一种菱壳多酚提取物的制备以及纯化方法与流程

1.本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种菱壳多酚提取物的制备方法以及纯化方法。


背景技术：

2.菱角(water chestnut)为一年生水生植物，全球约有30种和变种。在我国，菱角已有 3000多年的栽培历史，在长江流域分布和栽培最多，自古以来为药食两用的佳品。菱角富含淀粉，可直接食用，也可用于制菱粉、酿酒或入药，其新鲜茎叶通常用作家禽家畜的饲料，但作为副产物的菱壳一般都未能得到有效的开发利用。菱壳中含有多酚、多糖、皂苷等活性成分，其中多酚类为菱角的一类主要活性成分，而没食子酸及其衍生物为菱角多酚的主要成员之一。现有技术表明菱壳多酚提取物具有抗乳腺癌、降血糖、抗氧化等生物活性。因此，菱壳多酚提取物的进一步研究与应用具有很大的前景。
3.菱角一般八九月份成熟，在成熟过程中，菱壳的状态不同：刚出水的嫩菱菱壳翠而软，接着菱壳会变硬并变为黄褐色。
4.大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地物理吸附溶液中的有机物。利用大孔吸附树脂对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过吸附、解吸附过程可以分离纯化不同成分。已有利用大孔吸附树脂对菱壳多酚提取物进行纯化的方法，但未能进行详细研究，提供优选的纯化方法。


技术实现要素：

5.为了充分利用自然资源，提高菱壳多酚提取物的产率及其中多酚的含量，解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种菱壳多酚提取物的制备以及纯化方法。
6.本发明选取成熟早期(阶段一)的菱壳制备菱壳多酚提取物。
7.优选地，按下述操作步骤制备所述的菱壳多酚提取物：
8.(1)取菱壳清洗干净后干燥，粉碎得菱壳粉末；
9.(2)取菱壳粉末用60％乙醇，80℃恒温水浴提取2h，再超声处理15min，离心收集上清液，减压浓缩，冻干得粗提物；
10.(3)取粗提物，加入适量水溶解，加入3倍量的石油醚重复萃取3次，将所得水相合并，减压浓缩，冷冻干燥得多酚提取物。
11.优选地，所述菱壳为金华青菱或无角红菱的菱壳。
12.进一步地，所述多酚提取物中含有没食子酸和五没食子酰葡萄糖，可应用于没食子酸和五没食子酰葡萄糖的制备。
13.进一步地，所述菱壳多酚提取物具有抗mda
‑
mb
‑
231三阴型乳腺癌细胞株活性，能用于抗三阴性乳腺癌药物的制备。
14.为进一步纯化菱壳多酚提取物，本发明提供了一种菱壳多酚提取物的纯化方法，
具体操作包括：
15.(1)取ab
‑
8大孔吸附树脂经预处理后湿法装柱；
16.(2)取菱壳多酚提取物以0.5ml/min流速上样，上样浓度为0.5mg/ml，上样液ph为2.5；
17.(3)以ph为4.5的50％乙醇溶液按0.5ml/min的流速洗脱；
18.(4)收集洗脱液，减压浓缩，冻干得精制多酚提取物。
19.本发明的优势在于：
20.本发明人发现不同阶段菱壳能提取获得多酚提取物的量及其多酚含量不同。此外，菱角品种多样，使用不同品种菱角提取获得的多酚提取物的量及其多酚含量也不同。现有技术有对菱壳中的多酚进行提取，但未区分不同成熟阶段和不同品种菱角的菱壳，未能对其进行充分利用。
21.本发明选取成熟早期(阶段一)菱角的菱壳进行多酚提取物的制备，显著提高了多酚提取物产率及其中的多酚含量，以及其中的没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量，可进一步用于没食子酸和五没食子酰葡萄糖的制备。此外，选取金华青菱或无角红菱的菱壳进行多酚提取物的制备，获得的多酚提取物中的多酚含量更高。本发明还提供了一种菱壳多酚提取物的纯化方法，可去除其他杂质、显著提高菱壳多酚提取物中的多酚含量。结合本发明的制备方法和纯化方法可以获得产量高、纯度高的菱壳多酚提取物，为菱壳多酚提取物的进一步研究和菱壳的有效利用提供技术基础。
附图说明
22.附图1不同成熟阶段的南湖菱菱角，从左到右分别为阶段四、阶段三、阶段二、阶段一附图2不同成熟阶段南湖菱壳中多酚含量，**表示p<0.01
23.附图3不同品种菱的菱角及菱壳
24.附图4不同品种菱的菱壳中的多酚含量，**表示p<0.01
25.附图5大孔吸附树脂种类对菱壳多酚提取物的吸附作用的影响
26.附图6大孔吸附树脂种类对菱壳多酚提取物的解吸附作用的影响
27.附图7上样液浓度对菱壳多酚提取物的吸附作用的影响
28.附图8上样液ph值对菱壳多酚提取物的吸附作用的影响
29.附图9上样液流速对菱壳多酚提取物的吸附作用的影响
30.附图10解析液体积分数(乙醇比例)对菱壳多酚提取物的解吸附作用的影响
31.附图11解析液ph对菱壳多酚提取物的解吸附作用的影响
32.附图12解析液流速对菱壳多酚提取物的解吸附作用的影响
具体实施方式
33.下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。
34.实施例1不同成熟阶段南湖菱中菱壳中的多酚含量、没食子酸和五没食子酰葡萄糖含量及测定
35.按成熟程度，将菱角分为四个成熟阶段：阶段一、阶段二、阶段三、阶段四(图1)。阶
段一的菱角外表呈翠绿色，果皮软，果实长度2cm左右；阶段二的菱角外表呈翠绿色稍泛白，果皮初步硬化，果实长度3cm左右；阶段三的菱角外表呈翠绿色泛白，果皮硬化，果实长度4cm左右；阶段四的菱角外表呈白色间杂褐色，果皮坚硬，果实长度5cm左右。
36.将四个阶段的南湖菱角的菱壳分别干燥粉碎制成粉末。用电子天平分别称取约0.5g四个阶段的南湖菱壳粉末，倒入25ml容量瓶中，加入60％乙醇15ml，在80℃恒温水浴锅中提取2h，再超声处理15min后倒入50ml离心管中，提取液在离心机中以3000r/min离心处理2min。离心完成后，用一次性滴管取上清液于20ml离心管中备用。按福林酚法测定多酚的含量。用hplc法测定没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量，实验结果如下表1。
37.表1不同成熟阶段南湖菱角的菱壳中没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量
[0038][0039]
结果表明随着菱角的不断成熟，菱壳中多酚含量呈现下降趋势，其中阶段一的多酚含量最高，可达25.50％(图2)；随着菱角的不断成熟，没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量也呈下降趋势，其中阶段一的没食子酸和五没食子酰葡萄糖含量也最高，分别为0.60％和1.70％。
[0040]
因此，选取阶段一的南湖菱角的菱壳进行多酚的提取，获得的多酚的量会高于其他成熟阶段的菱角，进一步用于制备没食子酸和五没食子酰葡萄糖，获得的没食子酸和五没食子酰葡萄糖产量也会更高。
[0041]
实施例2不同品种菱的菱壳中的多酚含量、没食子酸和五没食子酰葡萄糖含量及测定
[0042]
将相同采收期(阶段三)不同品种菱的菱角：金华青菱、邵伯菱、绍兴红菱、无角红菱、南湖菱(图3)剥取菱壳，清洗干净后冻干备用，将所有干燥后的菱壳粉碎后分装在袋中标记备用。
[0043]
用电子天平分别称取约0.5g南湖菱、金华青菱、邵伯菱、绍兴红菱、无角红菱的菱壳粉末，倒入25ml容量瓶中，加入60％乙醇15ml，在80℃恒温水浴锅中提取2h，再超声处理15min后倒入50ml离心管中，提取液在离心机中以3000r/min离心处理2min，每个组别设3次重复。离心完成后，用一次性滴管取上清液于20ml离心管中备用。按福林酚法测定多酚的含量。用hplc法测定没食子酸和五没食子酰葡萄糖的含量，实验结果如表2。
[0044]
表2不同品种菱的菱壳中没食子酸和五没食子酰葡萄糖含量
[0045]
[0046][0047]
结果表明金华青菱以及无角红菱的菱壳的多酚含量分别为17.71％和17.11％，显著高于其他三种菱的菱壳(图4)。金华青菱以及无角红菱菱壳的五没食子酰葡萄糖的含量分别为1.04％和1.28％，也显著高于其他三种菱的菱壳。此外，金华青菱的菱壳中没食子酸含量最高。
[0048]
因此，选取金华青菱以及无角红菱的菱壳进行多酚的提取，获得的多酚的量会高于邵伯菱、绍兴红菱和南湖菱，进一步用于制备五没食子酰葡萄糖，获得的五没食子酰葡萄糖产量也会更高。
[0049]
实施例3菱壳中多酚提取物的制备方法
[0050]
取菱角，剥取菱壳，清洗干净后干燥、粉碎得菱壳粉末。取菱壳粉末，按料液比为1： 25(g/ml)加入60％乙醇溶液，在80℃恒温水浴中提取2h，再超声处理15min，以3000r/min 离心处理10min。重复提取2次，减压浓缩得粗提物。取粗提物，加入适量水溶解，加入 3倍量的石油醚重复萃取3次，将所得水相合并，减压浓缩，冷冻干燥得多酚提取物。
[0051]
实施例4菱壳多酚提取物及其多酚含量和三阴型乳腺癌细胞毒活性
[0052]
按实施例3分别取0.5g不同成熟阶段(阶段一、阶段二、阶段三和阶段四)的南湖菱的菱壳和同一成熟阶段(阶段三)的不同品种(金华青菱、邵伯菱、绍兴红菱、无角红菱、南湖菱)的菱壳制备多酚提取物，记录获得的各多酚提取物重量。按福林酚法测定各多酚提取物的多酚含量，并分别测定各多酚提取物对mda
‑
mb
‑
231三阴型乳腺癌细胞株活性，活性测定方法为mtt法，实验结果如下表3和表4所示。
[0053]
表3不同成熟阶段的菱壳多酚提取物及其多酚含量和mda
‑
mb
‑
231三阴型乳腺癌细胞毒活性测定结果
[0054][0055][0056]
表4不同品种的菱壳多酚提取物及其多酚含量和mda
‑
mb
‑
231三阴型乳腺癌细胞毒活性测定结果
对多酚提取物的吸附率最高，其吸附率为79.31％，其他4种大孔吸附的吸附率从高到低依次是hpd100、hp20、d101、nka
‑
9。
[0072]
将上述五种吸附后的大孔吸附树脂分别用抽滤装置抽滤，用3ml蒸馏水冲洗去表面残余物质，并吸干表面水分。再置于50ml锥形瓶中，加入25ml体积分数60％乙醇，用锡箔纸封口，同样在30℃，100r/min恒温振荡器中充分解吸附8h，每组平行设置3份。取上清液，按福林酚法分别测定解吸附后多酚质量浓度(c2)，计算解吸附率。由实验结果(图6) 可知，ab
‑
8大孔吸附树脂的解吸附率最高，其解吸附率为95.28％。
[0073]
综上，ab
‑
8、d101、hp100、hpd400、nka
‑
9五种大孔吸附树脂中，ab
‑
8大孔吸附树脂对菱壳多酚提取物的吸附率和解吸附率均最高，更适合菱壳多酚提取物的纯化。
[0074]
3上样条件优化
[0075]
取预处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各1.0g于锥形瓶中，分别加入质量浓度为0.125、0.25、 0.5、1、2mg/ml的菱壳多酚提取物溶液(上样液)25ml，置于30℃，100r/min的恒温振荡器中吸附4h，每组平行设置3份。取上清，按福林酚法分别测定吸附前(c0)和吸附后(c1) 多酚质量浓度，计算吸附率。由实验结果(图7)可知，上样液质量浓度为0.5mg/ml时大孔树脂对菱壳多酚的吸附率最高，为85.14％，且上样液浓度由0.25mg/ml增大至0.5mg/ml 时，吸附率呈上升趋势，上样液浓度继续增大，吸附率呈下降趋势，故最佳的上样液浓度为0.5mg/ml。
[0076]
用盐酸调节上样液ph，得ph分别为4、3.5、3、2.5、2的0.5mg/ml的上样液。取预处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各1.0g于锥形瓶中，分别加入ph值为4、3.5、3、2.5、2的上样液25ml。置于30℃，100r/min的恒温振荡器中吸附4h，每组平行设置3份。取上清，按福林酚法分别测定吸附前(c0)和吸附后(c1)多酚质量浓度，计算吸附率。由实验结果(图8)可知，吸附率随着上样液ph值的降低而升高，将低至3.0时，变化变缓，当ph 为2.5时吸附率达到最大(为91.15％)，再进一步降低ph值，吸附率开始降低，故优选的上样液ph范围为2.0至3.0，最佳ph为2.5。
[0077]
取预处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各4.0g，湿法上柱，取ph为2.5的0.5mg/ml的上样液，分别以0.5ml/min、2.0ml/min和5.0ml/min的流速上样，同时收集下端流出液，每组平行设置3份。取流出液，按按福林酚法分别测定吸附后多酚质量浓度(c1)，计算吸附率。由实验解果(图9)可知，吸附率随着流速的增加而降低，当流速为0.5ml/min时，吸附率最高，为99％，所以选择上样液浓度为0.5ml/min。
[0078]
综上，优化后的最佳上样条件为：上样液浓度为0.5mg/ml，上样液ph为2.5，上样流速为0.5ml/min。
[0079]
4解吸附条件优化
[0080]
取预处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂15g于500ml锥形瓶中，量取375ml0.5mg/ml的菱壳多酚提取物溶液于500ml锥形瓶中，置于30℃，100r/min的恒温振荡器中充分振荡吸附 4h。将吸附后的大孔吸附树脂用抽滤装置抽滤，用45ml蒸馏水冲洗去表面残余物质，并吸干表面水分备用。
[0081]
取上述吸附干燥处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各1.0g于锥形瓶中，分别加入体积分数为10％、30％、50％、70％、90％的乙醇溶液25ml，置于30℃，100r/min的恒温振荡器中解吸7h，每组平行设置3份。取上清液，按福林酚法测定多酚质量浓度。由实验结果(图 10)可
知，解吸后多酚质量浓度随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数达到50％时多酚质量浓度达到最高为232.91mg/ml，而随着乙醇体积分数再次增加，解吸后多酚浓度呈现下降的趋势，因此解吸附液的最佳乙醇浓度为50％。
[0082]
取上述吸附干燥处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各1.0g于锥形瓶中，分别加入ph值为6、 5、4、3、2的解吸附液(即50％乙醇溶液，用盐酸调节ph值)，置于30℃，100r/min的恒温振荡器中解吸7h，每组平行设置3份。取上清液，按福林酚法测定多酚质量浓度。由实验结果(图11)可知，随着ph值降低，解吸出的多酚浓度呈上升趋势，到ph为4.0 时，多酚浓度最高，但当ph值进一步降低，解吸出的多酚浓度呈下降趋势，ph值为4.0 时多酚浓度达到最高(为14.16mg/ml)，故解吸液最佳ph值为4.0。
[0083]
取上述吸附干燥处理后的ab
‑
8大孔吸附树脂各3.9g，湿法上柱，用ph值为4.5的50％乙醇溶液洗脱，控制体积流量分别为0.5ml/min、2.0ml/min和5.0ml/min，每组平行设置3 份。收集下端洗脱溶液，按按福林酚法测定多酚质量浓度(c2)，计算解吸附率。结果表明(图12)解吸附效能随着流速的增加而降低，当流速为0.5ml/min时，解吸附效能最高 (吸附的菱壳多酚浓度为198.30μg/ml)，故最佳的解吸液体积浓度为0.5ml/min。
[0084]
5菱壳多酚提取物的纯化
[0085]
按上述方法对ab
‑
8大孔吸附树脂进行预处理。取35cm
×
2.5cm的玻璃色谱柱，加入 ab
‑
8大孔吸附树脂40g，以质量浓度为0.5mg/ml，ph为2.5的菱壳多酚提取物溶液作为上样液，以0.5ml/min的流速上样，上样量为300ml。以ph为4.5的50％乙醇溶液按0.5ml/min 的流速洗脱，至洗脱完全。收集洗脱液，减压浓缩，冻干得精制菱壳多酚提取物。用福林酚法测定纯化前后菱壳多酚提取物中的多酚含量，实验结果如下表5(平行三组)。
[0086]
表5纯化前后菱壳多酚提取物中的多酚含量
[0087][0088]
结果表明：纯化后获得的精制多酚提取物中多酚含量显著提高，提高了1.3倍左右。因此，用该纯化方法能有效去除菱壳多酚提取物中的杂质，得到多酚含量更高的菱壳多酚提取物。由上述实施例4可知，菱壳多酚提取物的细胞毒活性与多酚含量呈正比，通过该纯化方法获得的精制多酚提取物的细胞毒活性会更高，可应用于三阴性乳腺癌保健食品和药品的研发，且杂质低，产生干扰或副反应的概率低，安全性好。该纯化方法为菱壳多酚提取物的进一步应用提供了有力的技术支持。
[0089]
以上实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做出的的任何改动，均在本发明的保护范围之内。本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。