四个关键基因组合评估乳腺癌风险的诊断试剂盒的制作方法

1.本发明涉及医学技术领域，具体为四个关键基因组合评估乳腺癌风险的诊断试剂盒。


背景技术：

2.乳腺癌在全世界范围内都是女性最常见的恶心肿瘤之一，而且发病率常年位于女性肿瘤首位，是女性癌症相关死亡的第二大因素，仅次于肺癌。其发病率已占全身各种恶性肿瘤的7％以上，乳腺癌移能力强，一般患者的预后差。随着环境和人口老龄化的加剧，乳腺癌的发病率有明显上升的趋势。早期发现并及时治疗是乳腺癌的防治关键。
3.然而目前常见的对乳腺癌进行发病风险评估多用snp位点或单个易感基因等方法进行分析，这种方式进行风险评估，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用，因此寻找出一些与乳腺癌相关联基因的组合检测，能大大提高对乳腺癌风险评估的时效性跟准确性，因此建立简单、可靠、快速的关联基因检测的高效检测方法能及时筛查出乳腺癌易感高危人群，从而根据结果尽快采取预防措施，这对提高乳腺癌的早期诊断和治疗有着重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供四个关键基因组合评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，解决了目前常见的对乳腺癌进行发病风险评估多用snp位点或单个易感基因等方法进行分析，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：四个关键基因组合评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，包括一个标准品，四个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为：dab2(id:1601),kdelc1(id:79070), g6pd(id:2539)，ppp1cb(id:5500)和β
‑
actin(geneid:60)，引物能特异的扩增出对应的基因。
6.优选的，所述dab2基因部分序列：
7.agtcctcagctgccagcatctgattagaaccatatctctcgccgggagtggccgcgcggctc cgaagctcccggccggcggctatttaagcgaggcccgccgcatccgctgcgctgtagcctggaggc tccgggcgcggggaagtcatgctcgcttcacggaggcaatagctagccggtgtctgtgggaggtta tgtttatttgagacttctccatcgggatcgcctggtgtcaccaagtgtccactggtactgaggttt gctgcctgccttcttgccatgtctaacgaagtagaaacaagtgcaaccaatggtcagcccgaccaa caggccgcaccaaaagcaccctcaaagaaggaaaaaaagaaaggccctgaaaagacagatgaatat ctcttagcaaggttcaaaggcgatggtgtaaaatataaggccaagctgattggcattgatgatgtg ccagatgcaagaggggataaaatgagccaagactctatgatg(seq id no：1)。
8.优选的，所述kdelc1基因部分序列：
9.aaatgatgctccagtggcaggagcaactcaagttcatcattgtcctgagagagaggagcagc gcggttctcggccgggacagcagaacgccaggggaccctcacctgggcgcgccggggcacgggctt tgattgtcctggggtcgcggagacccgcgcgcctgccctgcacgccgggcggcaacctttgcagtc gcgttggctgctgcgatcggccg
gcgggtccctgccgaaggctcggctgcttctgtccacctctta cacttcttcatttatcggtggatcatttcgagagtccgtcttgtaaatgtttggcactttgctact ttattgcttctttctggcgacagttccagcactcgccgagaccggcggagaaaggcagctgagccc ggagaagagcgaaatatggggacccgggctaaaagcagacgtcgtccttcccgcccgctatttcta tattcaggcagtggatacatcagggaataaattcacatcttc(seq id no：2)。
10.优选的，所述g6pd基因部分序列：
11.agaggcaggggctggcctgggatgcgcgcgcacctgccctcgccccgccccgcccgcacgag gggtggtggccgaggccccgccccgcacgcctcgcctgaggcgggtccgctcagcccaggcgcccg cccccgcccccgccgattaaatgggccggcggggctcagcccccggaaacggtcgtacacttcggg gctgcgagcgcggagggcgacgacgacgaagcgcagacagcgtcatggcagagcaggtggccctga gccggacccaggtgtgcgggatcctgcgggaagagcttttccagggcgatgccttccatcagtcgg atacacacatattcatcatcatgggtgcatcgggtgacctggccaagaagaagatctaccccacca tctggtggctgttccgggatggccttctgcccgaaaacaccttcatcgtgggctatgcccgttccc gcctcacagtggctgacatccgcaaacagagtgagcccttct(seq id no：3)。
12.优选的，所述ppp1cb基因部分序列：
13.gcggagctgggcggtgccgaggaggaggaggtggcggcctgggtctgacgcggccctgttcg agggggcctctcttgtttatttatttattttccgtgggtgcctccgagtgtgcgcgcgctctcgct acccggcggggagggggtggggggagggcccgggaaaagggggagttggagccggggtcgaaacgc cgcgtgacttgtaggtgagagaacgccgagccgtcgccgcagcctccgccgccgagaagcccttgt tcccgctgctgggaaggagagtctgtgccgacaagatggcggacggggagctgaacgtggacagcc tcatcacccggctgctggaggtacgaggatgtcgtccaggaaagattgtgcagatgactgaagcag aagttcgaggcttatgtatcaagtctcgggagatctttctcagccagcctattcttttggaattgg aagcaccgctgaaaatttgtggagatattcatggacaatata(seq id no：4)。
14.优选的，所述β
‑
actin基因部分序列：
15.gttgctatccaggctgtgctatccctgtacgcctctggccgtaccactggcatcgtgatgga ctccggtgacggggtcacccacactgtgcccatctacgaggggtatgccctcccccatgccatcct gcgtctggacctggctggccgggacctgactgactacctcatgaagatcctcaccgagcgcggcta cagcttcaccaccacggccgagcgggaaatcgtgcgtgacattaaggagaagctgtgctacgtcgc cctggacttcgagcaagagatggccacggctgcttccagctcctccctggagaagagctacgagct gcctgacggccaggtcatcaccattggcaatgagcggttccgctgccctgaggcactcttccagcc ttccttcctgggcatggagtcctgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtga cgtggacatccgcaaagacctgtacgccaacacagtgctgtc(seq id no：5)。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
17.目前常见的对乳腺癌进行发病风险评估多用snp位点或单个易感基因等方法进行分析，存在实用性差且缺乏有效的敏感性和特异性，很少能用于实际的检测和应用，本发明所用检测的基因组合包括乳腺癌相关特异表达基因四个，同时使用标准品及内参基因对检测结果进行有效的校正，通过组合检测分析，能够有效的预测乳腺癌的发病风险，当所检测的四个基因的中，当满足dab2基因的ct值小于标准品的ct值，同时kdelc1,g6pd，和ppp1cb 基因的ct值均大于标准品的ct值时预警乳腺癌患病为高风险，使用该试剂盒进行风险评估，不仅实用性强且也能有效的提高敏感性和特异性，从而更加适合进行实际的检测和应用。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.四个关键基因组合评估乳腺癌风险的诊断试剂盒，包括一个标准品，四个特异基因及内参基因的引物，针对的检测基因及内参基因分别为： dab2(id:1601),kdelc1(id:79070),g6pd(id:2539)，ppp1cb(id:5500)和β
ꢀ‑
actin(geneid:60)，引物能特异的扩增出对应的基因。
20.试剂盒是一种用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。一般医院、制药企业使用。
21.常见elisa试剂盒有：
22.特种蛋白检测elisa试剂盒：
23.如免疫球蛋白,抗链o
‑
aso,类风湿因子rf,c反应蛋白,微量白蛋白,β
‑
2 微球蛋白human,铁蛋白,转铁蛋白transferrin等等。
24.肿瘤标志物检测elisa试剂盒：
25.如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌，细胞角蛋白片段，胃肠癌，铁蛋白，糖链抗原，神经特异性稀醇化酶，上皮膜抗原，乳腺癌，人抗小鼠抗体，前列腺，甲胎蛋白，肝癌，甲基苯丙胺，大肠癌，肺癌，大小便隐血检测，癌胚抗原，β
‑
2微球蛋白等等。
26.食品安全检验elisa试剂盒：
27.食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。如植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒，动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒。
28.传染病检测elisa试剂盒：
29.如幽门螺杆菌,乙脑,乙肝,丙肝,丁肝,戊肝,庚肝,衣原体,性病,腺病毒, 微小病毒b19,天疱疮,水痘
‑
带状疱疹病毒,生殖支原体,伤寒,沙眼,腮腺炎, 人型支原体,麻疹,轮状病毒,流行性出血热,淋球菌,莱姆病,柯萨奇,抗解尿支原体,军团菌,结核,胶原,尖锐湿疣,甲肝,脊髓灰质炎,急性胰腺炎尿胰蛋白酶,霍乱,呼吸道合胞病毒,肝吸虫,副流感,肺炎,带状疱疹,传染性单核细胞增多症,层粘蛋白,布鲁氏杆菌,百日咳,白喉,艾柯病毒,eb病毒,a族链球菌等等。
30.dab2是一种具有信号转导能力的磷蛋白,在丝裂原信号转导途径(mapk通路)中发挥重要作用，它能通过与dab2结合蛋白(dab2ip)的相互作用和蛋白质的磷酸化发挥其功能，参与对细胞生长的调控。
31.disable
‑
2(dab2/doc
‑
2)是一种丝裂原响应接头蛋白参与多种细胞功能的进程。它参与许多信号通路，在调节免疫功能、蛋白
‑
蛋白相互作用、细胞稳态和分化、肿瘤发生和器官系统炎症过程中发挥重要作用。它包含与含npxy 基元和含sh3结构域的适配器蛋白、磷脂酰肌醇、整合素、网格蛋白和肌球蛋白vi结合的结构域。
32.kdelc1作为内质网蛋白家族的一员，编码的蛋白包含一个lysl
‑
asp
‑ꢀ
glu
‑
leu或
kdel基序，位于c端，阻止所有内质网驻留蛋白的分泌。
33.葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶(g6pd)是一种广泛表达的酶，在所有细胞中具有管家作用，特别是对红细胞的完整性和功能至关重要。
34.ppp1cb基因参与了糖原代谢和肌肉收缩的过程，而且它是肌凝蛋白轻链磷酸酶，负责钙离子的瞬时升高，并调节细胞的有丝分裂等进程。
35.试剂盒的每一人份包括：
36.逆转录翻译体系：5x逆转录缓冲液4ul，10nm的dntp 1ul，oligo引物1ul，随机引物1ul，逆转录酶1ul，rna酶抑制剂0.5ul，无酶水12ul；
37.pcr反应体系：sybr green 2xpcr混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul， ddh2o 7ul；
38.标准品：4ul。标准品按以下比例混合而成：dab2：kdelc1：g6pd：ppp1cb：β
‑
actin＝1：2.5：2.5：2：2。
39.本实施例中，dab2基因部分序列：
40.agtcctcagctgccagcatctgattagaaccatatctctcgccgggagtggccgcgcggctc cgaagctcccggccggcggctatttaagcgaggcccgccgcatccgctgcgctgtagcctggaggc tccgggcgcggggaagtcatgctcgcttcacggaggcaatagctagccggtgtctgtgggaggtta tgtttatttgagacttctccatcgggatcgcctggtgtcaccaagtgtccactggtactgaggttt gctgcctgccttcttgccatgtctaacgaagtagaaacaagtgcaaccaatggtcagcccgaccaa caggccgcaccaaaagcaccctcaaagaaggaaaaaaagaaaggccctgaaaagacagatgaatat ctcttagcaaggttcaaaggcgatggtgtaaaatataaggccaagctgattggcattgatgatgtg ccagatgcaagaggggataaaatgagccaagactctatgatg(seq id no：1)。
41.本实施例中，kdelc1基因部分序列：
42.aaatgatgctccagtggcaggagcaactcaagttcatcattgtcctgagagagaggagcagcgcgg ttctcggccgggacagcagaacgccaggggaccctcacctgggcgcgccggggcacgggctttgat tgtcctggggtcgcggagacccgcgcgcctgccctgcacgccgggcggcaacctttgcagtcgcgt tggctgctgcgatcggccggcgggtccctgccgaaggctcggctgcttctgtccacctcttacact tcttcatttatcggtggatcatttcgagagtccgtcttgtaaatgtttggcactttgctactttat tgcttctttctggcgacagttccagcactcgccgagaccggcggagaaaggcagctgagcccggag aagagcgaaatatggggacccgggctaaaagcagacgtcgtccttcccgcccgctatttctatatt caggcagtggatacatcagggaataaattcacatcttc(seq id no：2)。
43.本实施例中，g6pd基因部分序列：
44.agaggcaggggctggcctgggatgcgcgcgcacctgccctcgccccgccccgcccgcacgag gggtggtggccgaggccccgccccgcacgcctcgcctgaggcgggtccgctcagcccaggcgcccg cccccgcccccgccgattaaatgggccggcggggctcagcccccggaaacggtcgtacacttcggg gctgcgagcgcggagggcgacgacgacgaagcgcagacagcgtcatggcagagcaggtggccctga gccggacccaggtgtgcgggatcctgcgggaagagcttttccagggcgatgccttccatcagtcgg atacacacatattcatcatcatgggtgcatcgggtgacctggccaagaagaagatctaccccacca tctggtggctgttccgggatggccttctgcccgaaaacaccttcatcgtgggctatgcccgttccc gcctcacagtggctgacatccgcaaacagagtgagcccttct(seq id no：3)。
45.本实施例中，ppp1cb基因部分序列：
46.gcggagctgggcggtgccgaggaggaggaggtggcggcctgggtctgacgcggccctgttcg agggggcctctcttgtttatttatttattttccgtgggtgcctccgagtgtgcgcgcgctctcgct acccggcggggagg
gggtggggggagggcccgggaaaagggggagttggagccggggtcgaaacgc cgcgtgacttgtaggtgagagaacgccgagccgtcgccgcagcctccgccgccgagaagcccttgt tcccgctgctgggaaggagagtctgtgccgacaagatggcggacggggagctgaacgtggacagcc tcatcacccggctgctggaggtacgaggatgtcgtccaggaaagattgtgcagatgactgaagcag aagttcgaggcttatgtatcaagtctcgggagatctttctcagccagcctattcttttggaattgg aagcaccgctgaaaatttgtggagatattcatggacaatata(seq id no：4)。
47.本实施例中，β
‑
actin基因部分序列：
48.gttgctatccaggctgtgctatccctgtacgcctctggccgtaccactggcatcgtgatgga ctccggtgacggggtcacccacactgtgcccatctacgaggggtatgccctcccccatgccatcct gcgtctggacctggctggccgggacctgactgactacctcatgaagatcctcaccgagcgcggcta cagcttcaccaccacggccgagcgggaaatcgtgcgtgacattaaggagaagctgtgctacgtcgc cctggacttcgagcaagagatggccacggctgcttccagctcctccctggagaagagctacgagct gcctgacggccaggtcatcaccattggcaatgagcggttccgctgccctgaggcactcttccagcc ttccttcctgggcatggagtcctgtggcatccacgaaactaccttcaactccatcatgaagtgtga cgtggacatccgcaaagacctgtacgccaacacagtgctgtc(seq id no：5)。
49.工作原理：组合基因检测法评估乳腺癌风险的诊断试剂盒在血液样品中使用时，先抽取患者静脉血液1ml，使用氯仿法抽提总rna，然后对rna进行定量分析，使用100ug总rna作为起始量进行下一步操作，其次在使用试剂盒提供的逆转录试剂进行逆转录反应，体系为20ul，反应条件如下：42℃/60 分钟，75℃/5分钟，然后再使用试剂盒提供的pcr试剂进行pcr反应，取上述逆转录反应产物1ul作为模板，分别单独扩增dab2,kdelc1,g6pd，ppp1cb 和β
‑
actin，所使用的引物分别如下：(1)dab2正向引物：5`
‑ꢀ
ttcacagacagatctggagc
‑
3`(seq id no：6)，反向引物：5`
‑ꢀ
tcctcttccacaggaaggat
‑
3`(seq id no：7)；(2)kdelc1正向引物：5`
‑ꢀ
gagactcgagctggttaaac
‑
3`(seq id no：8)，反向引物：5`
‑ꢀ
taagctgctacagtgccatc
‑
3`(seq id no：9)；(3)g6pd正向引物：5`
‑ꢀ
gaagagagtgggtttccagt
‑
3`(seq id no：10)，反向引物：5`
‑ꢀ
atgtgcagctgaggtcaatg
‑
3`(seq id no：11)；(4)ppp1cb正向引物：5`
‑ꢀ
agctacccagtatccatgct
‑
3`(seq id no：12)，反向引物：5`
‑ꢀ
cgtgaacacactcatacttc
‑
3`(seq id no：13)；(5)β
‑
actin正向引物： 5`
‑
tcgtgcgtgacattaaggag
‑
3`(seq id no：14)，反向引物：5`
‑ꢀ
aaccgctcattgccaatggt
‑
3`(seq id no：15)，同时进行标准品的pcr反应，取试剂盒内提供的标准品1ul作为模板，分别单独扩增dab2,kdelc1,g6pd， ppp1cb和β
‑
actin，所使用的引物分别如下：(1)dab2正向引物：5`
‑ꢀ
ttcacagacagatctggagc
‑
3`(seq id no：16)，反向引物：5`
‑ꢀ
tcctcttccacaggaaggat
‑
3`(seq id no：17)；(2)kdelc1正向引物：5`
‑ꢀ
gagactcgagctggttaaac
‑
3`(seq id no：18)，反向引物：5`
‑ꢀ
taagctgctacagtgccatc
‑
3`(seq id no：19)；(3)g6pd正向引物：5`
‑ꢀ
gaagagagtgggtttccagt
‑
3`(seq id no：20)，反向引物：5`
‑ꢀ
atgtgcagctgaggtcaatg
‑
3`(seq id no：21)；(4)ppp1cb正向引物：5`
‑ꢀ
agctacccagtatccatgct
‑
3`(seq id no：22)，反向引物：5`
‑ꢀ
cgtgaacacactcatacttc
‑
3`(seq id no：23)；(5)β
‑
actin正向引物： 5`
‑
tcgtgcgtgacattaaggag
‑
3`(seq id no：24)，反向引物：5`
‑ꢀ
aaccgctcattgccaatggt
‑
3`(seq id no：25)，pcr扩增的反应体系为：sybr green 2xpcr混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddh2o 7ul，逆转录产物1ul或标准品1ul，而pcr反应条件为：94℃/5分钟变性酶激活，94℃/30 秒变性，60℃/30秒退火，72℃/30秒延伸，共40个循环，使用仪器为实时定量pcr仪器，最后进行结果分析，pcr下机数据采用
直接读取ct值的方法，首先通过内参基因进行校正，校正后的数据跟标准品比较，当满足dab2基因的ct值小于标准品的ct值，同时kdelc1,g6pd，和ppp1cb基因的ct值均大于标准品的ct值时预警乳腺癌患病为高风险；
50.当组合基因检测法评估乳腺癌风险的诊断试剂盒在活检组织中使用时，先进行活检取出的组织样品使用氯仿法抽提总rna，对rna进行定量分析，使用100ug总rna作为起始量进行下一步操作，然后使用试剂盒提供的逆转录试剂进行逆转录反应，体系为20ul，反应条件如下：42℃/60分钟，75℃/5 分钟，然后再使用试剂盒提供的pcr试剂进行pcr反应，取上述逆转录反应产物1ul作为模板，分别单独扩增dab2,kdelc1,g6pd，ppp1cb和β
‑
actin，所使用的引物分别如下：(1)dab2正向引物：5`
‑
ttcacagacagatctggagc
‑
3` (seq id no：26)，反向引物：5`
‑
tcctcttccacaggaaggat
‑
3`(seq id no：27)；(2)kdelc1正向引物：5`
‑
gagactcgagctggttaaac
‑
3`(seq id no： 28)，反向引物：5`
‑
taagctgctacagtgccatc
‑
3`(seq id no：29)；(3) g6pd正向引物：5`
‑
gaagagagtgggtttccagt
‑
3`(seq id no：30)，反向引物：5`
‑
atgtgcagctgaggtcaatg
‑
3`(seq id no：31)；(4)ppp1cb正向引物：5`
‑
agctacccagtatccatgct
‑
3`(seq id no：32)，反向引物： 5`
‑
cgtgaacacactcatacttc
‑
3`(seq id no：33)；(5)β
‑
actin正向引物：5`
‑
tcgtgcgtgacattaaggag
‑
3`(seq id no：34)，反向引物：5`
‑ꢀ
aaccgctcattgccaatggt
‑
3`(seq id no：35)，同时进行标准品的pcr反应，取试剂盒内提供的标准品1ul作为模板，分别单独扩增dab2,kdelc1,g6pd， ppp1cb和β
‑
actin，所使用的引物分别如下：(1)dab2正向引物：5`
‑ꢀ
ttcacagacagatctggagc
‑
3`(seq id no：36)，反向引物：5`
‑ꢀ
tcctcttccacaggaaggat
‑
3`(seq id no：37)；(2)kdelc1正向引物：5`
‑ꢀ
gagactcgagctggttaaac
‑
3`(seq id no：38)，反向引物：5`
‑ꢀ
taagctgctacagtgccatc
‑
3`(seq id no：39)；(3)g6pd正向引物：5`
‑ꢀ
gaagagagtgggtttccagt
‑
3`(seq id no：40)，反向引物：5`
‑ꢀ
atgtgcagctgaggtcaatg
‑
3`(seq id no：41)；(4)ppp1cb正向引物：5`
‑ꢀ
agctacccagtatccatgct
‑
3`(seq id no：42)，反向引物：5`
‑ꢀ
cgtgaacacactcatacttc
‑
3`(seq id no：6)；(5)β
‑
actin正向引物：5`
‑ꢀ
tcgtgcgtgacattaaggag
‑
3`(seq id no：43)，反向引物：5`
‑ꢀ
aaccgctcattgccaatggt
‑
3`(seq id no：44)，pcr扩增的反应体系为：sybrgreen 2xpcr混合反应缓冲液10ul，每条引物各1ul，ddh2o 7ul，逆转录产物1ul或标准品1ul，而pcr反应条件为：94℃/5分钟变性酶激活，94℃/30 秒变性，60℃/30秒退火，72℃/30秒延伸，共40个循环，使用仪器为实时定量pcr仪器，最后进行结果分析，pcr下机数据采用直接读取ct值的方法，首先通过内参基因进行校正，校正后的数据跟标准品比较，当满足dab2基因的ct值小于标准品的ct值，同时kdelc1,g6pd，和ppp1cb基因的ct值均大于标准品的ct值时预警乳腺癌患病为高风险。
51.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。