)光学系统进行监测。
[0191]
在ca1锥体神经元中以
‑
70mv保持电位的电压钳模式记录兴奋性突触后电流(epsc)。记录单元中的访问电阻低于40mω，容差为20％。为了刺激神经元，外部刺激器iso
‑
flexa.m.p.i.，以色列)中的双极电极(fhc，美国)位于谢氏侧支(schaffer collateral)，距离记录电极200至400μm。测试刺激脉冲每30秒在同一部位施加30至40％的强度，从最大epsc振幅开始，在接下来的theta脉冲刺激(tbs)之前3分钟用于长期增强(ltp)诱导。tbs由四个间隔为10秒的序列组成，每个序列由5hz的10个脉冲组成，每个脉冲由100hz的4个脉冲
组成。在tbs应用后记录epsc 20分钟。数据以1khz过滤并用clampfit软件(molecular devices，美国)进行分析。
[0192]
免疫组织化学分析：用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)灌注小鼠，然后灌注4％多聚甲醛(pfa)。通过免疫组织化学解剖和分析大脑。对于石蜡切片，将脑半球矢状包埋在石蜡中并制备成5μm切片。切片脱蜡，并在柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)中进行抗原修复。对于免疫染色，将切片与抗
‑
map2(密理博(millipore)，伯灵顿，马萨诸塞州)、抗
‑
tau(cell signaling，丹弗斯，马萨诸塞州)、抗
‑
pnfh(biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州)、抗活性半胱天冬酶3(cell signaling)、抗
‑
mbp(r&d systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)、抗
‑
lamp1(abcam，剑桥，英国)、抗
‑
lc3(cell signaling)或抗
‑
dcx(abcam)抗体培养。此步骤之后是与alexa fluor 488偶联的抗
‑
山羊igg(赛默飞世，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)或alexa fluor 555偶联的抗
‑
兔igg二抗(thermo)培养。切片用dapi复染。使用lsm700激光扫描共聚焦显微镜(卡尔蔡司(carl zeiss)，heildenheim，德国)。对于二氨基联苯胺(dab)染色，使用dab试剂盒(vector laboratories inc.，伯林盖姆，加利福尼亚州)中的过氧化物酶底物进行免疫组织化学。使用icy micromanager程序(nstitut pasteur，巴黎，法国)计数来自皮质层v的neun
‑
阳性和活性半胱天冬酶3
‑
阳性细胞。使用icy程序测量map2和tau阳性树突和轴突的长度。
[0193]
细胞培养：sh
‑
sy5y神经母细胞瘤细胞在37℃、5％co2,dmem(dulbecco's modified eagle medium)培养基/ham's f
‑
12营养混合物(invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中培养，并补充有含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的10％热灭活胎牛血清。原代皮层神经元培养物来自icr小鼠的第十八天胚胎(e18)。将解离的细胞铺在神经干细胞培养基中的涂有聚
‑
d
‑
赖氨酸的玻璃盖玻片上，并补充有2％b27(invitrogen)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mml
‑
谷氨酰胺。从八周龄的c57bl/6小鼠大脑的脑室下区(svz)中分离出来自正常小鼠的原代nsc。来自成年tg2576小鼠大脑的nsc从首尔国立大学医院获得。如前所述培养神经球(m.y.kim，b.s.moon，k.y.choi，皮层神经祖细胞的体外分离与维持.分子生物学方法1018,3
‑
10(2013))。对于来自正常小鼠的神经球培养，将细胞从脑组织中分离出来，并在25cm2烧瓶(spl，京畿道，韩国)中的n2培养基中悬浮生长。将bfgf(20ng/ml，派普泰克(peprotech)，普林斯顿，新泽西州)和人egf(20ng/ml，派普泰克)添加到培养基中以允许细胞形成神经球。为了进行分析，nsc被培养为单层。对于nsc的分化，将神经球与tryple(invitrogen)分离，并铺在15μg/ml的聚
‑
l
‑
鸟氨酸
‑
(默克，圣路易斯，密苏里州)和10μg/ml的纤连蛋白(gibco)包被的碟上，且在bfgf和egf耗尽的n2培养基中培养2天。对于来自tg2576小鼠的神经球培养，细胞在75cm2烧瓶(spl)中在补充有b27补充剂的dmem/f12中悬浮生长。将bfgf(10ng/ml)和人egf(10ng/ml)添加到培养基中以允许细胞形成神经球。为了诱导分化和aβ表达，将神经球用移液器分离，并铺在15μg/ml的聚l
‑
鸟氨酸和10μg/ml的纤连蛋白(gibco)包被的碟上，且在bfgf和egf耗尽的培养基中培养2天。
[0194]
蛋白质提取和蛋白质印迹：细胞和组织用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，然后用ripa缓冲液(10mm hepes、1.5mm mgcl2、10mm kcl、0.01m dtt、蛋白酶抑制剂，ph 7.9)匀浆提取。裂解物在4℃下以13,000rpm离心20分钟，并使用bradford测定法(伯乐(bio
‑
rad)，赫拉克勒斯，加利福尼亚州)测定上清液中的蛋白质含量。对于亚细胞分离，细
胞用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(250mm蔗糖、20mm hepes、ph 7.4、10mm kcl、1.5mm mgcl2、1mm egta、1mm edta和1mm dtt)在冰上裂解30分钟，然后在4℃下以720g离心5分钟。上清液在4℃下以15,000rpm离心10分钟，所得上清液用作细胞质部分。在720g离心5分钟后，用裂解缓冲液洗涤团粒并溶解在核裂解缓冲液(50mm tris hcl、ph 8.0、150mm nacl、1％np40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％sds、10％甘油)中作为核分数。对来自每个样品的蛋白质进行8％至15％的sds
‑
page，并将解析的蛋白质转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯膜上。膜在室温下用5％脱脂奶粉在tris缓冲盐水/吐温20(tbst)中封闭1小时，然后与抗
‑
磷酸化
‑
erk(cell signaling)、抗
‑
erk(cell signaling)、抗
‑
lamp1(abcam)、抗
‑
lc3(cell signaling)、抗
‑
组织蛋白酶b(cell signaling)、抗
‑
p62(cell signaling)、抗
‑
p62(5114，cell signaling)、抗
‑
磷酸化
‑
mtor(5536,cell signaling)、抗
‑
mtor(2983，cell signaling)、抗
‑
磷酸化
‑
ulk1(8054，cell signaling)、抗
‑
tfeb(852501，biolegend)和抗
‑
gapdh(cell signaling)在4℃下培养过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶
‑
偶联的山羊抗
‑
兔igg抗体(thermo)或山羊抗
‑
大鼠igg抗体(thermo)在室温下培养2小时。过氧化物酶活性通过增强的化学发光可视化。使用las
‑
4000系统(富士胶片，东京，日本)对检测到的信号进行量化。
[0195]
定量pcr(qrt
‑
pcr)：如前所述，对nsc进行定量pcr分析(j.konirova等人，调制的disp3/ptchd2表达影响神经干细胞命运决定.sci rep 7，41597(2017))。使用trizol(invitrogen)从细胞中提取总rna。使用m
‑
mlv逆转录酶(invitrogen)进行逆转录。根据制造商的指南，使用sybr
tm
绿色pcr主混合物(thermo)进行qrt
‑
pcr。结果表示相对于管家基因gapdh(甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶)。
[0196]
免疫细胞化学：将sh
‑
sy5y细胞或成人nsc置于分别涂有聚
‑
l
‑
鸟氨酸/层粘连蛋白或聚
‑
d
‑
赖氨酸的玻璃盖玻片上。用pbs洗涤3次5分钟后，细胞在室温下固定在10％福尔马林中15分钟。然后用pbs洗涤细胞并在0.1％triton x
‑
100中透化2分钟。将细胞在室温下置于含5％bsa的pbs封闭液中1小时，并与抗
‑
活性半胱天冬酶3(cell signaling)、抗
‑
aβ(thermo)、抗
‑
tau(cell signaling)、抗
‑
lc3(cell signaling)和抗
‑
lamp1(abcam)在室温下在封闭缓冲液中培养2小时。洗涤后，将细胞与与alexa fluor 488(thermo)偶联的山羊抗
‑
兔抗体和/或与alexa fluor 555(thermo)偶联的山羊抗
‑
鼠抗体培养过夜。洗涤后，将细胞与4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(dapi)培养5分钟。使用封固剂(biomeda，福斯特城，加利福尼亚州)封固盖玻片，并使用lsm700显微镜(carl zeiss)通过共聚焦显微镜观察。使用高于荧光强度阈值的像素计算系数的百分比。按照制造商的指示，使用溶酶体红色荧光探针(lysotracker red)dnd
‑
99(l7528，invitrogen)估计体内
‑
溶酶ph值。细胞与500nm在37℃下培养30分钟。使用lsm700显微镜(carl zeiss)在共聚焦显微镜下观察荧光强度。溶酶体探针色斑的数量用icy软件分析。
[0197]
行为测试
[0198]
y
‑
迷宫测试：将动物放置在y
‑
迷宫的中心并记录它们的活动3分钟。y
‑
迷宫是一个三臂迷宫，所有臂之间的角度为120
°
(40cm长
×
15cm高)。使用智能视频跟踪软件(panlab，美国)进行视频跟踪，并记录进入每个臂的顺序和数量。当一只老鼠连续进入三个臂而没有访问前一个臂时，就计算出自发交替。
[0199]
新奇物识别试验：为了测试新奇物识别，将小鼠习惯于空旷的露天场地(40cm
×
40cm)。在训练试验中，小鼠被放置在一个具有两个相同的物体的开放场地中，每个物体10分钟。第二天，测试试验进行了3分钟，将两个熟悉的物体之一替换为一个新物体。使用智能视频跟踪软件(panlab，美国)进行视频跟踪，熟悉和新奇物的识别计算为花在新物体上的时间占探索所有物体的时间的百分比。
[0200]
血浆组织蛋白酶b水平：使用edta管从八个月龄和十三个月龄的5xfad小鼠中收集血浆，并在
‑
80℃下储存直至使用。组织蛋白酶b elisa试剂盒(novus biologicals，百年州，科罗拉多州)用于分析血浆中的组织蛋白酶b水平。96孔板中加入100μl的标准溶液(0至10ng/ml)和100μl的血浆，并在37℃下培养90分钟。在每孔中立即加入100μl的生物素化检测抗体工作溶液，并在37℃下培养1小时。倒出每孔中的溶液，并用350μl的洗涤缓冲液洗涤3次。然后将100μl的hrp偶联工作溶液加入到每个孔中，并在37℃下培养30分钟。从每个孔中倒出溶液，重复洗涤过程五次。每孔中加入90μl的底物试剂，并将所述碟避光，且在37℃下培养15分钟。每孔中加入50μl的终止溶液，并用读数被设为450nm的微孔板读数器读取所述碟。
[0201]
参引合并
[0202]
本技术中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件出于所有目的通过引用整体并入本文，如每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件都被单独指明为所有目的通过引用并入。
[0203]
相等物
[0204]
尽管已经说明和描述了各种特定实施例，但上述说明不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变。在阅读本说明书后，本领域技术人员将明白许多变化。