一种缬沙坦中的2-叠氮基-3-甲基丁酸的检测方法与流程

一种缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法
技术领域
1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检验方法。


背景技术：

2.缬沙坦(valsartan)化学名为(s)
‑
n
‑
戊酰基
‑
n
‑
[4
‑
(2
‑
四唑基)苯基]苯甲基缬氨酸，是一种血管紧张素ⅱ(angiotensinⅱ)at1 受体拮抗剂，它是继钙离子通道阻滞剂和血管紧张素转化酶抑制剂(acei)之后又一新型抗高血压药，由于其副作用小，作用机制独特，耐受性好，服用方便，疗效显著，同时具有保护心脏、脑、肾脏等靶器官的效果，应用前景十分广阔。
[0003]2‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸，cas no.：81439
‑
78
‑
3，结构式：，是缬沙坦合成过程中的一种工艺杂质，因其具有叠氮基团的基因毒性警示结构，需要对该类杂质进行控制。
[0004]
基因毒性杂质是一类可与dna反应，造成dna损伤，在很低水平下即可诱发基因突变，并可能致癌的杂质，因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，近年来也越来越多的出现因为在已上市药品中发现痕量的基因毒性杂质残留而产生大范围的医疗事故，被fda强行召回的案例，给药厂造成了巨大的经济损失，近年来的各国法规机构如ich、fda、ema等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的药企在新药研发过程中就重点关注基因毒性杂质的控制盒检测，ich发布了关于遗传毒性和致癌性杂质相关的指导原则，ich m7中基因毒性杂质的毒理学关注阈值（ttc）值为1.5
µ
g/天，而缬沙坦片剂中缬沙坦的最大日剂量为320mg/天，根据公式限度=ttc/最大日剂量，计算得到2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸在成品缬沙坦中的限度为4.7ppm。
[0005]
目前还没有任何文献公开检测缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸含量的方法，本发明首次公开了缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法，为解决缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的含量，从而有效保障用药安全，便于缬沙坦原料药的质量控制。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供一种缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法，为解决缬沙坦的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的含量，从而有效保障用药安全，便于缬沙坦的质量控制，该方法便捷、高效、准确，在系统适用性、重复性、专属性、准确度方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于缬沙坦原料药的质量控制。
[0007]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：（1）配制溶液，分别配制空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液。
[0008]
（2）测定方法：采用lc
‑
ms测定缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的含量，待系统稳定后，分别进空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液，记录色谱图；色谱条件如下:色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，进样量：5
µ
l，柱温：30℃，流速：0.4ml/min，流动相以甲酸：水体系为流动相a，以乙腈为流动相b，采用梯度洗脱；ms条件如下：干燥气温度：320℃，干燥气流速：8 l/min，雾化气压力：40 psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：10 l/min，毛细管电压：3500v，极性：负极，扫描模式：sim，采集时间：4.0min
‑
8.0min，emv：0v，sim ion（m/z）：142.0，fragmentor：66v，dwell：100ms，加速电压：5v。
[0009]
进一步的，所述空白溶液为乙腈：水=50:50（v/v），所述流动相为：流动相a：甲酸：水=1:1000（v/v），流动相b：乙腈，所述对照品溶液：取适量2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸置于容量瓶中，加入适量空白液溶解并稀释至刻度，摇匀；所述灵敏度溶液：取适量对照品溶液，置于容量瓶中，加入适量空白液溶解并稀释至刻度，摇匀；所述供试品溶液：取适量供试品，置于容量瓶中，加空白溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，所述色谱柱为thermoacclaim
tm
rslc 120 c18 2.1
×
100mm，2.2
µ
m或效能相当的色谱柱。
[0010]
进一步的，所述流动相梯度过程如下：进一步的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：（1）配制溶液：乙腈：hplc；甲酸：hplc；水：超纯水；2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸：自制或外购；空白溶液：乙腈：水=50:50（v/v）；
对照品储备液
①
：取2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸对照品约23.5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml，置25ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：18.8μg/ml）对照品储备液
②
：精密量取对照品储备液
①
1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：940ng/ml）对照品溶液：精密量取对照品储备液
②
500μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：47ng/ml）灵敏度溶液：精密量取对照品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀。（浓度：4.7ng/ml）供试品溶液：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml）色谱条件：仪器：agilent infinityii 1290 uhplc agilent 6470 esi（
‑
）
‑
qqq
‑
ms、电子分析天平；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（如：thermoacclaimtm rslc 120 c18 2.1
×
100mm，2.2
µ
m或效能相当的色谱柱）进样量：5
µ
l；柱温：30℃；流速：0.4ml/min；流动相a：甲酸：水=1:1000（v/v）；流动相b：乙腈；
（1）测定方法：待系统稳定后，进空白溶液1针、灵敏度溶液1针、对照品溶液6针、空白溶液1针，供试品溶液1针，记录谱图。
[0011]
结果（ppm）=(r
u
/r
s
)
×
(c
s
/c
u
)其中：r
u
：供试品溶液图谱中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的峰面积；r
s
：6针对照品溶液图谱中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的平均峰面积；c
s
：对照品溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的浓度(ng/ml)；c
u
：供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0012]
限度：
所述缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：本发明首次公开了缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测方法，本发明为解决缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的含量，从而有效保障用药安全。
附图说明
[0013]
图1为缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸空白溶液图谱图2为缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸对照品溶液图谱图3为缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸供试品溶液图谱图4为缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸灵敏性溶液图谱图5为缬沙坦中的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸选择性溶液图谱
具体实施方式
[0014]
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0015]
实施例1：（1）配制溶液：乙腈：hplc；甲酸：hplc；水：超纯水；2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸：自制或外购；空白溶液：乙腈：水=50:50（v/v）；对照品储备液
①
：取2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸对照品约23.5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1.0ml，置25ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：18.8μg/ml）对照品储备液
②
：精密量取对照品储备液
①
1.0ml，置20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：940ng/ml）对照品溶液：精密量取对照品储备液
②
500μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：47ng/ml）灵敏度溶液：精密量取对照品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀。（浓度：4.7ng/ml）供试品溶液：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml）选择性溶液：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液
②
500μl置该量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml、2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸47ng/ml）供试品溶液（加标）：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取对照品储备液
②
500μl置该量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml、2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸47ng/ml）同法配制6份该溶液；loq溶液：根据灵敏度溶液所得的2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的s/n值，调节稀释比例至2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的s/n值不小于10。同法配制6份。
[0016]
lod溶液：精密量取loq溶液2.0ml，置10ml量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀；线性溶液
‑
50%：精密量取对照品储备液
②
250μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：23.5ng/ml）线性溶液
‑
80%：精密量取对照品储备液
②
400μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：37.6ng/ml）线性溶液
‑
100%：精密量取对照品储备液
②
500μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：47ng/ml）
线性溶液
‑
120%：精密量取对照品储备液
②
600μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：56.4ng/ml）线性溶液
‑
150%：精密量取对照品储备液
②
750μl置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：70.5ng/ml）准确度溶液
‑
100%：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取准确度储备液500μl置该量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml、2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸47ng/ml）同法配制3份。
[0017]
准确度溶液
‑
150%：取供试品约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，精密量取准确度储备液750μl置该量瓶中，加稀释液适量，超声使溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：缬沙坦10mg/ml、2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸70.5ng/ml）同法配制3份。
[0018]
色谱条件：仪器：agilent infinityii 1290 uhplc agilent 6470 esi（
‑
）
‑
qqq
‑
ms、电子分析天平；色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（如：thermoacclaimtm rslc 120 c18 2.1
×
100mm，2.2
µ
m或效能相当的色谱柱）进样量：5
µ
l；柱温：30℃；流速：0.4ml/min；流动相a：甲酸：水=1:1000（v/v）；流动相b：乙腈；
（1）测定方法：待系统稳定后，进空白溶液1针、灵敏度溶液1针、对照品溶液6针、空白溶液1针，供试品溶液1针，记录谱图。
[0019]
结果（ppm）=(r
u
/r
s
)
×
(c
s
/c
u
)其中：r
u
：供试品溶液图谱中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的峰面积；r
s
：6针对照品溶液图谱中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的平均峰面积；c
s
：对照品溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的浓度(ng/ml)；c
u
：供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0020]
限度：
实施例2：系统适用性系统适用性是通过测定灵敏度溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的s/n值及6针对照品溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸峰面积的rsd而实现的，要求灵敏度溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的s/n应≥10；6针对照品溶液中以2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸峰面积计rsd应不大于10.0%。为确认序列运行过程中的系统适用性，在验证过程中每隔约8小时及序列的最后，进1针对照品溶液，要求后连续6针对照品溶液中以2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸峰面积计rsd应不大于10.0%。
[0021]
实施例3：专属性专属性是通过测定空白溶液对检测有无干扰，选择性溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸峰与相邻峰之间的分离度而实现的，要求空白溶液对检测应无干扰，选择性溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸峰与相邻峰之间的分离度应不小于1.5。
[0022]
实施例4：精密度重复性：重复性是通过测定6份供试品溶液（加标）中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸测定结果的rsd而实现的，要求6份供试品溶液（加标）中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸测定结果的rsd应不大于10.0%。
[0023]
实施例5：检测限和定量限检测限是通过检测其响应信号与噪声之比不小于3：1而得到；定量限是通过检测其响应信号与噪声之比不小于10：1而得到的。在定量限浓度水平下，重复考察6份定量限溶液，要求6份loq溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸单位浓度峰面积的rsd应不大于20.0%，loq2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸应不大于1.41ppm，s/n≥10；lod溶液中2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的s/n≥3，且lod＜loq。
[0024]
实施例6：线性和范围在loq浓度～150%限度浓度范围内均匀的取6个点，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制曲线。要求2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸在loq浓度~150%限度浓度范围内应呈线性，相关系数r的平方（r2）应不小于0.99，y轴截距的绝对值应在100%浓度响应值的25%以内。
[0025]
实施例7：准确度准确度是通过被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率及回收率的总rsd（n=9）而实现的。要求加入loq浓度、100%限度浓度、150%限度浓度的准确度溶液中，2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的回收率应在70.0%～130.0%之间，且回收率的总rsd（n=9）应不大于20.0%。
[0026]
实施例8：耐用性考察对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液在室温下放置一段时间后进样，检测结果随时间变化的规律，为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供参考。
[0027]
要求：与对照品溶液0hr相比较，对照品溶液在室温下放置一段时间内，2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的回收率应在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则对照品溶液在室温考察期间稳定；若供试品溶液0hr有检出2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸，供试品溶液在室温放置一段时间内，测定结果变化值在限度的20%以内，且无明显的变化趋势，则供试品溶液在室温考察期间稳定；若供试品溶液0hr未检出2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸，供试品溶液在室温下放置一段时间内，仍无2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸检出，则供试品溶液在室温考察期间稳定；选择性溶液在室温下放置一段时间内，2
‑
叠氮基
‑3‑
甲基丁酸的回收率应在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则选择性溶液在室温考察期间稳定。