重组人源IxIII胶原蛋白、表达菌株及其应用的制作方法

重组人源ixiii胶原蛋白、表达菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程菌技术领域，涉及一种重组人源ixiii胶原蛋白、表达重组人源ixiii胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用。


背景技术：

2.红血丝主要是因为面部角质层薄弱导致毛细血管位置更容易接触和感知到外界环境变化，从而造成毛细血管扩张而引起的面部现象。患者面部看上去比一般正常人群肤色红，也就是人们常称的高原脸，有的仅仅是两侧颧部发红，边界呈圆形，一般呈丝线状排列。这种皮肤薄而敏感，过冷或过热、情绪激动时脸色更红。严重者还会形成沉积性色斑，难以治愈。
3.胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体中含量最多的蛋白质，占到蛋白质总量的25％至35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能和修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料无法比拟的优异的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性。因此，胶原蛋白可以广泛应用在医药和化妆品等行业中。
4.然而，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，难以被人体利用，往往需要经过化学手段处理后才能使用。此外，当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，同时无法与人体相容，会导致免疫排斥和过敏症状。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。
5.为了解决传统动物胶原的问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原。因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。范代娣等人应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域，实现了产业化生产(中国专利201310157411.7，201510883010.9等)。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高，并存在安全隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。
6.因此，越来越多的研究开始利用真核微生物生产重组胶原蛋白。酵母菌具有天然的优势。首先酵母已经在食品、医药化工等行业有着悠久的使用历史，同时可以用于外源蛋白的分泌表达，有利于下游的分离纯化工艺，同时不会像细菌那样存在内毒素及热源等的生物安全性问题。


技术实现要素：

7.本发明通过组合人i型胶原蛋白及人iii型胶原蛋白中的短肽，并通过重复此短肽获得高活性的重组人源胶原蛋白，目的在于提供一种亲水性优异的重组人源ixiii型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其应用，能高效、安全地进行重组人源ixiii型胶原蛋白的胞外分泌表达。
8.实现本发明目的的技术方案如下：
9.本发明的重组人源i型胶原蛋白i 69aa，氨基酸序列如seq no.3所示。
10.本发明的重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa，氨基酸序列如seq no.4所示。
11.本发明的重组人源ixiii胶原蛋白为由重组人源i型胶原蛋白i 69aa和/或重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa拼接而成。具体可以为，若干个重组人源i型胶原蛋白i 69aa首尾连接拼接而成；或若干个重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa首尾连接拼接而成；或重组人源i型胶原蛋白i 69aa和重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa首尾连接拼接而成；或以重组人源i型胶原蛋白i 69aa和重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复n次得到的重复短肽，n≥2；或以若干个重组人源i型胶原蛋白i 69aa和若干个重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa首尾连接拼接而成；或以若干个重组人源i型胶原蛋白i 69aa和若干个重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa首尾连接拼接而成的短肽作为重复单元，重复n次得到的重复短肽，n≥2。本发明中所述的若干个为≥2。
12.在具体实施方式中，本发明提供了一种重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 165aa，由seq no.3所示的人i型胶原蛋白的短肽序列与seq no.4所示的人iii型胶原蛋白的短肽序列首尾相连组成的165氨基酸的短肽，氨基酸序列如seq no.5所示。
13.在具体实施方式中，本发明提供了一种重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa，由seq no.3所示的人i型胶原蛋白的短肽序列与seq no.4所示的人iii型胶原蛋白的短肽序列首尾相连组成的165氨基酸重复3次得到的重复短肽，氨基酸序列如seq no.6所示。其理论分子量约45.049kd。
14.本发明的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa的编码基因，其核苷酸序列如seq no.7所示。
15.本发明构建的重组人源ixiii胶原蛋白质粒ppic9k-ixiii的核苷酸序列如seq no.7所示，通过将重组人源ixiii型胶原蛋白ixiii 495aa的编码基因双酶切连接至ppic9k载体的xho i和not i间构建而成。
16.本发明构建的分泌表达重组人源ixiii型胶原蛋白ixiii 495aa的菌株为巴斯德毕赤酵母pichiapastorisjy0501，保藏编号为cgmcc no.16464，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母pichia pastoris jy0501通过将sac i酶切得到的线性化重组人源ixiii型胶原蛋白质粒ppic9k-ixiii诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
17.本发明还提供上述重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa在制备修复红血丝护肤品中的应用。
18.优选地，上述修复红血丝护肤品中，所述的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa的浓度为0.2％～0.4％(w/v，g/ml)，优选为0.3％(w/v，g/ml)。
19.本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因i型和iii型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源ppic9k型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，在生物医用材料、化妆品
等领域具有潜在的应用前景。
附图说明
20.图1为人ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
21.图2为人iii型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
22.图3为重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa氨基酸的疏水性分析图。
23.图4为重组人源ixiii胶原蛋白质粒ppic9k-ixiii的构建示意图。
24.图5为重组人源ixiii胶原蛋白质粒ppic9k-ixiii的sac i酶切琼脂糖凝胶电泳图。
25.图6为电转后的毕赤酵母gs115平板图。
26.图7为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
27.图8为阳性克隆菌株的pcr凝胶电泳图。
28.图9为#5阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
29.图10为#6阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
30.图11为#7阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
31.图12为#8阳性克隆菌株培养0、24、48、72和96小时样品的蛋白表达分析图。
32.图13为水分改善率结果图。
33.图14为效果结果图。
34.图15为红血丝表面积改善率图。
35.图16为纹理改善率图。
36.图17为a、b、c组试用者使用前后面部情况图。
具体实施方式
37.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
38.实施例1
39.1.蛋白序列选择
40.对人ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(seq no.1)及对人iii型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(seq no.2)进行疏水性分析，评价结果如图1、图2所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片段，取其中i型胶原蛋白的69个氨基酸短肽片段(即重组人源i型胶原蛋白i 69aa，seq no.3)及人iii型胶原蛋白96个氨基酸短肽的片段(重组人源iii型胶原蛋白iii 96aa，seq no.4)，将此两个短肽片段连成一个165个短肽片段单位(即重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 165aa，seq no.5)，此片段单位首尾连接重复三次整合成新的蛋白，即本发明的重组人源ixiii胶原蛋白(即重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa，seq no.6)。对重组人源ixiii型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图3所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。
41.2.质粒构建及线性化
42.将重组人源ixiii型胶原蛋白ixiii 495aa翻译成碱基序列(seq no.7)，采用基于
pas(pcr-based accurate synthesis)的方法合成基因，双酶切连接ixiii 495aa至ppic9k载体的xho i和not i之间，图4为重组人源ixiii型胶原蛋白质粒ppic9k-ixiii的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9k-ixiii转入top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如seq no.8所示。seq no.8的第244-249碱基处及1756-1763碱基处区域为酶切位点。
43.提取质粒20μg，使用sac i酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h。取5μl，进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图5所示。其中m为dna标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1为sac i酶切；2为回收的目的片段。
44.表1酶切线性化体系配制表
[0045][0046]
3.电转毕赤酵母细胞gs115
[0047]
冰浴电转杯，将10μl线性化质粒加入到装有80μl毕赤酵母gs115感受态细胞的1.5ml ep管内，混匀转移至直径为0.2cm电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。电击条件为：电压1.5kv；电容25μf；电阻200ω，电击时间为4～10msec。电击完成后，将650ul冰上预冷的浓度为1m山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml ep管中，30℃静置培养2h。低速离心收集菌体，全部涂布于md平板上，30℃恒温培养3-4d。图5为电转后的毕赤酵母gs115平板图。
[0048]
4.pcr鉴定阳性克隆菌株
[0049]
待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有500μl ypd液体培养基离心管，30℃，180r/min过夜培养。挑选10株克隆，分别提取基因组dna，如图6所示。图中，m为dna标准品，从下到上1000，2000，3000，4000，5000，6000，8000，10000bp；1-10：各克隆菌株提取的基因组。
[0050]
使用载体上引物pcr鉴定，预期条带大小约2kb，2kb为扩增序列大小，结果如图7所示，其中，m：dna标准品，从下到上100，200，500，750，1000，2000bp；1-10：各克隆菌株的pcr扩增片段。
[0051]
5.小试表达
[0052]
诱导表达：取鉴定的阳性菌株(5#，6#，7#，8#)50μl接入装有10mlbmgy的锥形瓶中，30℃，220r/min过夜培养，摇至od600＝2-6(对数生长，大约16-18h)；室温离心5000r/min离心5min，收集细胞，去除上清，用10ml bmmy重悬细胞，进行诱导表达；每24h从培养基中取样1ml，并加甲醇至终浓度0.5％继续诱导；以下各时间点0，24，48，72，96hr样品10000r/min离心2min收集上清液待检测。
[0053]
三氯乙酸沉淀法浓缩表达产物：
[0054]
(1)在离心管中加入500μl培养液上清和1/9体积的100％的tca，振荡混合，4℃沉淀过夜；
[0055]
(2)12000r/min离心10min，沉淀为粘稠带黄褐色胶状物，弃上清，收集沉淀，另将
ep管倒置于吸水纸上，37℃烘箱静置10～20min，使管壁无明显液体残留；
[0056]
(3)加入200μl冷丙酮，振荡混匀，样品在室温下静置10min，洗去管壁和管底残留的tca；
[0057]
(4)12000r/min离心10min，弃上清，重复步骤(2)和(3)，重复2～3次；
[0058]
(5)加入上样缓冲液30μl，37℃孵育1h，溶解沉淀；如果沉淀不溶解，可用100μl枪头吹打至沉淀溶解。
[0059]
sds-page电泳检测：选取5#，6#，7#，8#阳性菌进行表达情况分析结果如图8、9、10、11所示。其中，m：蛋白标准品；1：gs115菌株培养72小时上清；2：阳性菌株培养0小时上清；3：阳性菌株培养24小时上清；4：阳性菌株培养48小时上清；5：阳性菌株培养72小时上清；6：阳性菌株培养96小时上清。
[0060]
取8#阳性菌进行菌株保藏，命名为巴斯德毕赤酵母pichia pastoris jy0501，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为cgmcc no.16464。
[0061]
本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因i型和iii型的螺旋区中选择水溶性好、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，所以应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明采用的是分泌型表达载体，成功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。
[0062]
实施例2
[0063]
1、选取150人，随机分为3组，每组50人，最终确定有效人数为40人，每天晚上洁面后，取重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa护肤液使用，在使用前、使用后2天、11天、15天共4次使用仪器，每次对受试者进行拍照，分析效果，用antera3d皮肤测试仪(爱尔兰)对红血丝表面积及皮肤的纹理进行分析。
[0064]
2、效果判定
[0065]
效果＝(治疗前皮损计数-治疗后皮损计数)/治疗前皮损计数*100％。
[0066]
效果级别：
[0067]
显效：红肿或刺痛消退60％～90％，症状减轻；
[0068]
有效：红肿或刺痛消退20％～60％，症状改善；
[0069]
无效：红肿或刺痛消退＜20％，临床症状未改善。
[0070]
实验分为a组，b组和c组，以相同的配方同一批次的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa冻干饼为基质，每瓶5mg。为了保证实验的真实性，a组、c组为对照组，a组，重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa的浓度为0.1％(w/v，g/ml，即1g/l)；c组，重组人源ixiii胶原
蛋白ixiii 495aa的浓度为0.5％(w/v，g/ml，即5g/l)，b组为实验组，重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa的浓度为0.3％(w/v，g/ml，即3g/l)。
[0071]
a组、b组和c组的4项皮肤指标检测数据如下表所示。
[0072]
表2a组0.1％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa检测结果
[0073][0074]
使用0.1％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa 15天后，测试结果表明：
[0075]-水分：与使用前相比较，水分改善百分比为3.49％。
[0076]-效果：与使用前相比较，低浓度的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa对红血丝的修复效果仅提高了54.55％。
[0077]-纹理：各个时间点具有统计学意义。
[0078]
表3b组0.3％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa检测结果
[0079]
[0080][0081]
使用0.3％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa 15天后，测试结果表明：
[0082]-水分：与使用前相比较，产品15天保湿效果，水分改善百分比为5.44％。
[0083]-效果：与使用前相比较，15天效果大有改善，改善百分比达到79.80％，红血丝表面积变小，同比缩小53.13％。
[0084]-纹理：具有统计学意义。
[0085]
重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa浓度为0.2％～0.4％时，其对红血丝的修复效果相近，本技术以0.3％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa为代表实施例。
[0086]
表4c组0.5％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa检测结果
[0087][0088]
使用0.5％重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa 15天后，测试结果表明：
[0089]
水分：与使用前相比较，水分改善百分比为4.90％。
[0090]
效果：高浓度的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa对红血丝的修复起一定作用，但红血丝表面积只缩小40.40％。
[0091]
纹理：p值小于0.01，具有统计学意义。
[0092]
综上所述，a、b、c三组对比，通过15天试用者的连续使用，4次对水分、效果、红血丝表面积和纹理四个方面进行分析，由检测结果可知浓度为0.2％～0.4％的重组人源ixiii胶原蛋白ixiii 495aa温和不刺激，能够有效缓解面部红血丝问题，起到舒缓修复的作用。