一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症疗法正在快速进入免疫时代，而代表性免疫治疗方法，如免疫检查点抑制剂和car t细胞疗法在临床实践中取得了巨大的成功，越来越多的相关产品正在进入市场。然而，作为最早且最具前景的肿瘤免疫治疗手段，肿瘤疫苗却发展缓慢且难以突破瓶颈。肿瘤疫苗是通过向患者施用肿瘤特异性抗原并人工激活肿瘤特异性免疫应答来控制或消除肿瘤的策略。然而由于肿瘤抗原难以有效递送至淋巴结，单独使用免疫原性低，即使递送到免疫细胞中，免疫激活的效率也十分有限。并且免疫系统的激活往往需要持续长效的刺激，短时间药物作用不仅易引起强烈的毒副作用，并且免疫刺激的效率大大受限。因此，急需建立有效方法克服肿瘤抗原递送的缺陷。
3.水凝胶是具有三维网状空间结构的聚合物，它含水量高，生物相容性好，是最具有应用前景的生物材料之一，近来被广泛应用于药物释放和组织工程领域。由于水凝胶的聚合物网络中充斥着大量的水分，与机体组织十分相似，柔软、湿润的表面以及与组织的亲和力大大减少了材料对周围组织的刺激，使得水凝胶具有良好的生物相容性。自20世纪40年代以来有关水凝胶的制备工艺和理化性质的研究十分活跃，其应用也已经渗透到医药卫生、生物、食品、材料等领域，特别是作为药物递送的载体，能够持续稳定地释放药物，实现药物的局部长效作用。因此通过水凝胶递送肿瘤抗原与佐剂，可能会高效地激活抗肿瘤免疫。
4.目前，已经有一些水凝胶递送肿瘤抗原与佐剂的案例。于海军等设计了一种多肽自组装的水凝胶负载肿瘤抗原与佐剂用于抑制术后乳腺癌的复发与转移[t.wang,d.wang,h.yu,et al.nature communications,2018,9,1532]。将4t1肿瘤切除后通过次氯酸钠等预处理得到肿瘤抗原，然后将fmoc
‑
krgdk多肽与无机碱充分混匀后在70℃水浴下加热成胶，然后再将肿瘤抗原加入到凝胶中。虽然通过这种方式构建的肿瘤疫苗在一定程度上抑制了肿瘤的复发与转移，但是水凝胶的构建条件严苛，并且凝胶内部的无机碱会在一定程度上抑制抗原以及佐剂的生物活性，更重要的是负载的佐剂在50h的累计释放量接近50％，较快的释放速率不利于实现持续长效的免疫刺激。梅林等利用手术切除的小鼠肿瘤组织和新型二维光热材料黑磷量子点制备具有光热效应的肿瘤疫苗[x.ye,x.liang,q.chen,et al.acs nano 2019,13,2956]。手术切除的肿瘤组织含有个体特异性的肿瘤抗原，特别是氨基酸突变的新抗原，由此成为制备个体化肿瘤疫苗最好的材料来源，然后利用透明质酸与普朗尼可f
‑
127共混构建温敏型凝胶负载肿瘤抗原与集落刺激因子(gm
‑
csf)，从而制备出个性化光热肿瘤疫苗。在近红外光照下，皮下注射热敏水凝胶持续释放抗原，同时gm
‑
csf可以招募并激活抗原递呈细胞，从而捕获肿瘤抗原并激活肿瘤特异性t细胞。通过温敏水凝胶局部缓释递送肿瘤抗原与佐剂的策略，增强了t细胞抗肿瘤免疫应答效应，并在小鼠乳腺癌
和黑色素瘤模型中有效抑制了术后肿瘤的复发和转移。但是，肿瘤抗原与佐剂在5天时间内的释放量超过70％，药物突释的问题依旧没有解决。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗及其制备方法和应用，该肿瘤疫苗能够长期缓释所担载的抗原。
[0006]
本发明提供了一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗，制备原料包括肿瘤抗原、免疫佐剂、多臂聚乙二醇和多醛基多糖。
[0007]
在本发明中，所述肿瘤疫苗由多臂氨基聚乙二醇、多醛基葡聚糖交联制备，在两者的交联过程中负载肿瘤相关抗原、免疫佐剂等。
[0008]
在本发明中，所述多臂聚乙二醇为末端氨基封端的聚乙二醇；所述多臂聚乙二醇选自含有氨基、羟胺基和酰肼基基团的8臂聚乙二醇和/或含有氨基、羟胺基和酰肼基基团的4臂聚乙二醇；更优选为4臂羟胺聚乙二醇和/或4臂酰肼聚乙二醇。具体实施例中，所述多臂聚乙二醇选自分子量10000的8臂peg
‑
nh2；或分子量为10000的4臂peg
‑
conhnh2；或分子量为10000的4臂peg
‑
onh2；
[0009]
所述多醛基多糖选自醛基葡聚糖。
[0010]
在本发明中，所述免疫佐剂选自粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子、雷西莫特(r848)、寡核苷酸(cpg
·
odn)、聚肌苷酸
‑
聚胞苷酸poly(i:c)、脂多糖、mpla、无机佐剂和人工合成佐剂中的一种或多种。
[0011]
在本发明中，所述肿瘤抗原是以抗原自身或者是以与阳离子材料结合的形式使用；
[0012]
所述免疫佐剂是以佐剂自身或者是以与阳离子材料结合的形式使用。
[0013]
所述阳离子材料选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和树枝状聚酰胺
‑
胺中的一种或多种。
[0014]
在本发明中，所述肿瘤抗原选自切除肿瘤组织中获取的蛋白抗原，或通过人工合成制备的多肽、dna或mrna抗原。优选地，所述肿瘤抗原为肿瘤切除后经过次氯酸钠处理后的肿瘤相关抗原蛋白；或mrna抗原与阳离子聚合物的复合物。
[0015]
在本发明中，所述肿瘤抗原、免疫佐剂、多臂聚乙二醇和多醛基多糖的质量比为(0.01～20):(0.01～1):(1～300):(1～300)。
[0016]
在本发明中，所述肿瘤疫苗具体为负载ova抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗、负载ct26肿瘤相关抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗、负载mc38肿瘤相关抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗、负载ova
‑
mrna的可注射水凝胶肿瘤疫苗、或负载ova多肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗、或负载pamam
‑
ova肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗。
[0017]
本发明提供了一种上述技术方案所述基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
将肿瘤抗原、免疫佐剂、多臂聚乙二醇和多醛基多糖在水中混合，得到肿瘤疫苗。
[0019]
在本发明中，肿瘤抗原在混合液中的浓度为(0.01～20)mg/ml，优选为(2～10)mg/ml；所述免疫佐剂在混合液中的浓度为(0.01～1)mg/ml，优选为(0.05～1)mg/ml；所述多臂聚乙二醇在混合液中的浓度为(1～300)mg/ml，优选为(50～200)mg/ml所述多醛基多糖在混合液中的浓度为(1～300)mg/ml，优选为(20～100)mg/ml。
[0020]
与现有的载药技术相比，本发明提供的肿瘤疫苗通过温和条件下醛基与氨基相互作用形成交联网格，将肿瘤相关抗原、免疫佐剂封装在凝胶内部，高效地保留了抗原的生物活性，并且抗原与醛基材料之间的相互作用使得抗原能够实现长期而持续的释放。有效地解决了抗原体内利用率低、作用时间不足的问题，有效地解决了目前肿瘤疫苗体内应用面临的困境。而且，本发明提供的制备方法简单，原料来源广泛且生物相容性良好，可以实现批量生产，可以实现产业化。
[0021]
本发明提供了一种上述技术方案所述肿瘤疫苗或上述技术方案所述的制备方法制备的肿瘤疫苗在制备肿瘤药物中的应用。
[0022]
在本发明中，所述肿瘤疫苗的剂型为注射剂。
[0023]
在本发明中，所述肿瘤疫苗通过注射的方式剂量将其固定在腋窝或腹股沟淋巴结附近，小鼠(体重16
‑
20g)上每支剂量为300μl。
[0024]
本发明提供了一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗，制备原料包括肿瘤抗原、免疫佐剂、多臂聚乙二醇和多醛基多糖。该肿瘤疫苗能够在温和水溶液中构建，能够高效负载肿瘤相关抗原、佐剂等，并且能够保护它们的活性，维持其稳定性，实现抗原与佐剂的长效局部缓释，显著提高免疫刺激效果。
附图说明
[0025]
图1为本发明中佐剂cpg/pei的粒径；
[0026]
图2为本发明肿瘤疫苗的外观形貌照片与肿瘤疫苗的扫描电镜图；
[0027]
图3为本发明提供的肿瘤疫苗的体外释放曲线；
[0028]
图4为本发明提供的肿瘤疫苗的体外降解；
[0029]
图5为本发明提供的肿瘤疫苗用于黑色素瘤模型的治疗效果(空白对照组untreated，空白水凝胶组dch，佐剂 ova抗原蛋白组cpg/ova，商业化疫苗铝剂 ova组alum/ova，肿瘤疫苗组dchvax
‑
ova)；
[0030]
图6为本发明制备的肿瘤疫苗用于ct26结肠癌术后复发模型的治疗效果(空白对照组untreated，佐剂 ct26抗原蛋白组cpg/ct26，肿瘤疫苗组dchvax
‑
ct26)；
[0031]
图7为本发明制备的肿瘤疫苗用于mc38结肠癌术后复发模型的治疗效果(空白对照组untreated，水凝胶组dch，佐剂 mc38抗原蛋白组cpg/mc38，肿瘤疫苗组dchvax
‑
mc38)；并与apdl
‑
1联合治疗后的生存曲线，(空白对照组untreated，水凝胶组dch，apdl
‑
1组，佐剂 mc38抗原蛋白组cpg/mc38，肿瘤疫苗组dchvax
‑
mc38，肿瘤疫苗联合apdl
‑
1组dchvax
‑
mc38 apdl
‑
1)。
具体实施方式
[0032]
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0033]
实施例1
[0034]
多醛基葡聚糖的制备
[0035]
将20g(0.50mmol)的葡聚糖(dex，分子量为40000da)溶于300ml水中，搅拌溶解后
加入8.6g(0.15mmol溶液)的高碘酸钠，密封，在温度为25℃的条件下，搅拌反应24h。反应结束后，用去离子水透析3天，经冻干，得到多醛基葡聚糖。
[0036]
实施例2
[0037]
4臂羟胺聚乙二醇的制备
[0038]
称取羟基化的聚乙二醇溶解到甲苯中，加热共沸，蒸出大部分甲苯。加入已用分子筛干燥的四氢呋喃，n
‑
羟基邻苯二甲酰亚胺(4.8mmol),三苯基膦(4.8mmol)，溶解均匀。再在冰浴条件下，用滴液漏斗在n2保护下30min内缓慢滴加偶氮二甲酸二异丙酯。撤掉冰浴，室温下反应24h后旋蒸除去大量四氢呋喃，缓慢加入石油醚使固体析出。反复沉降得到最终产物。最后的产物经真空干燥，得到淡黄色固体。在brukerav
‑
500型核磁共振仪上记录了1h核磁共振谱和
13
c核磁共振谱谱。
[0039]
实施例3
[0040]
4臂酰肼聚乙二醇的制备
[0041]
将10克羟基化的聚乙二醇充分地溶解在90ml的无水甲苯溶液中，加入17ml溶解了1.8克叔丁醇钾的叔丁醇溶液，待充分混合后，鼓泡法通氮气20分钟。然后，将3.2ml的溴代乙酸乙酯逐滴滴加到溶液中，约30分钟滴完。反应液在室温下搅拌4小时后，过滤，除去副产物；将所得滤液浓缩，用大量的无水乙醚沉淀。所得的产物再经至少两次的ch2cl2溶解及大量无水乙醚沉淀后，便可除去体系中含溴的杂质，从而得到较纯的白色产物。将所得的peg衍生物溶于甲醇中，然后将水合肼的甲醇溶液缓慢加入。室温下搅拌24小时后，过滤、旋蒸除去大部分甲醇；将浓缩后的液体用ch2cl2萃取。萃取出的有机层经无水硫酸镁干燥、浓缩和无水乙醚沉淀后，即可得到末端为酰肼基的peg
‑
conhnh2。在bruker av
‑
500型核磁共振仪上记录了1h核磁共振谱和
13
c核磁共振谱谱。
[0042]
实施例4
[0043]
聚酰胺
‑
胺(pamam)缀合抗原多肽纳米粒子的制备
[0044]
以ova肽(257
‑
264)为模型抗原，通过酰胺缩合反应将ova肽缀合到pamam上。具体地，将2mg的ova肽溶解在pbs溶液中，然后加入适量的1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)，充分混匀搅拌4h后加入20mg的pamam。混匀后继续搅拌反应24h，透析除去杂质得到pamam缀合ova抗原肽的纳米粒子(pamam
‑
ova)。
[0045]
实施例5
[0046]
个性化抗原蛋白的提取制备
[0047]
从荷瘤小鼠上切除取肿瘤，用dpbs稀释储备的naclo试剂，制备60μm的hclo溶液，立即添加到肿瘤细胞中，最终密度为1
×
106个细胞/ml。将肿瘤细胞悬液置于37℃，5％co2的环境中，每30分钟轻轻搅拌孵育1小时，诱导氧化依赖型肿瘤细胞死亡。处理1小时后。收获肿瘤细胞，用dpbs洗涤2次(每体积hclo溶液加3体积dpbs，以确保hclo完全去除)，离心(8000rpm，10分钟)弃上清2次。用超声破碎机破碎10分钟后，冻融6个循环。将整个肿瘤细胞裂解液在
‑
80℃冷冻1小时或在干冰中冷冻20分钟，在室温下完全冻融6次，完成肿瘤细胞破碎，然后离心(8000rpm，10分钟)收集上清液用于bca分析，定量残留在上清液中的蛋白质，确定吸收的蛋白质量。
[0048]
实施例6
[0049]
负载ova抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备
[0050]
cpg/pei的制备过程：将cpg和pei以10μg/ml的浓度分别溶解在hepes的缓冲溶液中，然后将含cpg的溶液逐滴滴加到pei的溶液中，持续涡旋一分钟后得到cpg/pei复合物。
[0051]
图1为本发明中佐剂cpg/pei的粒径分布示意图。
[0052]
将分子量为10000的8臂peg
‑
nh2和实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)分别溶解于pbs中(ph7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。然后将100μg cpg/pei加入到8臂peg
‑
nh2溶液中，然后与100μl含ova抗原蛋白(50μg)的odex溶液混合(peg
‑
nh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到ova肿瘤疫苗。
[0053]
实施例7
[0054]
负载ct26肿瘤相关抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备
[0055]
将分子量为10000的8臂peg
‑
nh2和实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)分别溶解于pbs中(ph7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。然后将100μg cpg/pei加入到8臂peg
‑
nh2溶液中，然后与含不同浓度个性化抗原蛋白的150μlodex溶液混合(peg
‑
nh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到肿瘤疫苗。图2为肿瘤疫苗的外观形貌照片与扫描电镜图，由扫描电镜图可以观察到其微观的内部交联结构。
[0056]
实施例8
[0057]
负载mc38肿瘤相关抗原蛋白的可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备
[0058]
将分子量为10000的8臂peg
‑
nh2和实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)分别溶解于pbs中(ph7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。然后将100μg cpg/pei加入到8臂peg
‑
nh2溶液中，然后与含不同浓度个性化抗原蛋白的150μlodex溶液混合(peg
‑
nh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到肿瘤疫苗。
[0059]
实施例9
[0060]
负载ova
‑
mrna的可注射水凝胶肿瘤疫苗的制备
[0061]
将实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)和实施例3得到的分子量为10000的4臂peg
‑
conhnh2分别溶解于pbs中(ph 7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。将100μg cpg/10μg ova
‑
mrna/pei加入到4臂peg
‑
conhnh2溶液中，然后与150μl odex溶液混合(peg
‑
conhnh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到负载mrna抗原的peg
‑
conhnh2肿瘤疫苗。
[0062]
实施例10
[0063]
负载ova多肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗的制备
[0064]
将实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)和实施例2得到的分子量为10000的4臂peg
‑
onh2分别溶解于pbs中(ph7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。然后将150μg r848加入到4臂peg
‑
onh2溶液中，然后与150μl含ova多肽(50μg)的odex溶液混合(peg
‑
onh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到负载ova多肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗。
[0065]
实施例11
[0066]
负载pamam
‑
ova肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗的制备
[0067]
将实施例1中得到的多醛基葡聚糖(odex)和实施例2得到的分子量为10000的4臂peg
‑
onh2分别溶解于pbs中(ph7.4)，两者的浓度均为100mg/ml。然后将150μg r848入到4臂peg
‑
onh2溶液中，然后与150μl含实施例4制备的pamam缀合ova肽(以ova抗原肽计量50μg)
的odex溶液混合(peg
‑
onh2与odex的质量比为1:1)，涡旋35s后，将300μl混合物吸入1ml注射器中，得到负载pamam
‑
ova肽的peg
‑
onh2肿瘤疫苗。
[0068]
实施例12
[0069]
肿瘤疫苗的体外释放
[0070]
将实施例6制备的含cy5
‑
ova抗原蛋白的肿瘤疫苗上加入ph 7.4的磷酸盐缓冲液1.0ml，然后将样品置于37℃震荡箱中孵育，在预先设定的时间，2天，4天，6天，8天，10天，12天，14天，16天，18天，20天，取走覆盖在肿瘤疫苗上的释放液1ml用于检测，再补加1ml新的缓冲液，通过荧光分光光度计来定量药物浓度，得到肿瘤疫苗的释放曲线，如图3所示，可以观察到cy5
‑
ova的释放始终维持在一个恒定的药物释放速率，在20天的时间内cy5
‑
ova的释放量可以达到80％。
[0071]
实施例13
[0072]
肿瘤疫苗的体外降解
[0073]
将实施例6制备的含ova抗原蛋白的肿瘤疫苗上加入ph7.4的磷酸盐缓冲液500μl，然后将样品置于37℃震荡箱中孵育，在预先设定的时间，2天，4天，6天，8天，10天，12天，14天，16天，18天，20天，吸走覆盖在肿瘤疫苗上的释放液后测量其重量，再补加500μl新的缓冲液，得到肿瘤疫苗的降解曲线，如图4所示，可以观察到肿瘤疫苗能够在生理环境下持续稳定地降解，在接近20天的时间内疫苗完全降解。
[0074]
实施例14
[0075]
负载ova抗原的肿瘤疫苗用于黑色素瘤模型的治疗
[0076]
利用实施例5制备的肿瘤疫苗开展b16
‑
ova黑色素瘤的治疗。c57bl/6小鼠(体重16
‑
18g左右)40只，随机分为五组，为空白对照组untreated，水凝胶组dch，佐剂 ova抗原蛋白组cpg/ova，铝剂 ova组alum/ova，肿瘤疫苗组dchvax
‑
ova(cpg的植入剂量均为50μg/只)。经腹部皮下注射2
×
106个b16
‑
ova细胞5天后，通过皮下注射的方式将肿瘤疫苗注射到腋窝下，继续观察肿瘤体积，治疗效果如图5所示。结果显示，空白载体以及free cpg/ova的治疗效果很差，商业化的疫苗alum/ova治疗效果一般，而负载ova抗原的肿瘤疫苗则显示出高效的治疗效果。
[0077]
实施例15
[0078]
负载ct26个性化抗原蛋白的肿瘤疫苗用于ct26结肠癌的术后复发模型的治疗
[0079]
利用实施例7制备的肿瘤疫苗开展ct26结肠癌的术后治疗。balb/c小鼠(体重16
‑
18g左右)21只，随机分为三组，分别为空白对照组untreated，佐剂 ct26抗原蛋白组cpg/ct26，肿瘤疫苗组dchvax
‑
ct26，(cpg的植入剂量均为50μg/只)。经腹部皮下注射1.5
×
106个ct26肿瘤细胞，待肿瘤体积长到200～300mm3后，通过手术将肿瘤切除90％，提取切除的ct26肿瘤中的抗原蛋白，通过皮下注射的方式将肿瘤疫苗注射到腋窝下，继续观察肿瘤体积，治疗效果如图6所示。可以观察到untreated组以及cpg组肿瘤生长迅速，在切除后第16天肿瘤体积分别为800mm3与650mm3，而负载ct26个性化抗原蛋白的肿瘤疫苗则显示出高效的效果，治疗第16天后肿瘤体积只有80mm3。
[0080]
实施例16
[0081]
负载mc38个性化抗原蛋白的肿瘤疫苗用于mc38结肠癌的术后复发模型的治疗
[0082]
利用实施例8制备的肿瘤疫苗开展mc38结肠癌的术后治疗。c57bl/6小鼠(体重16
‑
18g左右)28只，随机分为四组，为空白对照组untreated，水凝胶组dch，佐剂 mc38抗原蛋白组cpg/mc38，肿瘤疫苗组dchvax
‑
mc38，(cpg的植入剂量均为50μg/只)。经腹部皮下注射5
×
106个mc38肿瘤细胞，待肿瘤体积长到200～300mm3后，通过手术将肿瘤切除90％，提取切除的mc38肿瘤中的抗原蛋白，通过皮下注射的方式将肿瘤疫苗注射到腋窝下，继续观察肿瘤体积，治疗效果如图7所示。结果显示，空白载体以及free cpg/的治疗效果很差，治疗结束时小鼠肿瘤体积超过2000mm3而负载mc38个性化抗原蛋白的肿瘤疫苗则显示出高效的治疗效果，治疗结束时肿瘤体积只有140mm3。
[0083]
由以上实施例可知，基于可注射水凝胶的肿瘤疫苗，制备原料包括肿瘤抗原、免疫佐剂、多臂聚乙二醇和多醛基多糖。该肿瘤疫苗能够在温和水溶液中构建，能够高效负载肿瘤相关抗原、佐剂等，并且能够保护它们的活性，维持其稳定性，实现抗原与佐剂的长效局部缓释，显著提高免疫刺激效果。
[0084]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。