一种微生物群体感应淬灭复合剂及其应用

1.本发明属于生物技术领域，主要涉及一种微生物群体感应淬灭复合剂及其应用。


背景技术：

2.传统的抗生素和消毒剂由于有较大的药物残留，很多已被禁止使用。针对医药与农业、食品等行业疾病防控“一药难求”的现状，筛选高效低毒，而且没有生态压力的新型病害防治产品是追求的方向，通过开发微生物群体感应淬灭素，抑制微生物的生物膜，使病原微生物丧失保护，实现对病害的控制。对于多数病原微生物而言，其耐药性的产生源自微生物被膜(biofilm)的存在，它形成高度自组织结构具有抵抗抗生素进入的能力；而微生物被膜的形成受群体感应(quorum sensing,qs)信号的调节。如果我们能抑制或者淬灭qs，则有望减少生物被膜的产生，降低病原菌的抗性，起到防病抗病的作用。
3.生物被膜(biofilm)是一种基质膜包被的微生物聚合体，是由细菌吸附于惰性物体如医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将自身菌落聚集缠绕其中形成的膜样物。生物被膜在生活管道、工业生产、医疗器械上形成时，会导致侵蚀和堵塞管道、污染产品、降低热传导和引起细菌感染等，对生产和生活带来许多问题。目前，因为抗生素的过度使用，生物被膜中的细菌产生的抗药性逐渐增强，不仅使抗生素对致病菌的敏感性不断降低，而且还可能改变致病菌的生理和生化特性，使得抗生素耐药性成为全球严重的公共卫生问题。因此，采用非抗生素、安全的生物制剂取代传统的药物，对抑制生物被膜中病原菌的致病性和生物被膜的形成能力来说是非常必要的。
4.微生物可以通过细胞密度依赖性方式感知信号分子，从而调控毒性因子表达，该调控系统通常称为群体感应(quorum sensing系统，qs系统)。该系统可以调控生物被膜的形成以及多种毒力因子，如绿脓菌素和弹性蛋白酶的分泌等。通过引入具有群体感应淬灭效果的微生物被膜抑制剂来破坏或抑制菌群群体感应系统，可以达到控制毒力释放并抑制生物膜结构的目的，它并不对微生物本身进行杀灭，而只是阻断它们之间的通讯交流。因此，群感淬灭剂不会对微生物的生存产生压力，也就不会导致新的“耐药性”产生，可为生物被膜的去除提供新策略。
5.该发明提供的技术具有更广的防治谱且不易产生耐药性，是一种新型病害防控方法，对新时期的病原防治具有重大启发。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供应用：所述应用为弧菌或其制剂在下述任一种的应用：
7.p1)在抑制病原菌生物被膜形成中的应用；
8.p2)在制备抑制病原菌生物被膜形成的产品中的应用；
9.p3)在抑制病原菌毒力因子中的应用；
10.p4)在制备抑制病原菌毒力因子的产品中的应用；
11.p5)在抑制病原菌绿脓素合成中的应用；
12.p6)在制备抑制病原菌绿脓素合成的产品中的应用；
13.p7)在抑制病原菌弹性蛋白酶产生中的应用；
14.p8)在制备抑制病原菌弹性蛋白酶产生的产品中的应用；
15.p9)在抑制病原菌水解酶产生中的应用；
16.p10)在制备抑制病原菌水解酶产生的产品中的应用；
17.p11)在降低病原菌的抗性中的应用；
18.p12)在制备降低病原菌的抗性的产品中的应用；
19.p13)在制备预防和/或治疗病原菌所致疾病的药物中的应用。
20.进一步地，所述的应用中，所述弧菌为下述任一种：
21.v1、所述弧菌为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)和弧菌(vibrio sp.)，所述溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)的菌株号为bh46，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61859；所述弧菌(vibrio sp.)的菌株号为bj07，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61860；
22.v2、所述弧菌为所述溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)；
23.v3、所述弧菌为所述弧菌(vibrio sp.)。
24.所述制剂为含有所述弧菌和/或所述弧菌的代谢产物的菌剂。
25.上述的应用中，p9)和p10)所述水解酶为β
‑
葡萄糖苷酶和磷酸酶。
26.上述的应用中，所述病原菌可为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。
27.本发明的第二个目的是提供弧菌，所述弧菌为下述任一种：
28.v1、所述弧菌为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)和弧菌(vibrio sp.)，所述溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)的菌株号为bh46，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61859；所述弧菌(vibrio sp.)的菌株号为bj07，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61860；
29.v2、所述弧菌为所述溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)；
30.v3、所述弧菌为所述弧菌(vibrio sp.)。
31.本发明的第三个目的是提供弧菌的培养物(发酵产物)，所述培养物是将上述的弧菌在微生物培养基中培养得到的物质。
32.本发明的第四个目的是提供菌剂，所述菌剂含有上述的弧菌或/和上述的弧菌的代谢物或/和上述的培养物。
33.上文中，所述弧菌的代谢物可从所述弧菌的发酵液中获得。所述弧菌的代谢物可为所述弧菌的无菌代谢物或所述弧菌的含菌代谢物。所述弧菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述弧菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述弧菌即得到所述弧菌的无菌代谢物。所述弧菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述弧菌，将含有所述弧菌的发酵液进行灭菌即得到所述弧菌的含菌代谢物。
34.进一步地，上述的菌剂，具有下述至少一种功能：
35.p1)抑制病原菌生物被膜形成；
36.p3)抑制病原菌毒力因子；
37.p5)抑制病原菌绿脓素合成；
38.p7)抑制病原菌弹性蛋白酶产生；
39.p9)抑制病原菌水解酶产生；
40.p11)在降低病原菌的抗性中的应用。
41.本发明第五个方面是提供产品，所述产品含有上述的弧菌、上述的培养物或上述的菌剂。所述产品具有下述至少一种功能：
42.p1)抑制病原菌生物被膜形成；
43.p3)抑制病原菌毒力因子；
44.p5)抑制病原菌绿脓素合成；
45.p7)抑制病原菌弹性蛋白酶产生；
46.p9)抑制病原菌水解酶产生；
47.p11)在降低病原菌的抗性中的应用。
48.上文中，所述产品可为药物、食品、保健品、动物饲料或动物饲料添加剂。
49.上述菌剂的活性成分可为所述弧菌或/和所述弧菌的代谢物或/和上述培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
50.上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
51.上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，包括但不限于液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂等。
52.含有所述菌剂的产品也属于本发明的保护范围。所述产品包括但不限于药物、食品、保健品、动物饲料或动物饲料添加剂。
53.上述药物中，所述药物可包括药学上可接受的载体。所述载体的材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、微球、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊
等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
54.上述药物可为人用药或动物用药(兽用药)。上述药物中，所述药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、微球、透皮剂、口含片、栓剂或冻干粉针剂等。
55.本发明还提供上述菌剂的制备方法，所述方法包括在微生物培养基中培养溶藻弧菌bh46、收集培养物的步骤，和/或在微生物培养基中培养弧菌bj07、收集培养物的步骤。
56.所述溶藻弧菌bh46为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61859；所述弧菌bj07为弧菌(vibrio sp.)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏登记号为gdmcc no.61860。
57.上述培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。
58.术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物(培养容器内的所有物质)的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。
59.进一步地，所述方法还包括将收集的培养物离心、过滤的步骤。
60.上文中，所述离心的转速具体为12000r/min，所述离心的时间具体为10min，所述离心半径具体为13.5cm，所述离心温度具体为4℃；所述过滤采用的滤膜孔径具体为0.22μm。
61.上文中所述方法还包括将将滤液混和的步骤。
62.上文中所述将滤液混合为按照体积比1:1的配比混合，得到复合制剂。
63.上文中，所述微生物培养基包括溶质和溶剂，所述溶质为：酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。所述溶剂为水。
64.上文中，上述方法中所述发酵培养的温度可为28
‑
30℃。所述发酵培养的时间可为24
‑
28小时；所述发酵培养的方式可为旋转震荡培养，所述旋转震荡培养的转速可为150
‑
220转/分钟，具体如180转/分钟，旋转半径可为13.5cm。
65.本发明还提供鉴定或辅助鉴定上述弧菌的抗菌谱的方法，所述方法包括(a)或(b)：
66.所述(a)包括如下(1)和(2)的步骤：
67.(1)向待测病原菌的生长体系中添加上述弧菌和/或上述培养物作为实验组，以不添加上述弧菌和/或上述培养物的所述待测病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述病原菌的生物被膜的形成总量；
68.(2)若所述实验组中所述待测病原菌的生物被膜形成总量低于所述对照组中所述待测病原菌的生物被膜形成总量，则所述待检测病原菌属于或候选属于上述弧菌的抗菌谱；反之，则所述待检测病原菌不属于或候选不属于上述弧菌的抗菌谱；
69.所述(b)包括如下(3)和(4)的步骤：
70.(3)向待测病原菌的生长体系中添加上述弧菌和/或上述培养物作为实验组，以不添加上述弧菌和/或上述培养物的所述待测病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述待测病原菌的毒力因子的产生量；
71.(4)若所述实验组中所述待测病原菌的毒力因子的产生量低于所述对照组中所述待测病原菌的毒力因子的产生量，则所述待测病原菌属于或候选属于上述弧菌的抗菌谱；反之，则所述待检测菌不属于或候选不属于上述弧菌的抗菌谱。
72.所述待测病原菌的生长体系中的体积分数具体可为25％；所述待测病原菌的生长体系的od
600nm
可为0.05；所述待测病原菌的生长体系中的培养基具体可为lb液体培养基。
73.在本发明中，所述生物被膜均为微生物被膜。
74.现有的抗生素使用导致耐药性和药物残留过多，环境风险和食品安全受到强烈冲击。开发的一些群体感应抑制剂都是基于单细胞的产物，效果有限。本发明所提供的溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)bh46与弧菌(vibrio sp.)bj07可以分泌群体感应抑制剂，均具有抑制病原菌生物被膜形成和减毒的作用。与所述的单一菌株制剂相比，复合制剂对于抑制病原菌生物被膜的形成，降低病原菌的毒力的效果更好、更稳定，且不影响病原菌的生长。
75.保藏说明1
76.菌种名称：溶藻弧菌
77.拉丁名：vibrio alginolyticus
78.菌株编号：bh46
79.保藏机构简称：gdmcc
80.地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
81.保藏日期：2021年8月11日
82.保藏中心登记入册编号：gdmcc no.61859
83.保藏说明2
84.菌种名称：弧菌
85.拉丁名：vibrio sp.
86.菌株编号：bj07
87.保藏机构：广东省微生物菌种保藏中心
88.保藏机构简称：gdmcc
89.地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
90.保藏日期：2021年8月11日
91.保藏中心登记入册编号：gdmcc no.61860
附图说明
92.图1为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌生物被膜形成的抑制效果。
93.图2为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌绿脓菌素分泌的抑制效果。
94.图3为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组
(ab)对病原菌弹性蛋白酶的抑制效果。
95.图4为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌β
‑
葡萄糖苷酶的抑制效果。
96.图5为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌磷酸酶的抑制效果。
97.图6为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌生物被膜结构的影响。
98.图7为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)和氨苄青霉素(ampicillin)对病原菌生长的影响情况。
99.图8为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)对病原菌qs基因表达的影响情况。
100.图9a为溶藻弧菌bh46在lb固体培养基上的培养形态。
101.图9b为弧菌bj07在lb固体培养基上的培养形态。
具体实施方式
102.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
103.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
104.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
105.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
106.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)pao1在文献“strain identification and quorum sensing inhibition characterization of marine
‑
derived rhizobium sp.nao1.hong chang,jin zhou,xiaoshan zhu,shenchen yu,lu chen hui jin and zhonghua cai.royal society open science,volume 4,issue 3,22march 2017.”中公开，由本实验室保存。公众可从申请人获得上述生物材料，所得上述生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。该菌为致病菌，经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了该菌可造成死亡。
107.muf
‑
β
‑
d葡糖苷(sigma
‑
aldrich公司，产品目录号：m3633)，muf
‑
磷酸盐(sigma
‑
aldrich公司，产品目录号：m8883)
108.lb固体培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水1000ml，琼脂15g，ph7.0。
109.lb液体培养基的组成为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，去离子水1000ml，ph7.0。
110.2216e液体培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶
0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g，去离子水1000ml，ph7.6。
111.2216e固体培养基的组成为：蛋蛋白胨5.0g，酵母浸粉1.0g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶0.034g，硼酸0.022g，硅酸钠0.004g，氟化钠0.0024g，硝酸铵0.0016g，磷酸氢二钠0.008g，去离子水1000ml，琼脂15g，ph7.6。
112.弹性蛋白缓冲液：刚果红弹性蛋白(合肥博美生物科技公司，产品目录号：ge5050)1g，100mm氯化钙0.5ml，ph7.2 tris
‑
hcl 50μl，去离子水50ml，ph7.0。
113.下述实施例采用spss19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值
±
标准偏差表示，采用one
‑
way anova检验，p＜0.05(*)表示具有显著性差异，p＜0.01(**)表示具有极显著性差异，p＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
114.实施例1、溶藻弧菌bh46与弧菌bj07的获取
115.发明人团队在中国三亚地区采集到白化(病态)的鹿角珊瑚，从珊瑚组织上经过分离、筛选、纯化后获得共计100余株菌株，对获得的菌株进行生化检测和性能检测实验，最终发现其中的bh46与bj07具有群体感应抑制或淬灭的能力。菌株bh46的形态学特征为：菌落大小2
‑
3mm，浅黄色，边缘整齐、光滑，赋有光泽(如图9a)；其具有如序列表中序列1所示的16s rdna序列。
116.菌株bj07的形态学特征为：菌落大小1
‑
2mm，浅黄色，边缘分散且少量皱褶，菌落之间有少量黏连(如图9b)；其具有如序列表中序列2所示的16s rdna序列。
117.获得的bh46与bj07的16s rdna序列，在ncbi数据库中进行blast比对分析，结果显示，bh46菌株为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)；bj07为弧菌(vibrio sp.)。
118.菌株号为bh46的溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)，于2021年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：gdmcc)，其保藏登记号为gdmcc no.61859，以下简称溶藻弧菌bh46；菌株号为bj07的弧菌(vibrio sp.)，于2021年8月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：gdmcc)，其保藏登记号为gdmcc no.61860，以下简称弧菌bj07。
119.实施例2、复合制剂抑制病原菌生物被膜的检测
120.2.1、溶藻弧菌bh46与弧菌bj07的发酵培养以及复合制剂的制备
121.将
‑
80℃的冰箱中保种的实施例1得到溶藻弧菌bh46取出，室温解冻后，用接种环将溶藻弧菌bh46划线接种到2216e固体培养基平板，28℃恒温培养，直至长出清晰可见的单克隆。分别从中挑出单克隆于1ml的2216e液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养过夜。各取1ml菌液分别加入250ml含有100ml lb液体培养基的锥形瓶中，28℃，180r/min，(离心转头半径为13.5cm)培养24h
‑
36h，直至培养基营养成分基本耗尽，细胞密度不再增加为止。得到溶藻弧菌bh46发酵液，该溶藻弧菌bh46发酵液中溶藻弧菌bh46的含量为od
600nm
＝3.2。
122.将上述溶藻弧菌bh46发酵液在4℃，12000r/min，离心20min(离心半径为13.5cm)，取上清液。将获得的上清液过0.22μm滤膜过滤(除去剩余菌液和杂质)，获取滤液，该滤液为溶藻弧菌bh46过滤液(溶藻弧菌bh46的无菌代谢物)，保存在无菌容器中，4℃保存备用。
123.将
‑
80℃的冰箱中保种的实施例1得到弧菌bj07取出，室温解冻后，用接种环分别将弧菌bj07划线接种到2216e固体培养基平板，28℃恒温培养，直至长出清晰可见的单克隆。分别从中挑出单克隆于1ml的2216e液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养过夜。各取
1ml菌液分别加入250ml含有100ml lb液体培养基的锥形瓶中，28℃，180r/min，(离心转头半径为13.5cm)培养24h～36h，直至培养基营养成分基本耗尽，细胞密度不再增加为止。得到弧菌bj07发酵液，该弧菌bj07发酵液中弧菌bj07的含量为或提供od
600nm
＝3.4。
124.收集弧菌bj07的发酵液，4℃，12000r/min，离心20min(离心半径为13.5cm)，取上清液。将获得的上清液过0.22μm滤膜过滤(除去剩余菌液和杂质)，获取滤液，得到弧菌bj07过滤液(弧菌bj07的无菌代谢物)，保存在无菌容器中，4℃保存备用。
125.在超净工作台中，将上述溶藻弧菌bh46过滤液与弧菌bj07过滤液按照体积比1∶1的配比混和，获得的混合溶液称为复合制剂，保存在无菌容器中，4℃保存备用。
126.2.2、病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的培养
127.本发明所用实验菌株为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，所用培养基为lb培养基。液体培养时，摇床转速为180r/min，温度为37℃，培养时间9h，得到铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
128.2.3、检测复合制剂对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)生物被膜的抑制效果。
129.2.3.1、将2.2得到的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用灭菌lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
130.2.3.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)(表1)。分别进行如下处理
131.2.3.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck)：将稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液加入到96孔板中，150μl/孔，再向各孔中加入50μl灭菌lb液体培养基，每个孔中液体总体积为200μl，。设置3个重复。盖上板盖，37℃下静置培养48小时。
132.2.3.2.2、bh46滤液组(a)：与2.3.2.1的区别仅在于将50μl灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的溶藻弧菌bh46过滤液，其它操作均相同。
133.2.3.2.3、bj07滤液组(b)：与2.3.2.1的区别仅在于将50μl灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的弧菌bj07过滤液，其它操作均相同。
134.2.3.2.4、复合制剂组(ab)：与2.3.2.1的区别仅在于将50μl灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的复合制剂，其它操作均相同。
135.表1不同制剂对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果实验设计
[0136][0137]
2.3.3、结果测定
[0138]
小心吸走培养基，用无菌水轻柔清洗平板，加入1％(1g/100ml)结晶紫染液200μl，室温染色20min，倒去染料，用无菌水温和缓慢地冲掉浮色，室温下自然干燥30min。
[0139]
之后加入200μl 30％(体积比)的冰乙酸洗脱，收集洗脱液，在570nm处测定经结晶紫染色步骤后洗脱菌液的吸光值，以表征病原菌生物被膜合成的量。其原理在于：结晶紫是碱性染料，可以与细胞核中的核酸结合把细胞核染成蓝色。在570nm下检测临界od值(空白孔平均值加上标准差而得到的od值，即灭菌lb液体培养基实验组的od
570nm
)，根据实验测得的od值与临界od值进行比较，判断菌株的生物膜形成能力。检测结果如图1所示，从图中可以看出，与灭菌lb液体培养基、bh46滤液、bj07滤液组相比，加入了步骤1得到的复合制剂组，对病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)生物被膜的形成均具有明显的抑制作用(p<0.01，差异极显著)。
[0140]
实施例3、检测复合制剂抑制病原菌绿脓菌素分泌的抑制效果
[0141]
3.1、将实施例2中2.2得到的活化的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
[0142]
(2)将1.5ml稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液加入10ml的无菌摇菌管中，再向各管中分别加入0.5ml的灭菌lb液体培养基、实施例2步骤1得到的滤液(bh46滤液、bj07滤液和所述复合制剂)。灭菌lb液体培养基、各个制剂体积占总体积的25％。每组设置3个重复。37℃下振荡培养2h后再静置培养36h。实验分组见表1。
[0143]
3.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)(表1)。分别进行如下处理：
[0144]
3.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck)：将1.5ml稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液加入10ml的无菌摇菌管中，再向各管中分别加入0.5ml的灭菌lb液体培养基，设置3个重复，每个无菌管中液体总体积为2ml，灭菌lb液体培养基体积占总体积的25％。37℃下振荡培养2h后再静置培养36h。
[0145]
3.2.2、bh46滤液组(a)：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml的灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的溶藻弧菌bh46过滤液，其它操作均相同。
[0146]
3.2.3、bj07滤液组(b)：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的弧菌bj07过滤液，其它操作均相同。
[0147]
3.2.4、复合制剂组(ab)：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的复合制剂，其它操作均相同。
[0148]
3.3、结果测定
[0149]
培养结束后，收集上述培养液，12000r/min离心2min，收集上清液，加入chcl3萃取，上下颠倒振荡，静置2h分层后，收集下层液体，加入800μl 2mol/l hcl萃取，充分混合，静置30min分层后，收集上层液体，12000r/min离心2min，收集300μl上层液体，加入96孔板中，利用酶标仪在520nm处测量各个实验组中的吸光值，以表征绿脓菌素的含量。检测原理为：绿脓菌素的氧化还原电位eo
′
＝
‑
0.034v，它可发生可逆的氧化还原作用，氧化型呈蓝色(碱性时)和红色(酸性时)，变色点的pk＝5.0；还原型无色，但在酸性条件下出现氧化还原的中间阶段(绿色)。因此，在改变酸碱性条件下能够呈现不同的颜色，可以用od
520nm
反应出来。
[0150]
检测结果如图2所示，从图中可以看出，与灭菌lb液体培养基、bh46滤液、bj07滤液组相比，加入了步骤1得到的复合制剂组对抑制病原菌绿脓素的分泌具有更明显的抑制作
用(p<0.05，差异显著)。
[0151]
实施例4、复合制剂抑制病原菌毒力因子的检测
[0152]
4.1、检测复合制剂对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)弹性蛋白酶的抑制效果
[0153]
4.1.1、将实施例2中2.2得到的活化的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
[0154]
4.1.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)(表1)。分别进行如下处理：
[0155]
4.1.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck)：将1.5ml稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液加入10ml的无菌摇菌管中，再向各管中分别加入0.5ml的灭菌lb液体培养基，设置3个重复，每个无菌管中液体总体积为2ml，灭菌lb液体培养基体积占总体积的25％。放入摇床中，180r/min，37℃培养24小时后，4℃，12000g/min，离心5分钟，取离心上清液，标记备用。
[0156]
4.1.2.2、bh46滤液组(a)：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml的灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的溶藻弧菌bh46过滤液，其它操作均相同。
[0157]
4.1.2.3、bj07滤液组(b)：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的弧菌bj07过滤液，其它操作均相同。
[0158]
4.1.2.4、复合制剂组(ab))：与3.2.1的区别仅在于将0.5ml灭菌lb液体培养基替换为0.5ml实施例2中2.1所述的复合制剂，其它操作均相同。
[0159]
4.1.3、取上述各组获得500μl离心后的上清液分别加入1ml弹性蛋白缓冲液，振荡共培养18h，加入600μl浓度为0.1m的edta终止反应，离心去沉淀(10000r/min，2min)，测定od
495nm
以表征病原菌弹性蛋白酶合成量的多少。实验重复三次，结果取平均值。检测原理为：弹性蛋白酶与弹性蛋白底物共价结合反应后，会形成反应前后的比色差异。弹性蛋白酶浓度与od
495nm
之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出弹性蛋白酶的浓度。
[0160]
检测结果如图3所示，从图中可以看出，与灭菌lb液体培养基、bh46滤液、bj07滤液组相比，加入了步骤1得到的复合制剂组对病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的弹性蛋白的含量显著降低，酶的产量均具有明显的抑制作用(p<0.05，差异显著)。
[0161]
4.2、检测复合制剂对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)水解酶的抑制效果
[0162]
4.2.1、将实施例2中2.2得到的活化的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
[0163]
4.2.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组(b)和复合制剂组(ab)(表1)。分别进行如下处理：
[0164]
4.2.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck)：将1.5ml稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液加入10ml的无菌摇菌管中，再向各管中分别加入0.5ml的灭菌lb液体培养基，设置3个重复，每个无菌管中液体总体积为2ml，灭菌lb液体培养基体积
baclighttm bacterial viability kit(molecular probes inc)，将其中的syto9和pi染液按如下比例稀释，syto9：pi：蒸馏水＝1.5μl：1.5μl：1ml，振荡混匀(避光保存)。
[0180]
取出各个实验组中的盖玻片，擦去盖玻片底部菌液，用0.9％(0.9g/100ml)的氯化钠溶液清洗，自然晾干，在每个盖玻片上滴加200μl步骤(3)配制好的荧光染料(注意避光)，黑暗中染色30min，自然晾干后，放置共聚焦显微镜上观察，红色为死菌，绿色为活菌。检测结果如图6所示，从图中可以看出，灭菌lb液体培养基组形成了完整连续的生物被膜，视野中活菌占了绝大多数；bh46滤液、bj07滤液组中的生物被膜成稀疏的网状或有孔洞；复合制剂组的盖玻片几乎无生物被膜，只是出现少量小块分散状的红色死菌，说明加入了步骤1得到的复合制剂有效地抑制生物被膜的形成。
[0181]
实施例6、复合制剂对对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)生长的影响检测
[0182]
6.1、将实施例2中2.2得到的活化的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
[0183]
6.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck))、bh46滤液组(a))、bj07滤液组(b))和复合制剂组(ab))(表1)。分别进行如下处理：
[0184]
6.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck))：向150μl稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液中加入50μl灭菌lb液体培养基；在灭菌lb液体培养基组的基础上加入5μl浓度为100μg/ml氨苄青霉素。每组设置3个重复。在37℃条件下静置培养24h后，测定od
600nm
值。
[0185]
6.2.2、bh46滤液组(a)：与6.2.1的区别在于将50μl的灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的溶藻弧菌bh46过滤液，不添加氨苄青霉素，其它操作均相同。
[0186]
623、bj07滤液组(b)：与621的区别仅在于将50μl灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的弧菌bj07过滤液，不添加氨苄青霉素，其它操作均相同。
[0187]
6.2.4、复合制剂组(ab)：与6.2.1的区别仅在于将50μl灭菌lb液体培养基替换为50μl实施例2中2.1所述的复合制剂，不添加氨苄青霉素，其它操作均相同。
[0188]
6.3、检测结果如图7所示，从图上可以看出，加入灭菌lb液体培养基、实施例2步骤1得到的滤液(bh46滤液、bj07滤液、复合制剂)组的od
600
值之间没有显著性差异(p>0.05，无差异)，而在加入了氨苄青霉素组的od
600
值与上述组之间具有显著性差异(p<0.01，差异极显著)，这表明，实施例2步骤1得到的滤液(bh46滤液、bj07滤液和所述复合制剂)并不影响病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的生长。
[0189]
实施例7、复合制剂对铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)qs基因表达的影响检测
[0190]
微生物的群体感应(qs)系统调节生物被膜形成和许多毒力因子的表达。为了进一步研究所述复合制剂是否对qs调节系统产生了影响，设计实验如下：
[0191]
7.1、将实施例2中2.2得到的活化的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的菌液用lb液体培养基稀释至od
600nm
为0.05，得到稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液。
[0192]
7.2、实验分为4组，分别为灭菌lb液体培养基组(ck)、bh46滤液组(a)、bj07滤液组
(b)和复合制剂组(ab)(表1)。分别进行如下处理：
[0193]
7.2.1、灭菌lb液体培养基组(ck)：向75ml稀释后的铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)菌液中加入25ml灭菌lb液体培养基，每组设置3个重复，灭菌lb液体培养基体积占总体积的25％。放入摇床中，180r/min，37℃条件下培养24h，离心收集菌体。
[0194]
7.2.2、bh46滤液组(a)：与7.2.1的区别在于将75ml的灭菌lb液体培养基替换为75ml步骤1的溶藻弧菌bh46过滤液，其它操作均相同。
[0195]
7.2.3、bj07滤液组(b)：与7.2.1的区别仅在于将75ml灭菌lb液体培养基替换为75ml步骤1的弧菌bj07过滤液，其它操作均相同。
[0196]
7.2.4、复合制剂组(ab)：与7.2.1的区别仅在于将75ml灭菌lb液体培养基替换为75ml步骤1的复合制剂，其它操作均相同。
[0197]
7.3、rna抽提(目录号：er501
‑
01)、反转录(目录号：at341
‑
01)及定量pcr(目录号：aq601
‑
01)均按照北京全式金生物技术有限公司试剂说明书及abi 7300仪器说明书进行。按操作说明，建立20μl反应体系，检测铜绿假单胞菌的5个群体感应相关调节基因(表2)lasi、lasr lasa、rhli、pqsa的表达情况，以铜绿假单胞16srrna作为内参基因。
[0198]
表2、qs基因序列及引物
[0199][0200]
检测结果如图8所示，从图上可以看出，与灭菌lb液体培养基、bh46滤液、bj07滤液组相比，加入了步骤1得到的复合制剂组中的病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的5个群体感应相关调节基因的表达水平均下调，这表明所述复合制剂对病原菌铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的群体感应系统具有明显
[0201]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。