一种治疗结肠炎的基因编辑前药系统及其应用的制作方法

1.本发明涉及药剂学、药物化学、合成生物学等领域，具体涉及一种治疗结肠炎的基因编辑前药系统及其应用。这是一种基因编辑前药系统递送不稳定cas9(dscas9)核酸酶的质粒dna，可达到精准治疗结肠炎并降低脱靶问题的全新策略。


背景技术：

2.借助来自细菌成簇、规则间隔、短回文重复序列(crispr)/相关蛋白9(cas9)的rna引导的核酸内切酶进行基因组工程，是一种简便、强大的工具，可以高度特异性地编辑基因组。基于crispr/cas9的基因组编辑技术在基础科学、医学和生物技术的广泛应用中具有巨大的潜力，特别是，使用crispr/cas9进行基因组编辑已显示出治疗遗传疾病的巨大疗效，例如杜氏肌营养不良综合征和β
‑
血红蛋白病。此外，基于crispr/cas9的治疗性基因组编辑也正在成为缓解或治疗难治性炎症疾病的潜在选择。野生型cas9核酸酶以持续的活性状态工作，常用于体内治疗性基因组编辑；然而，由于组织水平的脱靶，cas9核酸酶的非特异性分布引起了安全问题。例如，腺相关病毒(aav)介导的crispr/cas9递送已显示在非特异性器官(如肝脏、心脏、大脑和肌肉)中积累，这仍然是基因毒性的主要问题。为此，许多研究致力于开发光学策略，如通过响应体内光照射调节cas9活性提高空间特异性。尽管光对cas9功能的调节呈现出独特的特征，例如非侵入性和可逆性，但在体内研究中，操作方式受到光的穿透深度的影响，尤其是编辑在深层组织或器官的基因组。
3.通过小分子调节cas9功能的化学控制的方法开辟了在转录和转录后水平调节cas9活性的新途径。一般来说，cas9功能的化学控制利用了定制小分子激活或抑制cas9核酸酶活性的能力。目前已经报道了几种化学控制策略，例如不稳定的cas9系统、自剪接intein
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cas9系统和分裂型cas9系统的二聚化，实现时空特异性的cas9基因组编辑。与光不同，小分子可以以需要的方式进行靶器官的递送，从给药部位到深层组织，消除了光学调控所具有的穿透深度的限制。然而，小分子对跨时间和空间维度的cas9活性的精确调节尚未在体内得到证实，并且由于以下原因仍然难以实现。首先，只有小分子调节剂和化学调控型crispr/cas9系统同时到达目标组织，才能恢复crispr/cas9的活性，用于靶向基因组编辑。其次，尽管靶向递送可以改善质粒或蛋白在靶器官中的积累，但由于质粒或蛋白在递送过程中固有的泄漏而导致的crispr/cas9的组织/器官的非特异性分布和激活仍然是不可避免的。第三，应将两种载荷共同装载到单个递送载体中，以达到预期的放大crispr/cas9的活性和治疗效果。
4.研究表明，小分子化合物诱导的基因编辑系统可以通过对药物小分子的浓度控制实现基因编辑的强度调控,解决了crispr/cas9持续表达并切割dna的问题,显著降低脱靶效应，但目前这些小分子化合物诱导的基因编辑系统仍存在诸多以下缺陷：首先,目前用于小分子化合物诱导的基因编辑系统激活的小分子多数为非水溶性分子，在体外的细胞实验中，常需要助溶剂二甲基亚砜(dmso)增加其在培养基的溶解度，而可以用于此类编辑工具的活体递送生物安全性高的材料仍未见报道；其次，其中大多数该系统对小分子的浓度不
敏感，需要较高的药物浓度才可以实现基因编辑系统的有效调控，而外源小分子的大量积累，也同样存在着细胞毒性以及生物安全性等一系列担忧；最后,这些研究现均使用的是商品化核酸转染试剂递送，由于转染试剂不具有响应性，因而很难达到预期上的基因编辑功能调控的效果。此外，如何制备具有炎症环境响应的聚前药阳离子高分子核酸转染试剂以及可递送优化的小分子化合物诱导的基因编辑系统也是关键问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种治疗结肠炎的基因编辑前药系统，所述基因编辑前药系统包括：(a)阳离子聚(β
‑
氨基酯)(简称pbae)，能够复合编码不稳定cas9(dscas9)核酸酶的质粒dna；(b)一层涂在pbae/质粒dna纳米复合物上的仿生巨噬细胞膜，用于靶向递送pbae/dscas9复合物；(c)刺激响应前体分子bam
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tk
‑
tmp锚定在外膜上。
6.所述的一种治疗结肠炎的基因编辑前药系统中，阳离子聚(β
‑
氨基酯)(pbae)是一种阳离子聚合物，与编码具有二氢叶酸还原酶(dhfr)结构域的不稳定cas9(dscas9)序列的质粒以形成pbae/质粒dna复合物。所述的涂在pbae/质粒dna纳米复合物上的仿生巨噬细胞膜是通过挤压法从raw264.7细胞获得，包被pbae/质粒dna复合物形成膜包被的复合物为ppmm(巨噬细胞膜包被的pbae/质粒dna复合物)，用于靶向递送。在所述的一种治疗结肠炎的基因编辑前药系统中，刺激响应前体分子锚定在膜包被的复合物(ppmm)的外膜上。用于dscas9的小分子稳定剂(tmp)通过硫缩酮接头与oe
‑
peg共价结合以获得ros响应性bam
‑
tk
‑
tmp，其进一步锚定在ppmm的膜上以获得ppmmt复合物。
7.在一些实施方式中，其中所述阳离子聚(β
‑
氨基酯)(pbae)与质粒dna以氮磷比(n/p)为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1复合形成一系列的pbae/质粒纳米复合物，其中最佳氮磷比值(n/p)为4:1，n/p值计算为pbae中带正电荷的胺与质粒dna中带负电荷的磷酸基团的比率。
8.在一些实施方式中，其中所述仿生巨噬细胞膜与pbae/质粒纳米复合物(pbae/质粒dna总质量)的质量比为1:1，孵育5分钟形成膜包被的纳米复合物称为ppmm。
9.在一些实施方式中，其中所述刺激响应前体分子bam
‑
tk
‑
tmp的终浓度为30μm，将bam
‑
tk
‑
tmp溶液加入ppmm溶液中，孵育20分钟形成ppmmt复合物。
10.本发明的另一个目的是提供上述的基因编辑前药系统在制备用于治疗结肠炎药物中的应用。
11.本发明的基因编辑前药系统基因编辑前药的全身给药能够将dscas9质粒靶向递送到结肠的炎症病变中，通过ros信号激活前体小分子以稳定表达的dscas9，从而激活cas9功能进行炎症的基因组编辑。我们在此提出了第一个位点特异性、可激活的crispr/cas9纳米前药系统(称为nanoprocas9)，该系统结合了靶向递送和crispr/cas9响应体内特定生物信号的条件激活。nanoprocas9的设计如下。首先，聚(β
‑
氨基酯)(pbae)，一种能够有效递送核酸的阳离子聚合物用于递送编码具有二氢叶酸还原酶(dhfr)结构域的不稳定cas9(dscas9)的质粒dna。随后，利用一层仿生巨噬细胞膜涂覆在pbae/质粒纳米复合物表面，以实现dscas9靶向递送至结肠的炎症病变部位。最后，具有疏水尾部的活性氧(ros)响应性前体分子(称为bam
‑
tk
‑
tmp)通过脂质融合锚定在巨噬细胞外表面膜上。在nanoprocas9经全身给药后，仿生巨噬细胞膜可以将nanoprocas9引导至炎症病灶，小分子可以被ros信号激活以释放其活性形式甲氧苄啶(tmp)。因此，表达的dscas9只有在tmp存在下才变得稳定和
具备活性，并发挥其基因组编辑功能进而修饰目标基因组位点。然而，在无活性的bam
‑
tk
‑
tmp或tmp不存在的情况下，结构不稳定的dscas9会迅速受到泛素依赖性的蛋白酶体降解，从而失去其用于编辑目标基因组位点的核酸酶活性。由于tmp易于定制以响应其他病理和生理信号，例如atp、氧化还原、ph、酶等信号，这样的基因编辑前药系统可作为一个有吸引力的平台，用于有效递送和靶向激活crispr/cas9，用于体内精确基因组编辑。
12.本发明设计了一种可条件激活的crispr/cas9纳米组装体，可作为精确炎症基因组编辑的前药。作为基因组编辑前药，dscas9在非特异性组织中经历泛素依赖性蛋白酶体降解，在被递送至结肠病变部位后变得稳定并发挥功能，在ros刺激下可以释放前体小分子稳定剂转化为它的活跃形式。重要的是，基因编辑前药的条件激活可以提供深层组织基因组编辑，这很好地避免了先前crispr/cas9光学调节所遭受的穿透深度挑战。巨噬细胞膜不仅在将基因编辑前药导向炎症病变方面发挥重要作用，而且还作为锚定小分子稳定剂的支持物。因此，基因编辑前药的全身给药能够将dscas9质粒靶向递送到结肠病变部位中，在那里前体小分子可以在ros信号下转化为其活性形式，以稳定表达的dscas9。这也解释了为什么基因编辑前药系统介导的基因组编辑以位点特异性方式呈现，并且可以仅在炎症病变中被激活。
13.本发明发现巨噬细胞膜包被的递送囊泡可以优先靶向炎症病变；然而，当编码野生型cas9的质粒被递送时，这些仿生纳米颗粒中有很大一部分被肝脏中的mps(其次是肺和脾脏)捕获，导致显着的非靶向、非特异性基因组编辑这些器官。到目前为止，已经报道了几种其他有效的方法来减轻肝脏中的非特异性基因组编辑。例如，siegwart及其同事报告了一种选择性器官靶向(sort)策略，通过该策略，添加成分(sort分子)的基于脂质的纳米粒子可以选择性地将cas9 mrna递送到目标组织，这是一种吸引人的方法来最大限度地减少肝脏中的非特异性编辑。避免肝脏中非特异性编辑的另一种可能策略是用诱导型启动子或仅在特定生物环境中有活性的启动子表达cas9。不幸的是，在这些报道的系统中，肝脏中的非特异性基因组编辑在很大程度上尚未得到探索。在目前的研究中，基因编辑前药作为一种基因组编辑前药系统，可以显着减少肝脏中的非特异性编辑，indel频率低于3％。这些令人鼓舞的结果表明基因编辑前药系统通常在肝脏中是惰性的，尽管其非特异性分布。
14.本发明设计的基因编辑前药系统集成了crispr/cas9的靶向递送和条件激活，为炎症疾病提供了精确的、特定于位点的治疗性基因组编辑。这样的系统可以避免非靶向位点的脱靶突变，从而最大限度地减少那些非特异性组织或器官的潜在基因毒性。基因编辑前药系统代表了一种创新的基因组编辑前药，可以扩展到许多其他炎症性疾病，如肺/肝损伤、动脉粥样硬化和中风。凭借类似的工程原理，这种可诱导的crispr系统也可以针对除了基因组编辑之外还需要表观遗传调控或rna编辑的临床场景进行定制。总的来说，当前发明设计的基因组编辑前药系统为基于crispr/cas9的系统的合理设计提供了新的设计方案，用于安全、精确的基因组编辑以加速临床转化成型。
附图说明
15.图1是基因编辑前药系统中巨噬细胞膜(mm)、pbae/质粒纳米复合物(np)和包被pbae/质粒dna复合物形成膜包被的复合物(ppmm)的形态和尺寸分布。
16.图2是基因编辑前药系统中巨噬细胞膜(mm)、pbae/质粒纳米复合物(np)和包被
pbae/质粒dna复合物形成膜包被的复合物(ppmm)的zeta电势分析。
17.图3是基因编辑前药系统中mm和ppmm的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分析。
18.图4是基因编辑前药系统中np、mm和ppmm细胞膜蛋白的蛋白质印迹分析。
19.图5是在100μm或1mm h2o2存在下，bam
‑
tk
‑
tmp中tmp的释放曲线固定在细胞膜上。释放的tmp通过uv
‑
vis进行量化。
20.图6是在存在从其前体分子(bam
‑
tk
‑
tmp)释放的tmp的情况下稳定dscas9的示意图(上部)以及ppmmt介导的转染后cas9蛋白表达的蛋白质印迹分析(下部)。
21.图7是基因编辑前药系统中各组分在ct26细胞的活力检测(cck
‑
8以及ldh释放)。
22.图8是在ppmmt介导的编码野生型cas9或dscas9靶向phd2基因座的质粒转染后，ct26细胞的phd2基因座的t7e1插入缺失分析。
23.图9是基因编辑前药系统在治疗结肠炎后小鼠结肠长度的测量值。
24.图10是基因编辑前药系统在治疗结肠炎后小鼠体重的变化。
25.图11是ppmmt(质粒编码dscas9)或ppmmt
‑
wt(质粒编码野生型cas9)处理后各器官phd2突变频率深度测序结果。
26.图12是基因编辑前药系统在治疗后小鼠结肠组织的组织学染色。
具体实施方式
27.结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
28.实施例1：基因编辑前药系统的制备及其形态学表征
29.本实施例1包括按质量百分比计的以下原料：二甲基亚砜(dmso)、醋酸钙缓冲液(25mm,ph＝5.2)、细胞膜提取试剂、其余为水
30.实施例1的制备方法：
31.pbae/质粒纳米复合物(np)的制备：pbae溶解在二甲基亚砜(dmso)中，浓度为100mg/ml。pbae和质粒分别以等体积完全溶解在醋酸钙缓冲液(25mm,ph＝5.2)中。室温孵育3分钟后，将醋酸钙缓冲溶液中的pbae加入醋酸钙溶液质粒中，快速上下吸移混合。在室温下孵育30分钟后获得pbae/质粒纳米复合物，并用10倍体积的pbs或培养基稀释。
32.巨噬细胞膜(mm)的制备：首先，将1
×
108raw 264.7细胞收集在15ml离心管中。用冷的1
×
pbs洗涤2次后，将细胞用细胞膜提取试剂重新悬浮，并分入两个1.5ml离心管中。在冰浴中孵育10～15分钟，然后在液氮和室温下冻融3次。悬浮液进一步离心(700
×
g，4℃)10分钟以去除细胞核和完整细胞。将上清液在4℃、14000
×
g下离心30分钟以获得细胞膜碎片。将细胞膜片段重悬于ddh2o中，根据供应商提供的说明书通过bca测定和sds
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page测定浓度和细胞膜蛋白。
33.pbae/质粒纳米复合物@巨噬细胞膜(ppmm)的制备：将pbae/质粒复合物以1:1的重量比一次加入含有巨噬细胞膜的溶液中，室温孵育5分钟，然后超声5分钟。之后，将上述混
biotech co.,ltd)进行纯化.然后，按照供应商提供的协议，总共使用200ng pcr产物进行t7e1检测。用新鲜tae缓冲液中的2％琼脂糖凝胶通过电泳(120v，30分钟)分析消化的pcr产物。被破坏的片段通过凝胶文档系统(c150，azure biosystems，usa)成像。imagej用于量化消化带(n)和未消化(m)带的灰度级。indel百分比分析用以下公式计算：[1
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(1
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(n/(m n)))1/2]
×
100％。
[0046]
t
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a克隆和sanger测序分析研究：将扩增的dna片段按照tsingke co.,ltd.提供的方案克隆到t载体中。将所得产物转化dh5α，包被平板，选择单克隆进行sanger测序。结果通过snapgene软件进行分析，将获得的dna序列与目标基因位点进行比对。
[0047]
实施例2的实验结果：基因编辑前药系统体外介导的基因组编辑的细胞内递送和条件激活验证
[0048]
如图6所示，通过蛋白质印迹分析研究了flag标记的cas9的蛋白质表达，在ppmmt介导的编码野生型cas9的质粒(wt组)转染后，可以清楚地观察到野生型cas9(166kda)的蛋白条带，而在ppmmt介导后几乎没有观察到在没有h2o2刺激的情况下转染编码dscas9的质粒(未刺激组)。相比之下，dscas9带(201kda)在刺激(刺激组)后变得可见，这表明着dscas9被释放的tmp稳定。
[0049]
如图7所示，在np(pbae/质粒纳米复合物)、mm(巨噬细胞膜)、bam
‑
tk
‑
tmp和ppmmt(pbae与编码dscas9的质粒复合)处理48小时后评估细胞活力。以未经任何处理的ct26细胞为对照组，各组浓度相当于ppmmt的终浓度。cck
‑
8检测和ldh释放试验结果表明np、mm、bam
‑
tk
‑
tmp和ppmmt表现出低毒性，几乎不影响细胞活力。
[0050]
如图8所示，未经h2o2处理的ppmmt纳米组件的递送显示出phd2基因座的微弱破坏，如t7核酸内切酶i(t7e1)消化产生的切割带所揭示的那样。与此形成鲜明对比的是，h2o2处理后切割的条带变得清晰可见，表明phd2的基因组受到强烈破坏。刺激下的插入和缺失(indel)频率达到29.2％，接近phd2位点的野生型cas9诱导的基因组突变。此外，刺激组的ta
‑
克隆的sanger测序呈现具有突变的克隆的三个序列。
[0051]
实施例3：基因编辑前药系统介导的炎症基因组编辑用于治疗结肠炎
[0052]
dss诱导肠道损伤模型的建立：6周龄雌性balb/c小鼠，平均体重20g。一般将小鼠分为五组，每组五只。四组小鼠通过饮水给药dss水溶液(4％，w/w)7天诱发急性结肠炎。剩下的一组小鼠只接受普通水。用pbs、ppmm、ppmmt和ppmmt对dss处理的小鼠进行静脉注射，其中350μl溶液含有纳米颗粒含有30μg编码dscas9和sgphd2的质粒或sgrna，n/p比为4:1；膜与纳米复合物的重量1:1的比例；质粒质量为1.5mg/kg，分别在第2天，并在治疗期间重复治疗2天。在第八天评估小鼠结肠炎的严重程度。通过疾病活动指数(0
‑
12)评估严重程度，包括体重减轻(1,1
‑
5％；2,5
‑
10％；3,10
‑
15％；4,15
‑
20％)，直肠出血(0，正常；1，半正常；2，潜血阳性；3，可见大便血迹；4，大便直肠出血)和大便稠度(0，正常；1，半正常；2，稀便；3、粘在肛门上的稀便；4、粘在肛门上的液体便)。之后，处死小鼠，采血进行血液学分析，对结肠组织拍照并采集进行elisa、qrt
‑
pcr、western blotting、组织学、t7e1、深度测序和免疫组化等分析。
[0053]
实施例3的实验结果：
[0054]
如图9和图10所示，为了进一步研究基因编辑前药在dss治疗小鼠中的治疗潜力，进行了ppmmt纳米组件的静脉内给药。基因编辑前药介导的治疗有效保护小鼠免受dss诱导
的结肠缩短和体重减轻。
[0055]
实施例4：基因编辑前药系统在体内基因组编辑特异性和病理指数
[0056]
当基因组编辑被用于治疗目的时，脱靶组织的非特异性基因组编辑是主要问题之一。为了评估组织水平的脱靶编辑，我们在用含有编码不稳定cas9(ppmmt)的质粒的ppmmt或野生型cas9(ppmmt
‑
wt)处理后从小鼠中分离出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和结肠。t7e1和深度测序分析以显示主要器官中靶基因组位点的突变程度。
[0057]
此外，治疗结束后，取小鼠结肠，4％多聚甲醛固定，(h&e)染色观察。
[0058]
实施例4的实验结果：
[0059]
如图11所示，ppmmt治疗后小鼠主要器官中几乎没有检测到明显的indel突变，而ppmmt
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wt治疗后肠炎小鼠的肝、肺和脾脏中观察到显着的phd2位点突变，导致组织脱靶效应。由于肝脏中的库普弗细胞负责外来物质的结合和/或摄取，库普弗细胞在循环过程中内化的ppmmt纳米组件可能会导致肝脏中的基因组编辑，导致肝脏中的高基因组突变ppmmt
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wt组。深度测序分析还表明，碱基缺失构成了主要的突变类型(10.60％)，其次是替换(3.91％)和插入(1.14％)。
[0060]
如图12所示，ppmmt处理的dss小鼠表现出与健康小鼠相似的肠上皮结构。结果表明，用于phd2基因基因组编辑的基因编辑前药系统的递送有利于结肠炎的治疗。
[0061]
以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。