一种控制水稻花时提前的相关蛋白及其编码基因

1.本发明属于水稻基因工程技术领域，涉及一种控制水稻花时提前的相关蛋白及其编码基因。


背景技术：

2.水稻(oryza sativa l.)是我国重要的粮食作物，杂交水稻为我国的粮食安全做出了重要保障。多年来，杂交水稻的制种成本一直居高不下，其中制种产量不高是一个重要的原因。研究表明限制杂交水稻制种产量的主要因素是不育系异交结实率低，而不育系的开花习性是影响异交结实率的决定因素之一。通常不育系由于其不育胞质的负效应，每天的颖花开颖时间一般比恢复系迟，制种时花时父早母迟，造成不育系许多颖花错失授粉时机而不能结实。从遗传改良角度来看，对花时提早材料的发掘和利用是从根本上解决水稻制种花时不遇问题的有效途径。本文对水稻花时的调控特性、性状的观察、遗传研究和花时调节等方面进行综述，以期为杂交水稻育种、制种及花时相关课题的研究提供研究理论基础。
3.水稻花时的概念在以往的研究中被分为两点：1)指的是第一朵水稻颖花从开颖到闭颖的时间。2)指的是大田群体颖花即抽穗扬花期水稻在1d内开花时间或开花持续时间长度，这个过程分为始花、盛花和末花，通常指的是开花高峰或盛花时。对于花时的研究，基本上是以大田群体颖花研究为主。开闭颖的时间快慢既受品种特性影响，又受环境因素影响，在众多影响水稻开颖的外在因素中，温度是最重要的影响因子。一天当中水稻颖花开放的迟早主要受当日气温的制约，由于温度的高低而会有所提早或延迟。据王忠等报道，将稻穗浸于0℃～10℃冷水后置于室温20℃～30℃或用35℃～45℃的温水浸穗均能促进开颖，说明不论高温处理还是低温处理后置于室温，只要增温就可促进其开颖。水稻开花的最适湿度是70％
‑
80％，在相同温度条件下，湿度较低时开花较多，过湿对花粉萌发有影响。也有研究表明水稻开花需要充足的光照，在黑暗或弱光下，成熟水稻的开花将被限制，但暴露于充足的阳光下几分钟就可诱导开花，另外摩擦稻穗也能促进水稻颖花的开放。水稻是高温短日照自花授粉作物，在长期进化过程中形成有利于自交而不利于异交的开花习性、植株性状、花器构造等特点。而杂交稻选育要求不育系要有好的异交习性，这是决定该不育系是否有生产应用前景的基本前提。水稻异交习性是指在非人工强制杂交条件下，不育系在开花习性、植株性状和花器构造等方面适应于外源花粉供应的习性。开花习性指开花时间(群体始花时间、盛花时间、终花时间)开颖幅度等，主要影响父母本的花时相遇程度以及母本接受父本花粉的能力。
4.对于开花时间的遗传研究，王建军等认为水稻早花时受一对显性基因控制；孙义伟用早花时籼稻材料测64和迟花时粳稻材料p4、02428进行花时遗传研究，结果表明早花时为部分显性；sheehy等发现有些野生稻资源具有早花时特性；nakagawa等对世界各地的水稻资源花时调查显示材料间花时呈正态分布；jagadish等在普通野生稻中发现了一个早花时资源cg14；pham等利用粳稻日本晴和亚洲野生稻材料w630构建的回交群体，分别在第4和
5染色体上定位了两个和花时相关的qtl；thanh等利用籼稻和普通野生稻构建的回交群体，共检测到3个早花时基因，分别位于第4、5和10染色体上，累计效应至少能促进颖花提前30分钟开花；万国等利用早花时和晚花时粳稻杂交构建的f2群体，采用复合区间作图方法，共检测到4个影响花时的qtl，分别位于第1、1、10和12染色体上。对于花时提早的遗传改良，国际水稻所用非洲栽培稻的早花时材料与ir36杂交，从后代中获得了比ir36开花提早一个小时的材料；孙义伟等认为采用籼粳杂交方式可以将籼稻的早花习性转育到粳稻；hideyuki等利用回交方式，将野生稻早花时基因转育到栽培稻中，并将该基因初步定位在第3染色体上，命名为qemf3。
5.水稻开闭颖的过程已做许多研究，一致认为开闭颖是分别由水稻浆片吸水膨胀、浆片失水萎蔫引起的，但对浆片吸水和失水的机理，有许多不同的看法：前人对水稻开闭颖的过程已做许多研究，一致认为开闭颖分别是由水稻浆片吸水膨胀、浆片失水萎蔫引起的。但对浆片吸水和失水的机理，有许多不同的看法；仲尾太郎等人认为浆片吸水是有原先存在浆片中的单糖或多糖转化成单y糖使渗透压提高引起的，而也有其他研究学者认为浆片中的渗透物质的提高来自小穗轴中同化物的输入；王忠等人却认为，开颖时浆片的吸水受细胞膨压所控制，而膨压的下降依赖于细胞壁的松弛，只要浆片表皮细胞的壁松弛，就会使细胞膨压下降而引起细胞吸水；evans等认为co2通过降低ph而改变细胞壁的结构，削弱或打破细胞中多聚物的联系，并且能通过激活细胞壁松弛酶的性来诱导植物细胞壁的松弛(evans，1971)；mc queen
‑
mason曾报道，从黄瓜下胚轴里提取出的两种活性蛋白在酸性条件下具有使细胞壁松弛的效应，他们将这两种蛋白称为膨胀素，认为是使细胞壁松弛的酶，cosgrove指出膨胀素在细胞壁扩展中起的主要作用，木葡萄糖内转葡糖基酶、内聚葡聚糖酶和其他的酶在改变细胞壁结构中有着调节膨胀素的作用；
6.浆片主要是由初生细胞壁组成的微小组织，其细胞壁由致密的纤维素微纤维丝与多聚糖、嵌入在胶多糖基质交织而成。其纤维素与半纤维素的交联密度决定了细胞壁的拉伸强度。对于大多数双子叶植物和非禾本科植物单子叶而言，木葡聚糖是一类存在于所有高等植物细胞壁中的半纤维素类多糖。它的主链由β
‑
d
‑
(1
‑
4)
‑
葡聚糖骨架构成，骨架中约75％的葡萄糖残基的6
‑
位羟基连有α
‑
d
‑
木糖基。部分α
‑
d
‑
木糖基的2
‑
位羟基还连有β
‑
半乳糖基或α(1
‑
2)岩藻糖基
‑
β(1
‑
2)半乳糖基部分。这种多糖被认为是由纤维素
‑
半纤维素构成的网状结构的一种不可缺少的多糖，组成了柔韧和可扩展的细胞壁。大多数木葡聚糖的核心结构为xxxg，由三个连续的葡萄糖残基被d
‑
木糖取代在(1
→
6)键(x)和一个不分枝的第四糖基残基(g)。在拟南芥中,murus3(mur3)基因编码一种木葡聚糖半乳糖转移酶，该酶专门将半乳糖添加到木糖上第三个木糖残基位于xxxg核心结构内。因为没有附加的半乳糖残基到第三个木糖单位导致损失mur3的功能失活。而拟南芥中的atfut1早在1999年已被克隆，其在拟南芥基因组中具有10个家族成员。atfut1为组成型表达，在所有的组织部位都高度表达。但其他家族成员(atfut2
‑
10)在植物中表达丰度较低，且具有特异表达性。在拟南芥种的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖ⅰ(rgⅰ)rgⅱ、阿拉伯半乳聚糖、n联聚糖和木葡聚糖都有岩藻糖残基的存在，因此这些编码特定器官木葡聚糖转移酶基因可能作用于其他多糖的岩藻糖基化。
7.浆片细胞壁是一个复杂的网状结构，其主要由纤维素、半纤维素、果胶质、可伸缩性蛋白组成。因此，其组成分的改变会影响其细胞壁的结构建成，改变其渗透压与吸水性，
这与水稻开颖存在一定关联。


技术实现要素：

8.为了解决不育系开颖时间迟的技术问题，本发明提供了一种控制水稻花时提前的相关蛋白，命名为osemt3，通过基因编辑敲除osemt3蛋白的编码基因能够获得水稻花时提前基因，开颖时间显著提前，有利于提高杂交水稻制种授粉率。
9.本发明还提供了一种控制水稻花时提前的相关蛋白的编码基因。
10.本发明通过以下技术方案实现：
11.本发明提供了一种控制水稻花时提前的相关蛋白，所述相关蛋白命名为osemt3，所述相关蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
12.基于同一发明构思，本发明提供了一种控制水稻花时提前的相关蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13.一种控制水稻花时提前的相关蛋白的编码基因在三系杂交制种或水稻产量安全生产中的应用。
14.基于同一发明构思，本发明提供了一种控制水稻花时提前的早花基因，所述早花基因的核苷酸序列如seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5中的任意一项所示。
15.进一步的，所述早花基因通过对相关蛋白osemt3的编码基因进行基因编辑获得，所述基因编辑通过crispr/cas9系统进行，所述基因编辑采用的靶标序列的核苷酸序列如seq id no.6所示。
16.一种控制水稻花时提前的早花基因在三系育种或选育耐高温水稻品种中的应用。
17.一种用于敲除相关蛋白osemt3的编码基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示。
18.一种用于敲除相关蛋白osemt3的编码基因的敲除载体，所述敲除载体osu6启动子的核苷酸序列如seq id no.9和seq id no.10所示。
19.一种用于敲除相关蛋白osemt3的编码基因的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如seq id no.11和seq id no.12所示。
20.一种花时提前水稻品种的制备方法，所述制备方法包括：
21.构建含有所述靶标序列的crispr/cas9系统表达载体；
22.将所述表达载体转化到晚花时粳型水稻品种中；
23.筛选并鉴定出相关蛋白osemt3的编码基因被敲除的转基因纯合株系，获得花时提前水稻品种。
24.一种花时提前的水稻品种的育种方法，所述育种方法包括：
25.以花时提前水稻品种为非轮回亲本，以农艺性状优良的恢复系或保持系品种作为轮回亲本进行杂交，获得杂交后代，所述花时提前水稻品种通过上述一种花时提前水稻品种的制备方法制备；
26.采用分子标记对所述杂交后代进行辅助选择，获得带有上述早花基因和且农艺性状倾向于轮回亲本的材料，连续回交5
‑
8代后自交1代得到bc5‑8f2，选择花时提前性状不分离的株系，获得花时提前的水稻恢复系或保持系品种；
27.将水稻恢复系或保持系品种株系分别与其配套的不育系杂交，其后代种子用来不
育系制种或繁殖早花时杂交稻种子，而其制种的不育系株系在与其配套恢复系杂交，其后代即为生产用种。
28.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
29.1.本发明一种控制水稻花时提前的相关蛋白，命名为osemt3，通过基因编辑敲除osemt3蛋白的编码基因能够获得水稻花时提前基因，开颖时间显著提前，有利于提高杂交水稻制种授粉率。
30.2.本发明一种控制水稻花时提前的相关蛋白的编码基因，作为蛋白osemt3的编码基因，可通过基因编辑敲除获得水稻花时提前基因，显著提前水稻开颖时间，且对高温光照等调教不为敏感，可用于不育系制种与培育新型耐高温品种，该编码基因在水稻花时调节领域的应用为本发明首次提出。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
32.图1为野生宜香1b和突变体emt3的植株对比照片：左边为野生型宜香1b，右边为突变体emt3；
33.图2为野生型宜香1b和突变体emt3的局部稻穗开颖对比图：拍摄时间为早上9：00；其中上面wt为野生型宜香1b，下面突变体为emt3；
34.图3为野生型宜香1b和突变体emt3的株高、穗实粒数、千粒重统计柱形图：其中wt为野生型宜香1b，突变体为emt3。
35.图4为基因定位图：图中1为突变体emt3,2为亲本nip,3和34为交换单株，其余的为f2突变体性状单株；
36.图5为基因定位结合mutatmap全基因组重测序的连说染色体曼哈顿分析图；
37.图6为引物osemt3扩增后的电泳图谱：其中1为5000bp dna marker,2为野生型宜香1b基因组中的osemt3基因；3和4为突变体emt3基因组中的osemt3基因。
38.图7为氨基酸序列图：所标位点即为突变体emt3的突变位点。
39.图8为转crispr/cas9
‑
osemt3敲除阳性植株t1植株比对图：其中nip为阴性对照粳稻品种日本晴，ko
‑
1、ko
‑
2和ko
‑
3分别是独立转基因阳性株系；
40.图9为转crispr/cas9
‑
osemt3敲除阳性植株t1开颖对比图：早上9:30时穗部开颖情况对比图，其中nip为阴性对照粳稻品种日本晴，ko
‑
1、ko
‑
2和ko
‑
3分别是独立转基因阳性株系。
41.图10为转crispr/cas9
‑
osemt3敲除阳性植株t1盛花期统计图：其中nip为阴性对照粳稻品种日本晴，ko
‑
1、ko
‑
2和ko
‑
3分别是独立转基因阳性株系。
42.图11为野生型宜香1b和突变体emt3的木葡聚糖多聚半乳糖转移酶酶活测定柱形图：其中wt其中wt为野生型宜香1b，突变体为emt3。
43.图12为野生型宜香1b和突变体emt3浆片组织的透射电镜图：其中wt为野生型宜香1b，突变体为emt3。
具体实施方式
44.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
45.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
46.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
47.本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
48.本发明对于osemt3蛋白及其编码基因的功能探究，是基于我国杂交稻骨干亲本宜香1b，经过在化学诱变试剂甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulphonate，ems)诱变库中筛选得到一份水稻花时(即颖花开放时间)提前突变体，命名为emt3(earlymorning flowering time 3)。通过遗传分析发现该花时提前性状由单隐性核基因控制。进一步研究后发现，该基因突变体开颖盛花期比野生型提前约2h，但其株高、穗实粒数、千粒重、等产量性状也存在一定程度上的减少。
49.loc_os03g05110基因(命名为osemt3,early morning flowering time3)编码的是一个木葡聚糖半乳糖基转移酶(相关蛋白osemt3)，其主要生物学功能是半纤维素合成的关键性酶，参与浆片细胞壁的生物学建成。
50.浆片细胞壁是一个复杂的网状结构，其主要由纤维素、半纤维素、果胶质、可伸缩性蛋白组成，因此，其组成分的改变会影响其细胞壁的结构建成，改变其渗透压与吸水性。emt3突变体由于浆片细胞壁的组成分改变，导致其吸水速率显著性提升，在一定的湿度情况下，浆片组织更容易吸水膨大，导致提前开颍。
51.基于此，本技术提供一种控制水稻花时提前的相关蛋白及其编码基因。
52.下面将结合实施例及实验数据对本技术一种控制水稻花时提前的相关蛋白及其编码基因进行详细说明。
53.实施例1
54.本实施例提供花时提前突变体emt3及野生型宜香1b的花时表型鉴定及遗传分析，通过分析该基因所编码的木葡聚糖多聚半乳糖转移酶在浆片细胞壁建成的机理研究及在水稻花时改良种培育品种中的作用，以为解决三系杂交制种中花时不遇的难题，提供早花时水稻品种及奠定花时研究的理论基础。
55.(一)试验材料
56.(1)野生型宜香1b(籼型水稻保持系)由四川宜宾农科院选育，由四川农业大学水稻研究所引进并保存。
57.(2)花时提前突变体emt3，是本发明人从以籼稻保持系品种宜香1b为背景构建的ems(甲基磺酸乙酯)诱变构成的突变体库中筛选获得的花时提前的突变体，该突变体与野生型宜香1b进行多代回交，该花时提前的突变性状能够稳定遗传。
58.(二)试验方法
59.(1)花时提前突变体emt3和野生型宜香1b同时种于海南陵水与四川农业大学温江
校区试验田等地，在植株成熟期，早上9:00对野生型宜香1b和突变体emt3的完整植株与稻穗局部进行拍照并统计其盛花期时间，结果见(图1与图2、表1)。
60.农杆菌感受态(agrobacterium)eha105购买于成都辰马生物技术有限公司；大肠杆菌感受态(escherichia coli)dh5α购买于北京全式金生物科技有限公司。
61.表1不同温度条件下野生型宜香1b与突变体emt3盛花期调查表
[0062][0063]
(2)早花突变体的遗传分析试验
[0064]
将野生型宜香1b和花时提前突变体emt3均种植在四川农业大学温江校区青浦园试验田。分别将突变体emt3与野生型宜香1b进行正反杂交(emt3
×
宜香1b，宜香1b
×
emt3)，并构建遗传分离群体，用于统计f1代表型和f2代群体的分离比例。
[0065]
利用野生型宜香1b与突变体0正反杂交获得f1代，f1代植株开颖时间表现正常，和野生型一样没有花时提前的出现。经卡方检验，结果(见表2)f2代中的野生型和早花表型的分离比为3:1，符合孟德尔单隐性基因的分离比，说明突变体emt3的花时提前性状受单隐性核基因控制。
[0066]
表2类花时提前变体emt3的遗传分析试验结果
[0067]
杂交组合正常植株早花植株总株数χ
c2
(3：1)p宜香1b
×
emt34751526270.87p<0.05emt3
×
宜香1b7112249350.411p<0.05
[0068]
实施例2
[0069]
本实施例野生型宜香1b和花时提前突变体emt3、cas9
‑
osemt3敲除株系ko
‑
1、ko
‑
2、ko
‑
3(早花基因序列分别对应seq id no.3～5)与野生型nip的农艺性状观察统计。
[0070]
分别于2019年夏/2020年春夏分别在海南陵水、温江按随机小区组设计种野生型宜香1b、早花突变体emt3、转基因crispr/cas9受体材料日本晴及crispr/cas9阳性纯合株系。设重复3行，每行10株。于成熟期从各小区随机挑选5株长势正常的单株分别调查相关的主要农艺性状，设置三次重复。考种采用万深sc
‑
g自动考种分析及千粒重分析仪考察粒型性状，具体方法按照《中国道中资源评价标准》进行。
[0071]
实施例3
[0072]
本实施例进行花时提前变体emt3候选基因的定位及克隆试验
[0073]
(一)试验材料
[0074]
花时提前突变体emt3，野生型宜香1b和nip(粳型水稻品种)均来自四川农业大学水稻研究所遗传研究实验室提供。
[0075]
(二)试验方法
[0076]
(1)将突变体emt3与粳稻品种nip杂交构建f1代群体，并自交得到f2代群体用于遗传定位。将突变体emt3与宜香1b回交构建bc1f3代群体用于mutmap测序进行基因精细定位。
[0077]
(2)近等基因池构建
[0078]
将emt3与nip杂交得到的f1代，f1自交得到的f2分离群体，采用bas法(bulk segregation analysis)进行基因定位与分析。首先，随机分别选取10个单株的emt3和nip的叶片，每10株的叶片等量混合提取dna建池，得到2个亲本dna混池用于筛选亲本间多态性分子标记。然后，在突变体emt3与nip杂交得到的f2分离群体中选10份具有花时提前表型的单株叶片和10份具有野生型正常表型单株的叶片，每10株的叶片等量混合提取dna建池，分别获得显性混池和隐性混池用于分析突变性状与染色体的连锁关系。最后，在突变体emt3与nip杂交得到的f2群体中选择64个具有花时提前表型的单株叶片，采用改进ctab法分单株提取dna，用于进行基因定位。
[0079]
(3)定位引物合成和基因定位
[0080]
先利用本研究室保存的平均分布于水稻12条染色体上的512对ssr引物(具体序列详见http://www.gramene.org/bd/markers)进行pcr扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳筛选出在emt3与nip基因组之间具有多态性的引物68对；随后用筛选出的68对多态性引物检测显性混池和隐性混池，以及emt3与nip构建的f2群体中隐性单株，进行基因初步定位；在已初定位的区间内，依据(http://www.gramene.org)网站公布的籼稻品种9311和粳稻品种日本晴目标区域的核苷酸序列之间的差异，设计inde1引物indel 13和indel 14(见表3)，试验结果见电泳图4，继续检测近等基因池和emt3与nip构建的f2群体中的200个隐性单株，进行定位。
[0081]
表3本试验所使用的pcr引物
[0082]
引物名称正向引物序列(5
’‑3’
)反向引物序列(5
’‑3’
)3
‑
13catacttcagaaccagacaagcctcttgagtcacaactgaaacc3
‑
15tatccaagcctccatacacatagtgcacaagaggtgaagaactggatgagcindel 13gacttctccactgtagcatctgtagcgaaggtatccatatgtggaggtagggindel 14aagcaggtcttattcagcaacagccaagcctgaagcagtaaatgtgc
[0083]
其中pcr反应体系(20ul)：taq酶(5u/ul)0.2ul，primer(10mmol/l)2ul，dntp(10mmol/l)0.3ul，dna模板(50
‑
200ng/μl)2ul，10
×
buffer(25mm)2ul，ddh2o 13.5ul。pcr反应程序：95℃/5min；95℃/30s，55℃/30s，72℃/1min，第2
‑
4步，34个循环；72℃/10min，12℃/1min。
[0084]
将pcr扩增产物在3.0％(7.5g琼脂粉溶于300ml ddh2o)的琼脂糖凝胶、恒压180v
‑
200v条件下电泳45min
‑
1h左右，用凝胶扫描成像仪(bio
‑
rad gel doc 2000)成像并保存记录。
[0085]
(4)连锁图谱的构建
[0086]
将与emt3电泳带型一致的单株标为ⅰ，与nip电泳带型一致的单株标为ⅱ，杂合双带型单株标为ⅲ，没有跑出条带的单株标为ⅳ，统计结果通过用生物学分析软件mapmake3.0软件对f2分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(cent morgan,cm)。
[0087]
结果发现第3号染色体的短臂端两个ssr标记3
‑
11和3
‑
13均与目标性状存在紧密连锁关系，遗传距离分别为0.16cm和0.23cm。
[0088]
(5)候选基因精细定位和基因预测
[0089]
为了进一步缩小定位区间，利用emt3与宜香1b杂交后，在bcf3群体中分别随机选表型为花时提前的突变体单株与表型为野生型花时相近的单株各30株，以等量的dna分别构成突变体混池与野生型混池，用于mutmap全基因组测序。以表型为花时正常的野生型混池基因组序列为参照组，对突变体的全基因组高通量测序结果进行分析解读，测序深度为30层。用soap2软件将测序数据与已发表的日本晴参考基因组(msu osa1 release 7annotation)进行全完比对，根据初定位区间筛选出染色体特定位置的短序列片段。运用soapsnp、soapsv、soapindel等数据分析软件对突变体与日本晴参考组之间的单核苷酸多态性(snp)svs、indels进行分析解读，筛选出突变体ema
‑
1在定位区间内特异存在7个snps位点、1处13bp的碱基deletion、1个svs。通过计算
△
snp index，挑选出在f2
‑
read≥15且连续分布的高
△
snp index读值。如图5所示，经过数据分析得到12条染色体上snp位点的散点分散图。在第三号染色体短臂上出现高
△
snp index分值且连续分布的情况，与我们初定位区间相吻合。由此得到我们候选基因所在的区间定位于三号染色体短臂物理距离18m～19m之间，其中没有已报道与花时相关的基因，故研究结果表明osemt3为一个控制花时的新基因。
[0090]
将mutmap全基因组测序数据分析结果与突变体emt3突变表型、水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.ed/cgi
‑
bin)与(http://plants.ensembl.org/index.html)中籼稻数据库相结合，根据基因功能注释进行筛选在定位区间内，进一步分析得到这几个snp位点多处于基因间、内含子上或同义突变，仅有一个snp位点位于基因loc_os03g05110的第一外显子属于非同义突变。为了确认mutmap重测序结果的可靠性，对分析公司给出的三个snp位点与deletion片段设计引物，分别在在野生型与突变体中进行pcr扩增并进行sanger测序(如图6所示)，结果表明其中非同义突变的snp为位点在野生型与突变体中的确发生了单碱基突变，与分析公司给予的结果相吻合。在该编码蛋白基因的cds区第1063位碱基由g(鸟嘌呤)转换成a(胸腺嘧啶)，造成编码的第355位氨基酸由g(苷氨酸)突变为l(色氨酸)，该碱基突变可能破坏了蛋白的正常编码序列，导致蛋白的功能发生破坏，故将该基因loc_os03g05110列为emt3突变体的候选基因。
[0091]
实施例4
[0092]
本实施例进行花时提前突变体emt3候选基因crispr/cas9(基因敲除)实验。
[0093]
(一)试验材料
[0094]
本试验所用大肠杆菌感受态dh5α购于北京全式金生物有限公司、农杆菌eha105感受态菌株购于四川辰马生物科技有限公司。
[0095]
(二)试验方法
[0096]
1、crispr/cas9
‑
osemt3基因敲除载体构建
[0097]
分别以突变体emt3、宜香1b、nip的cdna为模板对该基因进行扩增，发现该基因在籼稻宜香1b与粳稻nip中编码区氨基酸序列存在高度同源的情况，说明该基因编码的蛋白在籼稻宜香1b和粳稻中花11中可能行使相近的生物学功能。
[0098]
以粳稻品种日本晴(nip)中osemt3(loc_os03g05110)基因的核苷酸序列为模板，选择特异的区域，设计1个独立的敲除靶位点，利用bwa(v)h
‑
cas9 bgk03基因敲除载体，参照试剂盒(杭州百格生物公司)构建crispr/cas9
‑
osemt3载体。具体构建流程如下：
[0099]
(1)设计并合成下述接头引物以形成sgrna靶点序列：
[0100]
f:5
’‑
gttttagagctagaaatagcaagttaaaat
‑3’
(seq id no.7)，
[0101]
r:5
’‑
caaaatctcgatctttatcgttcaatttta
‑3’
(seq id no.8)；
[0102]
用于敲除的osu6启动子
[0103]
f:5
’‑
aacttataaaccgcgcgct
‑3’
(seq id no.9)
[0104]
r:5
’‑
ttgaatatttgggcgcgcga
‑3’
(seq id no.10)
[0105]
用于敲除目的基因的靶序列为：
[0106]5’‑
gcaggatagaatgaggagcc
‑3’
(seq id no.11)
[0107]5’‑
cggctcctcattctatcctgc
‑3’
(seq id no.12)
[0108]
(2)制备引物二聚体
[0109]
将步骤(1)合成的引物对加水溶解至10μm，按下列反应体系混合后，在pcr仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，得引物二聚体。所述的反应体系为：退火buffer 18ul,grna靶点引物各1ul，加ddh2o,补足至20ul。
[0110]
(3)将引物二聚体构建至bwa(v)h载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后20℃反应1小时后转化大肠杆菌备用，获得包含启动子、靶序列、grna等元件的表达载体。所述的反应体系：bwa(v)h载体2ul，oligo二聚体1ul，酶混合液1ul，加ddh2o,补足至10ul。
[0111]
2、大肠杆菌转化
[0112]
(1)从
‑
80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；
[0113]
(2)每100ng连接产物加入100μl感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；
[0114]
(3)42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；
[0115]
(4)加入500μl不含抗生素的lb液体培养基，在37℃、200rpm培养1小时，得活化菌液；
[0116]
(5)将活化的菌液以5000rpm离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻吸打混匀沉淀，吸取100μl，在超净台上把菌液转移并涂到含有卡那霉素的lb筛选平板上；
[0117]
(6)将涂有菌液的lb固体培养基平板正面向上放置10分钟左右，待菌液完全被lb固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，于恒温箱中37℃过夜培养；
[0118]
(7)挑取单菌落，利用p
‑
osemt3引物对菌液进行pcr检测。所述的p
‑
osemt3引物对为：
[0119]
p
‑
osemt3 ko
‑
f:5'cccagtcacgacgttgtaaa 3'(seq id no.13)；
[0120]
p
‑
osemt3 ko
‑
r:5'ttgggatgagactaatgacc 3'(seq id no.14)
[0121]
其中pcr反应程序：95℃/5min；95℃/30s，55℃/30s，72℃/30s，35个循环；72℃/10min，12℃/1min。
[0122]
(8)将阳性克隆挑入5ml含有卡那霉素(50mg/l)的lb培养液中，在37℃、200rpm下培养约16h，保存菌液并提取质粒。
[0123]
3、按照omega plasmid extraction kit产品说明书提取大肠杆菌质粒，将提取的质粒dna收集到干净的离心管中，
‑
20℃保存。
[0124]
4、质粒序列的测定和序列分析
[0125]
将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用dnaman软件对测序
结果进行序列比对，确证grna序列的正确性，将阳性克隆质粒命名为crispr/cas9
‑
osemt3。
[0126]
5、农杆菌转化
[0127]
(1)农杆菌化学转化法
[0128]
按照一个质粒：50ul感受态细胞从
‑
80℃拿出来时快速放手心化冻；将构建好的crispr/cas9
‑
osemt3质粒0.4～1ug加入到50ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻2min；37℃水浴2min,溶化细胞；立即加入5倍体积的无抗生素lb液体培养基，在28℃、170rpm下摇床培养2～3h；
[0129]
7000rpm离心2分钟，在100ul lb液体培养基中悬浮细胞；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2
‑
3天；用潮霉素分子标记p
‑
osemt3引物进行菌液pcr检测，将能扩增出目的条带的阳性农杆菌单克隆，加入甘油作为保护剂，置于
‑
80℃保存备用。
[0130]
(2)农杆菌浸染法转化水稻
[0131]
(a)愈伤组织的诱导：先用75％酒精将日本晴种子消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，然后用40％的次氯酸钠漂洗30min，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于nmb培养基上，于28℃、光照条件下培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于nmb培养基上，于28℃、黑暗条件下培养4天。
[0132]
(b)农杆菌菌株的活化：将(1)中
‑
80℃保存的30ul农杆菌加入3ml含有利福平和卡那霉素的yep液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1ml于含有利福平和卡那霉素的50mlyep液体培养基中，28℃再振荡培养4h，得活化的农杆菌菌液。
[0133]
(c)共培养转化：将(b)活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μm/l乙酰丁香酮的aam液体培养基30ml重悬菌体，将(a)中预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。
[0134]
(d)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/l)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。
[0135]
(e)转基因植株的分化与生根：将(d)中新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1～2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提取dna，利用扩增目的基因全长dna的p
‑
osemt3性植株苗，最终获得3株转基因阳性植株。将5个转基因阳性植株分别命名为：ko
‑
1、ko
‑
2、ko
‑
3；
[0136]
(f)将阳性转基因植株室内炼苗2
‑
3天后，移栽于大田。
[0137]
6、转基因水稻的检测
[0138]
(1)应用改进的ctab法提取步骤5中所得的阳性转基因植株的dna，用pemf1
‑
2引物对扩增出转基因植株中的敲除靶基因的全长序列，pcr产物片段大小为780bp。所述的pemf1
‑
2引物对为：
[0139]
pemf1
‑
2引物对为：
[0140]
pemf1
‑
2 f:5'tgatagattggctgaggaag 3'(seq id no.15)，
[0141]
pemf1
‑
2 r:5'ttgggatgagactaatgacc 3'(seq id no.16)；
[0142]
其中pcr反应体系(25ul)：tap酶(5u/μl)0.5ul，primer(10mmol/l)2ul，dntp(2.5mmol/l)0.5ul，dna(20
‑
100ng/μl)2ul，2
×
buffer(25mm)12.5ul，ddh2o 7.5ul。pcr反
应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃5s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min，12℃1min。
[0143]
(2)pcr产物的回收和测序
[0144]
进行pcr扩增后反应结束后在产物中加入溴酚蓝指示剂，并在2％的琼脂糖中电泳，并用天根pcr产物回收试剂盒进行回收，保存，反应体系与具体如下：
[0145]
1)待片段完全分离后，在紫外灯下用小刀快速切取目的条带，放入新的ep管里
[0146]
2)在电子天平上称取凝胶块重量，按照1g凝胶加入1ml binding buffer的比例，加入适量的binding buffer并在60℃水浴锅中水浴10min，至凝胶块完全溶解，其间每隔2
‑
3min轻柔倒置一次
[0147]
3)将hibind dna柱子套入2ml收集管
[0148]
4)将凝胶混合液转移至hibind dna柱子中，10000xg/min离心1min
[0149]
5)弃虑液，将柱子重新装回收集管中(hibind柱一次能装700μl溶液)，重复4～5步骤。
[0150]
6)把柱子重新装回收集管，加入300μl bind buffer，10000xg/min离心1min，弃虑液
[0151]
7)把柱子重新装回收集管，加入700μl spw wash buffer，10000xg/min离心1皿，弃底液(spw wash buffer先用无水乙醇进行稀释)
[0152]
8)重复步骤8一次
[0153]
9)弃滤液，把柱子重新撞毁收集管，13000xg空转离心2min
[0154]
10)将柱子重新装在灭菌的1.5ml ep管中，加入40μl经65℃水浴浴热的elution buffer，室温静置2min，13000xg/min离心2min洗脱出dna，再进行凝胶电泳，点上maker，分析提纯的dna的完整性与浓度，检测后送成都擎科科技股份有限公司测序。
[0155]
结果(见图8
‑
9)3个独立转基因阳性株系叶片均表现为花时提前的突变。与阴性对照对比发现，3个转基因植株在osemt3基因的cds编码区分别发生了单碱基突变(见seq id no.3～seq id no.5)。经osemt3基因的敲除实验，说明osemt3基因是控制花时提前表型的基因；也证明osemt3是控制突变体emt3早花表型的基因。
[0156]
7、采用实施例2中所述的方法，对转基因敲除株系ko
‑
1、ko
‑
2、ko
‑
3和对照品种日本晴进行盛花期开颖时间统计。
[0157]
结果(见图10，表4)发现和突变体emt3的早花性状相似，与对照nip相比，敲除osemt3基因的转基因株系ko
‑
1、ko
‑
2、ko
‑
3的开颖时间相较与阴性对照日本晴(nip)，说明对osemt3基因其它cds编码区(相对突变体emt3突变位点而言)进行编辑(包括进行一个或几个添加、替换和缺失)同样可以获得突变体emt3花时提前的表型；说明osemt3基因是小穗开颖的相关基因，将该基因敲除后可以使水稻提前开颖。
[0158]
表4敲除osemt3转基因株系相对于阴性对照中花11的开颖时间对比表
[0159][0160]
实施例5
[0161]
本实施例对花时提前突变体emt3与野生型宜香1b的木葡聚糖半乳糖基转移酶酶活进行测定，测定试剂盒购买于成都辰马生物科技有限公司。
[0162]
组织标本：分别选取野生型宜香1b和突变体emt3的颖花后，称取重量。加入一定量的pbs，ph7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2
‑
8℃的温度。加入一定量的pbs(ph7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000
‑
3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
[0163]
具体操作步骤如下：
[0164]
1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
[0165]
2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0166]
3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
[0167]
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
[0168]
5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
[0169]
6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
[0170]
7.显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
[0171]
8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
[0172]
9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0173]
实施例6
[0174]
本实施例制备花时提前突变体emt3与野生型宜香1b的浆片组织透射电镜图，图片制作在成都里来生物科技有限公司进行，具体的步骤如下：
[0175]
1材料及方法
[0176]
1.1标本
[0177]
3％戊二醛固定；固定状态良好。
[0178]
表5.组织分组及编号
[0179][0180]
1.2试剂耗材
[0181]
812环氧树脂包埋套装：gp18010，规格1375g，北京中镜科仪技术有限公司。
[0182]
醋酸双氧铀：gs02624，规格25g/瓶，北京中镜科仪技术有限公司。
[0183]
柠檬酸铅染液：gz02616，规格1ml
×
10支/盒，北京中镜科仪技术有限公司。
[0184]
四氧化锇：样品编号gp18456，规格1g/支，进口分装，徕卡。
[0185]
1.3仪器
[0186]
透射电子显微镜：型号jem
‑
1400plus，日本电子(jeol)生产。
[0187]
徕卡组织处理机：em tp，徕卡生产。
[0188]
玻璃制刀机：em kmr3，徕卡生产。
[0189]
超薄切片机：em uc7，徕卡生产。
[0190]
1.4固定
[0191]
样品经3％戊二醛预固定，1％四氧化锇再固定。
[0192]
1.5脱水
[0193]
丙酮逐级脱水，脱水剂浓度梯度为30％
→
50％
→
70％
→
80％
→
90％
→
95％
→
100％(100％浓度中换3次)。
[0194]
1.6渗透与包埋
[0195]
将脱完水的样品先后经过脱水剂和环氧树脂(型号为epon812)渗透液，比例分别为3:1、1:1、1:3，每步30～60min。将渗透好的样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋经过加温聚合形成一种固体基质(包埋块)，已备下一步切片。
[0196]
1.7超薄切片
[0197]
采用超薄切片机制备约50nm厚的超薄切片后，漂浮于刀槽液面上，再捞至铜网。
[0198]
1.8切片染色(双染色法)
[0199]
先用醋酸铀染色10～15min，再用枸橼酸铅染色1～2min，室温下染色，jem
‑
1400plus透射电镜观察。
[0200]
附图12的详细说明：
[0201]
图12为野生型宜香1b和突变体emt3浆片组织的透射电镜图，其中wt为野生型宜香1b，突变体为emt3。
[0202]
本发明的主体osemt3蛋白即为一个为被系统研究报道的木葡聚糖多聚半乳糖转移酶，其是存在于细胞壁上的一类调节蛋白，可将一条木葡聚糖链切断并重新链接到另外一条木葡聚糖链的非还原基，调节细胞生长过程中多糖链的重新排列和新和成的多糖链在细胞壁上的沉积，木葡聚糖多聚半乳糖转移酶调节了细胞壁中木葡聚糖的合成与修饰，而木葡聚糖即和成半纤维素的主要原料。
[0203]
突变体emt3中的osemt3基因功能缺失，导致浆片中的木葡聚糖半乳糖基转移酶的相对含量降低(如图11所示)，半纤维素含量减少,浆片细胞间的“填充物”(多为果胶质
‑
半纤维素
‑
可伸缩性蛋白的聚合物)减少，更容易吸水膨胀，导致其开花时间显著性提前，因此
出现早花时突变现象。
[0204]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0205]
(1)本发明一种控制水稻花时提前的相关蛋白，命名为osemt3，通过基因编辑敲除osemt3蛋白的编码基因能够获得水稻花时提前基因，开颖时间显著提前，有利于提高杂交水稻制种授粉率。
[0206]
(2)本发明一种控制水稻花时提前的相关蛋白的编码基因，作为蛋白osemt3的编码基因，可通过基因编辑敲除获得水稻花时提前基因，显著提前水稻开颖时间，且对高温光照等调教不为敏感，可用于不育系制种与培育新型耐高温品种，该编码基因在水稻花时调节领域的应用首次被提出。
[0207]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0208]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0209]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。