抗双链DNA抗体检测试剂盒及其应用的制作方法

抗双链dna抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种抗双链dna抗体检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.在ivd行业中，我们通常所说的免疫反应是指免疫应答过程中抗原与其所诱导产生的对应抗体特异性结合的反应。通过利用已知的抗原检测对应抗体或已知的抗体检测对应抗原的方法，从而达到定性或定量判定受试样品中某一种抗原或抗体的目的。
3.目前，抗原抗体反应常用的检测方法包括荧光免疫、酶联免疫和化学发光等。其中，化学发光法一般是先将已知的某种抗原或抗体固定在特定的固相载体上，再加入待测样本，通过抗原抗体反应检测待测样本中的物质。尽管抗原抗体反应是一种特异性的反应，但实际的实验过程中，会不可避免出现一些非特异性的反应或者吸附，导致检测出现假阳结果，进而影响临床判定。假阳结果出现的概率反映了诊断试剂特异性的好坏。在体外诊断试剂研发过程中，需尽量减少出现假阳的概率，才能保证产品的质量。因此，我们需要寻求一种方法，减少抗原抗体反应过程中的非特异性吸附。从而提高诊断试剂的特异性，保证产品的最终质量。因此，我们需要寻求一种方法，减少抗原抗体反应过程中的非特异性吸附，从而提高诊断试剂的特异性，保证产品的最终质量。
4.常见的干扰抗原抗体检测的物质有生物素、血红蛋白、甘油三酯、rf、胆红素等。传统抗双链dna抗体的检测是将双链dna固定在塑料板上以检测样本中的抗双链dna抗体。然而，在检测时样本中带正电荷的物质会与带负电荷双链dna进行结合，造成非特异性的反应引起假阳性结果。


技术实现要素：

5.基于此，有必要针对抗双链dna抗体中样本中带正电荷的物质造成的假阳性问题，提供一种抗双链dna抗体检测试剂盒及其应用。
6.一种抗双链dna抗体检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包括包被有双链dna的固相载体、r1分散剂和肝素，所述r2试剂包括标记有信号物质的二抗，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml以上；
7.或者，
8.所述试剂盒包括r1试剂、r2试剂和r3试剂，所述r1试剂包括包被有双链dna的固相载体和r1分散剂，所述r2试剂包括标记有信号物质的二抗，所述r3试剂包括r3分散剂，肝素存在于所述r1试剂或所述r3试剂中，或同时存在于所述r1试剂和所述r3试剂中，
9.所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml以上；和/或，所述肝素在所述r3试剂中的浓度为1mg/ml以上；
10.所述二抗为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
11.在其中一些实施例中，所述免疫球蛋白为igg、igm或iga中的至少任意一种。
12.在其中一些实施例中，所述固相载体为磁微粒，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～100mg/ml；优选地，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～10mg/ml；优选地，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～2mg/ml。
13.在其中一些实施例中，所述包被有双链dna的固相载体在r1试剂中的浓度为0.2mg/ml～0.6mg/ml；优选地，所述包被有双链dna的固相载体在r1试剂中的浓度为0.2mg/ml～0.4mg/ml。
14.在其中一些实施例中，所述包被有双链dna的固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(1～10):1000；优选地，包被有双链dna的固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(2～10):1000；优选地，包被有双链dna的固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(2～5):1000；优选地，每1mg固相载体上包被有2μg～5μg双链dna。
15.在其中一些实施例中，所述肝素选自肝素的可溶性盐；优选地，所述肝素选自肝素钠、肝素钾、肝素锂和肝素钙中的一种或多种。
16.在其中一些实施例中，所述信号物质选自荧光团、比色标记、量子点、胶体金、生物素、用于拉曼衍射成像的炔烃基团、用于click反应的环烯烃、用于聚合物标记的引发基团、多肽/蛋白分子、lna/pna、非天然氨基酸及其类似物、非天然核酸及其类似物和纳米结构中的任意一种或多种；
17.优选地，所述信号物质为荧光团；
18.优选地，所述信号物质为吖啶类。
19.在其中一些实施例中，所述r1分散剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种；和/或，
20.所述r2试剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种；和/或，
21.所述r3分散剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种。
22.在其中一些实施例中，所述包被有双链dna的固相载体中的双链dna与固相载体的连接方式为共价连接或者非共价连接；优选地，所述双链dna与固相载体的连接方式为共价连接；优选地，所述固相载体偶联有链霉亲和素，所述双链dna连接有生物素，所述双链dna通过生物素和链霉亲和素包被于所述固相载体上；优选地，所述固相载体偶联有链霉亲和素，所述链霉亲和素上结合有多聚赖氨酸标记的生物素，所述双链dna通过多聚赖氨酸包被于所述固相载体上。
23.上述试剂盒在制备用于诊断系统性红斑狼疮的诊断试剂或试剂盒中的应用。
24.本发明旨在降低抗双链dna抗体检测中的非特异性干扰，通过在含有双链dna包被固相载体的分散试剂中加入肝素以达到此目的。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的
技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.双链脱氧核糖核酸(double stranded dna，dsdna)抗体是一种能够与天然dna结合的自身抗体。在绝大多数系统性红斑狼疮(sle)患者的血清中均存在该抗体，其与sle的病理变化、活动性、疗效及预后有很密切的关系。
28.因此，对于抗双链dna抗体igg的检测成为sle诊断、以及病情追踪和预后判断等具有重要意义。
29.一方面，本发明实施例提供一种抗双链dna抗体检测试剂盒，包括包被有双链dna的固相载体、标记有信号物质的二抗和肝素。在所述试剂盒中，所述肝素至少部分分散于溶液中，该溶液为含有所述包被有双链dna的固相载体的溶液，或者，所述肝素单独以溶液形式存在于所述试剂盒中。所述肝素在溶液中的浓度为1mg/ml以上；所述二抗为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。
30.本发明旨在降低抗双链dna抗体检测中的非特异性干扰，通过在含有双链dna包被固相载体的分散试剂中加入肝素以达到此目的。
31.所述包被双链dna抗原的固相载体以分散液的形式存在。
32.所述肝素至少存在于所述试剂盒的分散液中。
33.所述包被有双链dna的固相载体和肝素的分散液混合物可直接与受试样品反应，然后反应物与标记有信号物质的二抗反应，通过信号物质指征反应结果。
34.在一些实施方式中，所述试剂盒包括r1试剂和r2试剂，所述r1试剂包括所述包被有双链dna的固相载体和r1分散剂，所述r2试剂包括所述二抗，所述肝素存在于所述r1试剂中。
35.在一些实施方式中，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～100mg/ml，例如为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml。在一些实施方式中，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～10mg/ml。优选地，所述肝素在所述r1试剂中的浓度为1mg/ml～2mg/ml。
36.在一些实施方式中，所述试剂盒包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。所述r1试剂包括所述包被有双链dna的固相载体和r1分散剂。所述r2试剂包括所述二抗。优选地，所述r2试剂包括r2分散液。所述r3试剂包括r3分散剂，所述肝素存在于所述r1试剂或所述r3试剂中，或同时存在于所述r1试剂和所述r3试剂中。所述肝素在所述r1试剂中的浓度优选为1mg/ml以上。所述肝素在所述r3试剂中的浓度优选为1mg/ml以上。
37.在一些实施方式中，所述肝素选自肝素的可溶性盐。优选地，所述肝素选自肝素钠、肝素钾、肝素锂和肝素钙中的一种或多种。
38.在一些实施方式中，所述包被有双链dna的固相载体在r1试剂中的浓度为0.2mg/ml～0.6mg/ml。例如0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml或0.6mg/ml。优选地，所述包被有双链dna的固相载体在r1试剂中的浓度为0.2mg/ml～0.4mg/ml。
39.在一些实施方式中，所述包被有双链dna的固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(1～10):1000。具体的，双链dna和固相载体的质量比例可以为1:1000、2:1000、3:1000、4:1000、5:1000、6:1000、7:1000、8:1000、9:1000、10:1000。优选地，包被有双链dna的
固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(2～10):1000。优选地，包被有双链dna的固相载体中，双链dna和固相载体的质量比例为(2～5):1000。优选地，每1mg固相载体上包被有2μg～5μg双链dna。
40.优选的，所述固相载体为铁基材料，如磁微粒。例如fe2o3或fe3o4。可选地，所述铁基材料的表面具有功能性的包覆层，例如sio2。优选的，实施磁微粒为球形。相对于常规的固相载体，如相对于塑料板，磁微粒可通过快速液相动力学，快速有效地捕获生物素化分子，提高了速度和灵敏度。并且，因磁微粒为球体，单位体积的表面积大，可实现高效且稳定的结合能力。
41.在一些实施方式中，所述固相载体的粒径为50nm～5μm，例如50nm、80nm、100nm、150nm、180nm、200nm、230nm、250nm、280nm、300nm、350nm、380nm、400nm、450nm、480nm、500nm、1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。
42.在一些实施方式中，所述包被有双链dna的固相载体中的双链dna与固相载体的连接方式为共价连接或者非共价连接。优选地，所述双链dna与固相载体的连接方式为共价连接，共价结合能够提高双链dna在固相载体上的结合牢固性，避免双链dna的掉落而损失结合率。在一些实施方式中，所述固相载体偶联有链霉亲和素，所述双链dna连接有生物素，所述双链dna通过生物素和链霉亲和素包被于所述固相载体上。在一些实施方式中，所述固相载体偶联有链霉亲和素，所述链霉亲和素上结合有多聚赖氨酸标记的生物素，所述双链dna通过多聚赖氨酸包被于所述固相载体上。
43.所述二抗为抗受试样品来源种属免疫球蛋白的抗体。优选所述免疫球蛋白为igg、igm或iga中的至少任意一种。
44.在一些实施方式中，所述二抗与受试样品具有不同的种属来源。例如受试样品来自人，则二抗可选自鼠抗人igg单克隆抗体、兔抗人igg单克隆抗体等。
45.在一些实施方式中，信号物质指可用于提供可检测的(优选可定量的)效果且可以连接至二抗的任何原子或分子。信号物质包括但不限于染料；放射性标记，诸如
32
p；结合部分诸如生物素；半抗原诸如地高辛；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。信号物质可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。信号物质可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。信号物质可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
46.在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，lna/pna，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，nv
‑
center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
47.优选地，所述信号物质为荧光团。
48.在一些实施方式中，所述荧光团可选自荧光素类染料、罗丹明类染料以及菁染料。
49.在一些实施方式中，所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(fitc)、羟基荧光素(fam)、四氯荧光素(tet)等。
50.在一些实施方式中，所述罗丹明类染料包括r101、四乙基罗丹明(rb200)和羧基四甲基罗丹明(tamra)等。
51.在一些实施方式中，所述菁染料主要选自两类，一类是噻唑橙(thiazole or ange,to)、噁唑橙(oxazole orange,yo)系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。
52.在一些实施方式中，荧光团还可以选择下述染料：二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。
53.在一些实施方式中，r1分散剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种。
54.在一些实施方式中，所述r2试剂包括r2分散剂。r2分散剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种。
55.在一些实施方式中，所述r3分散剂包括缓冲基质、无机盐、稳定剂、糖类、表面活性剂及防腐剂中的一种或多种。
56.所述r1试剂、r2试剂、r3试剂中的缓冲基质各自独立地选自磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、hepes缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液、tris盐酸缓冲液中的至少一种，优选tris盐酸缓冲液。
57.所述r1试剂、r2试剂、r3试剂中的稳定剂各自独立地选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白(bsa)、甘露醇、酪蛋白中的至少一种；优选r1试剂的稳定剂为甘露醇、牛血清白蛋白、丙三醇中的一种或多种，r2试剂的稳定剂为海藻糖、酪蛋白、丙三醇中的一种或多种；r3试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白中的一种或多种。
58.所述r1试剂、r2试剂、r3试剂中的表面活性剂各自独立地选自tween20、tween
‑
80、span
‑
60、triton x
‑
45、triton x
‑
100或triton x
‑
305中的至少一种。
59.所述r1试剂、r2试剂、r3试剂中的无机盐各自独立地选自钠盐、钾盐中的至少一种，优选氯化钠。
60.所述r1试剂、r2试剂、r3试剂中的防腐剂各自独立地选自krovin系列防腐剂、proclin系列防腐剂或叠氮钠中的至少一种，优选proclin300(pc300)。
61.在一些实施方式中，r1试剂包括10mmol/l～200mmol/l的缓冲液、150mmol/l～600mmol/l的无机盐离子、10g/l～50g/l的稳定剂、0.1ml/l～1.0ml/l的表面活性剂、0.1ml/l～6ml/l的防腐剂；
62.在一些实施方式中，r2试剂包括10mmol/l～200mmol/l的缓冲液、150mmol/l～600mmol/l的无机盐离子、10g/l～50g/l的稳定剂、0.1ml/l～1.0ml/l的表面活性剂、0.1ml/l～6ml/l的防腐剂。
63.另一方面，本发明提供了如上所述的抗双链dna抗体igg测定试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：双链dna抗原的制备；固相载体的制备；信号物质标记的二抗的制备。
64.在一些实施方式中，所述固相载体偶联有链霉亲和素，所述双链dna连接有生物素，所述双链dna通过生物素和链霉亲和素包被于所述固相载体上。所述制备方法如下：
65.(1)将链霉亲和素溶液加入固相载体中进行偶联反应，得到链霉亲和素偶联的固相载体；
66.(2)将生物素化的双链dna抗原溶液加入链霉亲和素偶联的固相载体中进行孵育包被，得到所述包被双链dna抗原的固相载体。
67.在一些实施方式中，所述生物素化的双链dna抗原的制备方法可以为：暗室中，取dsdna和光敏生物素按比例混匀，高压汞灯照射15
‑
20min，期间每隔3
‑
5min混匀一次；正常光照下，用2倍体积正丁醇萃取两次，每次离心13000g离心5min，去上清；后加入2.5倍体积的
‑
20℃预冷的无水乙醇，
‑
20℃静置过夜，13000g离心10min，去上清，沉淀用乙醇洗涤，沉淀干燥后复溶，得到所述生物素化的双链dna抗原。
68.在另一实施方式中，dna与生物素之间形成酰胺键得到生物素化的双链dna。
69.在一些实施方式中，所述链霉亲和素包被的固相载体的制备方法可以为：取柠檬酸修饰的固相载体悬浮液，磁分离去上清，缓冲液重悬，加入水溶液，活化固相载体表面羧基，加入链酶亲和素，室温下混悬2
‑
10h，磁分离，去除上清，缓冲液重悬，得到链酶亲和素包被的固相载体。
70.在一些实施方式中，信号物质(例如吖啶酯)标记的二抗的制备方法可以为：取二抗，加入缓冲液(例如碳酸盐)，混匀，然后加入信号物质混匀，室温下避光反应，1
‑
2h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水和/或缓冲液进行处理，最后加入得到的二抗的信号物质溶液，收集离心管中的液体至保存管得到二抗的信号物质标记物。
71.再一方面，本发明还提供上述实施例的包被有双链dna的固相载体、标记有信号物质的二抗和肝素联合在制备用于诊断系统性红斑狼疮的诊断试剂或试剂盒中的应用。
72.再一方面，本发明提供上述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
73.先将含有肝素的r1试剂与受试样品反应；然后添加r2试剂进行二抗反应，使得肝素先与受试样品接触。
74.或者，先将含有肝素的r1试剂和/或r3试剂与受试样品反应；然后添加r2试剂进行二抗反应，使得肝素先与受试样品接触。
75.以下为具体实施例。
76.各实施例基础组分为下表1所示：
77.表1
78.[0079][0080]
检测方法：
[0081]
采用迈克生物全自动化学发光免疫分析仪利用间接法原理进行检测，取10μl样本、50μlr1试剂、100μlr3试剂混合，反应10min后洗涤；然后加入100μlr2试剂混合，继续反应10min后洗涤，最后加入底物液，测量rlu值。
[0082]
实施例1
[0083]
本实施例中，分别在试剂r1中加入肝素钠的浓度0(不加肝素钠，对照)、浓度1(0.01mg/ml)、浓度2(0.1mg/ml)、浓度3(1mg/ml)、浓度4(10mg/ml)、浓度5(100mg/ml)，试剂r1的磁微粒浓度为0.4mg/ml、双链dna包被量为5μg/mg，其余成分同表1。检测结果如表2所示；
[0084]
表2：不同肝素钠浓度检测结果
[0085]
[0086][0087]
注：样本q1～q10经inova(dsdna)试剂盒检测显示为阴性，鉴定为健康人群样本；样本s11～s20经inova(dsdna)试剂盒检测显示为阳性，鉴定为临床患者样本；
[0088]
结论：随着肝素钠用量增加，rlu值逐渐降低，整体趋势逐渐变缓，当含量为1mg/ml时达到平台期，因此认为，当肝素钠的含量为1mg/ml时消除假阳效果最佳。
[0089]
实施例2
[0090]
在试剂r1中的肝素钠浓度为1mg/ml，双链dna包被比例为5μg/mg的条件下，分别在试剂r1中加入不同浓度磁微粒(0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml)，其余成分同表1。检测结果如表3所示；
[0091]
表3：不同浓度磁微粒检测结果
[0092][0093][0094]
结论：与不添加肝素钠的试剂盒相比，在试剂r1中添加肝素后，无论试剂r1磁微粒的浓度大小，其检测的rlu值均明显降低，可以认为，在试剂r1中添加肝素钠可以有效消除假阳性。
[0095]
与0.6mg/ml相比，当磁微粒浓度为0.4mg/ml时，样本检测的rlu值变化更大。即当磁微粒浓度增加到0.4mg/ml时，rlu值变化趋势减缓。因此可以认为，磁微粒浓度为0.4mg/
ml时，检出效果最佳。
[0096]
实施例3
[0097]
在试剂r1中的肝素钠浓度为1mg/ml、磁微粒浓度为0.4mg/ml的条件下，调整试剂r1中双链dna包被量分别为1μg/mg、2μg/mg、5μg/mg、10μg/mg。其余成分同表1。检测结果如表4所示；
[0098]
表4：双链dna不同包被比例检测结果
[0099][0100]
结论：含肝素条件下，随双链dna包被量增加，样本rlu值明显升高，当包被量为2μg/mg时，随机正常样本的rlu值变化较小，更利于去除假阳性。阳性样本的rlu值随着双链dna包被量的增加变化率逐渐放缓，因此认为2μg/mg包被量检测效果最佳。
[0101]
实施例4
[0102]
将多聚赖氨酸标记生物素后包被于偶联有链霉亲和素的磁微粒上，然后双链dna以5μg/mg比例与多聚赖氨酸非共价结合并包被在磁微粒上，最后将磁微粒稀释至0.4mg/ml，在试剂r1中加入1mg/ml肝素钠，其余成分同表1；检测、结果如表5所示；
[0103]
表5：多聚赖氨酸连接方式检测结果
[0104][0105]
结论：使用多聚赖氨酸的连接方式，添加肝素钠后仍具有消除假阳的作用。因此认为，双链dna抗原包被磁微粒的方式不影响肝素钠的抗干扰能力。
[0106]
实施例5
[0107]
本实施例中，将肝素钠(1mg/ml)添加到试剂r3组分中，其余成分同表1，
[0108]
检测结果如表6所示；
[0109]
表6：r3组分中含肝素钠检测结果
[0110]
[0111][0112]
结论：在试剂反应体系中，无论将肝素添加至r3组分中、还是试剂r1中，都能使本发明的抗双链dna抗体检测试剂盒在使用时，具有消除样本检测假阳性的作用。
[0113]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0114]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。