一种具有鳞翅目害虫杀虫活性的菌株及其培养方法与应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有鳞翅目害虫杀虫活性的菌株及其培养方法与应用。


背景技术：

2.鳞翅目(lepidoptera)是昆虫纲的第二大目，其中包括多种对作物生产具有极大破坏性的农业害虫，例如棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等。鳞翅目害虫具有一些特性，如强大的生殖能力、取食能力、易扩散、易对化学杀虫剂产生抗药性等，因此对其防治存在较大困难。长期以来，化学杀虫剂作为害虫防治重要手段，有效控制了多种鳞翅目害虫，起到了保护农业产业的关键作用。然而，化学杀虫剂应用面临着多种问题：例如不合理使用引起的害虫抗药性使药剂使用寿命显著缩短；攻击新靶标的创新药剂研发周期长且成本极高，从国外引进又存在严重滞后性；可能污染环境，毒害高等动物和非靶生物，破坏生态安全。以上弊端迟滞了化学杀虫剂的研发和田间应用，因此开发新的替代措施迫在眉睫。
3.与人工合成的化学杀虫剂相比，运用天然病原细菌和菌源杀虫毒素开发的细菌杀虫剂或转基因抗虫作物对害虫进行生物防治往往具有杀虫特异性强、对环境安全、害虫不易进化抗性、研发成本低等特点，是害虫绿色防控领域的重要方式，具备巨大的应用潜力。例如，昆虫病原细菌苏云金芽孢杆菌bt可杀灭多种害虫，其表达的cry1ac杀虫蛋白基因被构建形成转基因bt棉花防治棉铃虫，在我国大面积种植超过20年，为农民创造了巨大的经济和生态效益。基于bt细菌和短稳杆菌分别开发的细菌杀虫制剂占据了我国微生物杀虫剂市场的大部分份额，并被推荐为害虫绿色防控的主要选择药剂。
4.然而，由于表达单一杀虫蛋白的bt棉在华北棉区的长期使用，棉铃虫田间种群对bt棉进化出了抗性，bt棉的使用寿命受到严重威胁。同时，我国杀虫剂市场中可应急和长期使用的细菌杀虫剂制剂仅有两类，即bt细菌杀虫制剂和短稳杆菌杀虫剂，无法满足害虫防灾减灾和绿色可持续防控需求。因此，兼顾高度宿主特异性、高效杀虫毒力、易于体外培养与传播等特性的病原细菌菌种和菌株的开发和利用是解决棉铃虫bt抗性进化问题的有效措施之一，并且能够补齐我国在绿色高效细菌杀虫剂方面的研究短板，满足我国对害虫绿色可持续综合防控的重要需求。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种具有鳞翅目害虫杀虫活性的菌株haec1，是一种高效、特异、稳定的昆虫病原细菌菌株，能够对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等鳞翅目害虫进行绿色可持续综合防控。
6.本发明还提出上述菌株haec1的培养方法。
7.本发明还提出上述菌株haec1在防治鳞翅目害虫中的应用。
8.本发明还提出一种具有上述菌株haec1的生物防治剂。
9.根据本发明的一个方面，提出了一种具有鳞翅目害虫杀虫活性的菌株haec1，所述菌株haec1的保藏编号为cgmcc no.23485。所述菌株haec1的保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)，保藏时间为2021年9月26日。
10.在本发明的一些实施方式中，所述菌株haec1具有以下(i)～(iii)特征中的至少一种：(i)为肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus；(ii)菌体杆状；(iii)菌体直径约0.7微米，长约1.9微米。
11.在本发明中，利用该菌株持家基因atpd、guaa、mutm、ppsa和reca串联16s rdna序列进行系统进化树分析，菌株为肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus。
12.在本发明中，肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus为革兰氏阴性长杆状细菌，是一类广泛存在于自然环境中的细菌。目前国内外尚未发现该细菌对昆虫具有致病性，尚无从鳞翅目害虫中分离且对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等害虫幼虫具有杀灭活性的细菌的报道。
13.在本发明的一些实施方式中，所述菌株haec1分离自鳞翅目害虫棉铃虫病死幼虫。
14.在本发明的一些优选的实施方式中，所述菌株haec1分离自棉铃虫染病死亡的三龄幼虫。在本发明中，幼虫尸体整体黑化、软化、无异味。
15.在本发明的一些实施方式中，所述鳞翅目害虫包括夜蛾科害虫和菜蛾科害虫中的至少一种。
16.在本发明的一些优选的实施方式中，所述夜蛾科害虫包括棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾和斜纹夜蛾中的至少一种；或所述菜蛾科害虫为小菜蛾。
17.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述菌株haec1对所述鳞翅目害虫具有高水平胃毒杀虫活性。
18.根据本发明的再一个方面，提出了上述菌株haec1的培养方法，包括以下步骤：使用lb培养基，在约28℃温度下进行培养。
19.在本发明的一些实施方式中，所述lb培养基中含有氨苄青霉素。
20.在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤具体包括：利用无菌水稀释haec1，均匀涂布于lb固体培养基表面，培养基中含氨苄青霉素避免杂菌污染，平板置于28℃培养箱，黑暗培养24小时至生长出表面光滑中心略突起的黄白色菌落。在本发明中，该方法为固体培养法。
21.在本发明的一些优选的实施方式中，所述步骤具体包括：将haec1菌悬液或菌落加入lb液体培养基中，培养基含氨苄青霉素避免杂菌污染，菌液置于摇床振荡培养12小时以上至浑浊，温度28℃，转速200rpm。在本发明中，该方法为液体培养法。
22.根据本发明的再一个方面，提出了上述菌株haec1在防治鳞翅目害虫中的应用。
23.根据本发明的再一个方面，提出了一种含有上述菌株haec1的生物防治剂，能够针对鳞翅目害虫进行防治。
24.在本发明的一些实施方式中，所述生物防治剂为菌株haec1的菌悬液。
25.在本发明的一些优选的实施方式中，所述菌悬液的浓度范围为107‑
109cfu/ml。
26.在本发明的一些优选的实施方式中，所述生物防治剂具体通过以下方法进行制备
和使用，菌株haec1通过液体培养法形成的菌悬液利用无菌水稀释，喷洒在幼虫饲料表面，饲料表面平整，表面积2cm2，相应菌悬液体积200μl。
27.在本发明中，菌株haec1通过液体培养法形成109cfu/ml浓度的菌悬液，菌悬液对棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾2龄幼虫口服处理5天的校正死亡率达90％左右。
28.本发明的有益效果在于：1)寄主依赖性弱：本发明菌株分离自棉铃虫罹病幼虫消化道和血淋巴，在正常幼虫体内未发现，能够在人工培养基上进行体外大量培养，说明菌株为典型的兼性病原菌，对寄主的依赖性弱；2)稳定性强：本发明菌株菌悬液在未包埋保护的情况下能够对害虫幼虫持续致病，不受饲料抗生素环境和虫体免疫环境的影响，相对稳定性强；3)胃毒活性：本发明菌株通过经口摄入的方式造成幼虫败血症进而死亡，具有良好的胃毒活性；4)体外培养快速且成本低：本发明菌株利用普通的lb培养基就能够大量、快速增殖，并达到害虫防治所需剂量和状态，对温度、湿度、营养成分等培养条件要求低并且容易达到，成本相对低；5)杀虫特异性强：本发明菌株对鳞翅目害虫特别是夜蛾科害虫棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾幼虫具有良好的杀虫效果，对鞘翅目害虫、双翅目害虫杀虫效果一般，杀虫特异性强。
附图说明
29.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
30.图1为本发明实施例1中菌株haec1在电子显微镜下的菌体细胞形态，其中，a为透射电镜下的菌体形态，b为扫描电镜下的菌体形态；
31.图2为本发明实施例1中利用持家基因atpd、guaa、mutm、ppsa和reca串联16s rrna序列构建的菌株haec1系统进化树；
32.图3为本发明实施例2中菌株haec1经口杀灭棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾2龄幼虫的lc
50
图；
33.图4为本发明实施例4中菌株haec1的生防杀虫制剂对棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾2龄幼虫的口服校正死亡率图。
具体实施方式
34.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
35.实施例1：菌株haec1的鉴定和培养方法
36.本实施例获得了一种对鳞翅目害虫具有胃毒杀虫活性的肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus菌株haec1。该菌株haec1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.23485，保藏时间为2021年9月26日。
37.1.菌株获取途径：该菌株是从棉铃虫染病死亡的三龄幼虫中分离并纯化获得，幼
虫尸体整体黑化、软化、无异味，符合细菌感染的特征，具体分离自棉铃虫罹病幼虫消化道和血淋巴。
38.2.菌株形态特征：该菌株在lb固定培养基上形成的单菌落黄白色、表面光滑、中心略突起，菌体细胞杆状，直径0.7微米左右，长1.9微米左右，生有鞭毛，其形态特征如图1所示，a为菌株haec1在透射电镜下的菌体形态，b为菌株haec1在扫描电镜下的菌体形态。
39.3.菌株的菌属鉴定：该菌株持家基因atpd(序列为seq id no.1)、guaa(序列为seq id no.2)、mutm(序列为seq id no.3)、ppsa(序列为seq id no.4)和reca(序列为seq id no.5)串联16s rdna(序列为seq id no.6)序列与其它细菌进行系统进化树分析显示该菌株为肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus，命名为haec1，其进化树分析如图2所示。
40.本实施例中肠杆菌属细菌enterobacter cancerogenus菌株haec1使用以下方法和步骤进行培养：
41.1.固体培养法：利用无菌水稀释haec1，稀释梯度为10倍，各浓度菌液均匀涂布于lb固体培养基表面，培养基中含氨苄青霉素避免其它细菌污染，平板置于28℃培养箱，黑暗培养24小时，可生长出表面光滑中心略突起的黄白色菌落。lb固体培养基终浓度组成：氯化钠10g/l、酵母提取物5g/l、胰蛋白胨l0 g/l、15g/l琼脂糖，ph7.2，溶剂为蒸馏水。
42.2.液体培养法：将haec1菌悬液或菌落加入lb液体培养基中，培养基含氨苄青霉素避免其它细菌污染，菌液置于摇床振荡培养12小时以上至浑浊，温度28℃，转速200rpm。lb液体培养基终浓度组成：氯化钠10g/l、酵母提取物5g/l、胰蛋白胨l0g/l，ph7.2，溶剂为蒸馏水。
43.实施例2：菌株haec1的杀虫活性
44.1.本实施例采用毒素涂表法明确菌株杀虫毒力水平：将实施例1中液体培养法获得haec1的菌悬液高浓度母液，无菌水稀释，稀释梯度为3倍；各浓度喷洒在幼虫饲料表面，饲料表面平整，表面积2cm2，相应浓度菌悬液体积200μl；自然晾干后喂食棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等鳞翅目害虫二龄幼虫，5天后检测幼虫死亡率，计算获得杀死50％数量幼虫的菌液浓度即lc
50
。按照此方法确定该菌株对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾的lc
50
分别是5.0
×
107cfu/ml、3.0
×
107cfu/ml、1.5
×
108cfu/ml、1.3
×
108cfu/ml和5.6
×
108cfu/ml，结果如下表1所示：
45.表1.菌株haec1对不同种类鳞翅目害虫对的杀虫活性研究
[0046][0047]
上述结果证明菌株haec1对害虫幼虫的毒杀方式是经口摄入发挥胃毒作用造成幼虫死亡，通过经口摄入的方式造成幼虫败血症进而死亡，具有良好的胃毒活性。菌株haec1菌株对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等鳞翅目害虫均具有较强的杀虫活性。
[0048]
2.本实施例制备一种基于菌株haec1用于防治棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾的生防杀虫制剂，生防杀虫制剂为实施例1液体培养法获得的浓度是109cfu/ml的haec1菌悬液。采用毒素涂表法明确该制剂对棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾幼虫的防治效果，具体实验过程为：菌悬液喷洒在幼虫饲料表面，饲料表面平整，表面积2cm2，相应浓度菌悬液体积200μl；自然晾干后喂食棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾二龄幼虫，5天后检测幼虫死亡率，计算获得该制剂对幼虫的校正死亡率。按照此方法确定该制剂对棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率分别是97.7％、95.6％和89.6％，结果如图3所示。
[0049]
本发明提供的haec1菌株单株系可在lb培养基快速大量繁殖，菌悬液可应用于棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾等鳞翅目害虫的防治。对这些鳞翅目害虫采用毒素涂表法生物测定结果表明，该菌株对棉铃虫二龄幼虫的口服lc
50
为5.0
×
107cfu/ml；对甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾二龄幼虫的口服lc
50
分别为3.0
×
107cfu/ml、1.5
×
108cfu/ml、1.3
×
108cfu/ml和5.6
×
108cfu/ml；利用lb培养基扩繁12小时获得的1.1
×
109cfu/ml菌悬液对棉铃虫、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾2龄幼虫的口服校正死亡率分别达97.7％、95.6％和89.6％。以上结果表明haec1对至少5种鳞翅目害虫具有高水平胃毒杀虫活性，具有开发为针对鳞翅目害虫的细菌杀虫剂的重要潜力。
[0050]
实施例3：菌株haec1对不同种群棉铃虫杀虫活性验证
[0051]
本实例选取了实验室内的棉铃虫敏感品系和同年采自中国华北棉区不同地区的棉铃虫田间种群，利用本实施例提供的应用方法检测棉铃虫田间种群对菌株haec1的敏感性，证明菌株haec1对棉铃虫田间种群具有良好的杀虫活性，具有开发为细菌杀虫剂的重要潜力。
[0052]
本实施例的具体实施步骤如下：
[0053]
1.菌株haec1活化：取出冻存于
‑
80℃超低温冰箱的菌株haec1，液体培养法进行活
化，将haec1接种在lb液体培养基中，置于摇床振荡培养8h，温度28℃，转速200rpm；lb液体培养基包括胰蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母提取物5克，蒸馏水1升，ph值7.2，121℃灭菌30min。
[0054]
2.菌株haec1扩大培养：取活化的haec1菌悬液，液体培养法进行扩大培养，按照1:500比例加入lb液体培养基中，置于摇床振荡培养12h，温度28℃，转速200rpm。
[0055]
3.测定扩大培养后获得的菌悬液浓度：利用平板菌落计数法测定菌落形成单位(cfu)的数量，将菌悬液稀释至3
‑9、3
‑
11
、3
‑
13
共3个浓度，各取200μl均匀涂布到lb固体培养基上，每个浓度3个重复，置于28℃恒温培养箱，待菌落长出后统计菌落个数，通过公式“菌液浓度＝菌落数
×
稀释倍数
×
5”计算菌液浓度。lb固体培养基包括胰蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母提取物5克，琼脂糖15克，蒸馏水1升，ph值7.2，121℃灭菌30min。
[0056]
4.制备生物测定用24孔培养板：对每孔表面积为2cm2的24孔培养板进行紫外灭菌30min；称取人工饲料主成分麦胚粉和大豆粉，混合后在破壁机中充分破碎，按照人工饲料配置方法制备；在饲料降温至60℃左右未凝固前，用移液器向24孔培养板每孔加入饲料1ml，拍打使每孔饲料表面平整，制备好的培养板室温冷却后，4℃保存备用。
[0057]
5.配置菌株haec1菌液浓度梯度溶液：利用灭菌的0.01m pbs溶液或无菌水对haec1菌悬液母液进行稀释，以3倍为稀释梯度，分别稀释3
‑1、3
‑2、3
‑3、3
‑4、3
‑5和3
‑6倍6个浓度；每个浓度喷洒至2块24孔培养板，每孔200μl，设置喷洒pbs溶液或无菌水的培养板为对照；室温自然晾干，注意避免饲料与培养板孔壁分离。
[0058]
6.试虫提前饥饿处理：用镊子挑取体型大小一致的棉铃虫敏感品系和同年采自我国华北棉区不同地区的棉铃虫田间种群2龄初期幼虫到空盒中饥饿处理4h，覆盖黑布防止逃逸。
[0059]
7.试虫喂食处理：用毛笔快速拨取饥饿处理过的健康幼虫到24孔培养板中，每孔加入1头幼虫，加黑布和盖子防止幼虫逃逸，用皮筋固定板盖，写好标签，放入26℃无光培养箱中饲养5天。
[0060]
8.试虫死亡率检测：检测幼虫死亡情况，幼虫完全死亡或体重低于5mg(生长受到严重抑制)均认定为死亡，记录每个浓度处理下幼虫死亡数，计算死亡率。
[0061]
9.利用poloplus软件计算菌株haec1对棉铃虫不同种群的lc
50
数值、95％置信限和毒力回归曲线斜率。
[0062]
上述实验的结果为：生物测定结果显示，棉铃虫田间种群对本发明菌株haec1的敏感性如表2所示：
[0063]
表2.不同种群棉铃虫对菌株haec1的敏感性研究
[0064][0065]
菌株haec1对棉铃虫不同田间种群均表现高水平杀虫活性，能够造成田间种群幼虫50％死亡率的菌液浓度均低于1
×
109cfu/ml。河北廊坊、山东夏津和安徽望江田间种群对haec1菌株的敏感性与室内敏感品系scd没有显著性差异。河南开封和江苏盐城田间种群对haec1的敏感性显著低于敏感品系，但浓度为109cfu/ml的haec1菌液能够有效杀死这两个种群几乎全部幼虫，表现高杀虫毒性。因此，本发明提供的菌株haec1对棉铃虫不同田间种群表现良好的杀虫活性，具有开发为高效细菌杀虫剂的潜力。
[0066]
实施例4：菌株haec1对不同种类鳞翅目害虫杀虫活性验证
[0067]
本实例选取了实验室内饲养的甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾敏感品系，利用本发明提供的基于菌株haec1的生防杀虫制剂及应用方法检测不同鳞翅目害虫对本发明菌株haec1的敏感性，说明菌株haec1对鳞翅目害虫具有良好的杀虫活性，具有开发为防治鳞翅目害虫的细菌杀虫剂的重要潜力。
[0068]
本实施例的具体实施步骤如下：
[0069]
1.菌株haec1活化：取出冻存于
‑
80℃超低温冰箱的菌株haec1，液体培养法进行活化，将haec1接种在lb液体培养基中，置于摇床振荡培养8h，温度28℃，转速200rpm。
[0070]
2.菌株haec1扩大培养：取活化的haec1菌悬液，液体培养法进行扩大培养，按照1:500比例加入lb液体培养基中，置于摇床振荡培养12h形成菌悬液，温度28℃，转速200rpm。
[0071]
3.制备生物测定用24孔培养板：对每孔表面积为2cm2的24孔培养板进行紫外灭菌30min；分别称取棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾相应人工饲料主成分，在破壁机中充分破碎，按照人工饲料配置方法制备；在饲料未凝固前，用移液器向24孔培养板每孔加入饲料1ml，拍打使每孔饲料表面平整，制备好的培养板室温冷却后，4℃保存备用。
[0072]
4.喷洒杀虫制剂：将haec1菌悬液喷洒至2块24孔培养板，每孔200μl，设置喷洒pbs溶液或无菌水的培养板为对照；室温自然晾干，注意避免饲料与培养板孔壁分离。
[0073]
5.试虫提前饥饿处理：用镊子挑取体型大小一致的试虫2龄初期幼虫到空盒中饥饿处理4h，覆盖黑布防止逃逸。
[0074]
6.试虫喂食处理：用毛笔快速拨取饥饿处理过的健康幼虫到24孔培养板中，每孔加入1头幼虫，加黑布和盖子防止幼虫逃逸，用皮筋固定板盖，写好标签，放入26℃无光培养
箱中饲养5天。
[0075]
7.试虫死亡率检测：检测幼虫死亡情况，幼虫完全死亡或体重低于5mg(生长受到严重抑制)均认定为死亡，记录每个浓度处理下幼虫死亡数，计算校正死亡率。
[0076]
生物测定结果显示，本实施例基于菌株haec1的生防杀虫制剂对甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾和小菜蛾敏感品系幼虫的校正死亡率如图4所示。本次实施例使用的haec1生防制剂的浓度为8.9
×
108cfu/ml，该制剂对多种鳞翅目害虫幼虫具有较高的杀虫活性。对甜菜夜蛾和草地贪夜蛾幼虫的活性最高，幼虫校正死亡率分别为92％和90％；而斜纹夜蛾和小菜蛾幼虫的校正死亡率分别为75％和50％说明该制剂可用于针对鳞翅目夜蛾科害虫的细菌杀虫制剂开发。
[0077]
以上实施例的结果说明本发明菌株具有开发为高效、特异、成本低廉细菌杀虫剂的重要潜力，有助于解决鳞翅目害虫bt抗性进化问题，补齐我国在绿色高效的生物防治剂和细菌杀虫剂方面的研究短板，满足我国对害虫绿色可持续综合防控的重要需求。
[0078]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。