CSFV亚单位疫苗的制作方法

csfv亚单位疫苗
技术领域
1.本发明涉及动物健康领域。特别地，本发明涉及重组经典猪瘟病毒e2蛋白，其在由6b8单克隆抗体特异性识别的表位处包含至少一个突变。此外，本发明提供了包含本发明的重组e2蛋白的免疫原性组合物以及该免疫原性组合物在预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病中的用途。此外，本发明提供了用于区分感染csfv的动物与接种本发明免疫原性组合物的动物的方法和试剂盒。


背景技术：

2.经典猪瘟是一种严重的猪和野猪传染性疾病，会造成严重的经济损失。该病的病原体是经典猪瘟病毒(csfv)。在中国，采取预防接种和扑灭相结合的策略来控制csf的暴发。然而，在中国的大部分地区，仍有零星的csf暴发和持续感染的报告。
3.在本领域中仍然需要一种新的csfv疫苗，该疫苗是安全、有效的，并且接种了疫苗的动物可以与被野生型野毒株感染的动物区分开来。


技术实现要素：

4.在一个方面中，本发明提供了重组csfv(经典猪瘟病毒)e2蛋白，其在e2蛋白的6b8表位内包含至少一个突变，其中(未修饰的)6b8表位由6b8单克隆抗体特异性识别。
5.在一个方面中，本发明提供编码本发明的重组csfv e2蛋白的分离核酸。
6.在一个方面中，本发明提供包含本发明的核酸的载体。
7.在一个方面中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含各自根据本发明的重组csfv e2蛋白、编码重组csfv e2蛋白的核酸或编码这种核酸的载体。
8.在一个方面中，本发明提供了预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法，该方法包括将本发明的免疫原性组合物施用于有需要的动物的步骤。
9.在一个方面中，本发明提供了区分感染了csfv的动物与接种了本发明免疫原性组合物的动物的方法，包括:
10.a)从动物获得样品；和
11.b)在免疫检测中分析所述样品。
12.在一个方面中，本发明提供了用于区分感染csfv的动物与接种本发明免疫原性组合物的动物的试剂盒。
附图说明
13.图1:6b8表位的csfv e2结构和关键氨基酸。
14.图2:构建野生型csfv e2和在6b8表位中具有各种取代的突变csfv e2。
15.图3:wt
‑
e2和e2
‑
kard或e2
‑
krd的纯化结果，通过sds page和蛋白质印迹证实。
16.图4:纯化的e2
‑
kard或e2
‑
krd显示6b8染色的阴性结果。
17.图5:mab 6b8识别大多数csfv毒株，而与bvdv病毒没有反应。
18.图6:csfv分离株、bvdv株和其他一些瘟病毒的序列比对。
19.图7:ifa结果显示，位置14、22或24/25处的氨基酸残基对于mab 6b8的结合是关键的。
20.图8:效力研究中的攻击后体温。
21.图9:效力研究中的攻击后白细胞计数。
22.图10:效力研究中的攻击后死亡率。
23.图11:效力研究中的攻击后临床评分。
24.图12:效力研究期间的血清学反应。
具体实施方式
25.在描述本发明的各方面之前，必须注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式包括复数参考，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“表位”的引用包括多个表位，对“病毒”的引用是对一种或多种病毒及其本领域技术人员已知的等价物的引用，等等。术语“和/或”旨在包括由该术语连接的项目的任何组合，等同于单独列出所有组合。例如，“a、b和/或c”包括“a”、“b”、“c”、“a和b”、“a和c”、“b和c”以及“a和b和c”。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管在本发明的实践或检测中可以使用与这里描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。为了描述和公开出版物中报道的可用于本发明的病毒株、细胞系、载体和方法，本文提及的所有出版物在此引入作为参考。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开。
26.在一个方面中，本发明提供了重组csfv(经典猪瘟病毒)e2蛋白，其在e2蛋白的6b8表位内包含至少一个突变，其中(未修饰的)6b8表位由6b8单克隆抗体特异性识别。
27.本文使用的术语“csfv”是指属于黄病毒科中的瘟病毒属中的经典猪瘟病毒(csfv)种的所有病毒。
28.术语“重组”是指已经通过遗传工程改变、重排或修饰的蛋白质或核酸。然而，该术语并不指由自然发生的事件(例如自发突变)导致的多核苷酸、氨基酸序列、核苷酸序列的改变。
29.在一个方面中，重组csfv e2蛋白是分离的。
30.多肽或核酸分子被认为是“分离的
”‑
例如，当与它的天然生物源和/或从其获得它的反应介质或培养基相比时
‑
当它已经从与之实际相关的所述源或介质中的至少一种其它组分(例如另一种蛋白质/多肽，另一种核酸，另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组分)分离时。特别地，当多肽或核酸分子已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，和高达1000倍或更多时，多肽或核酸分子被认为是“分离的”。“分离形式”的多肽或核酸分子优选是基本均匀的，如使用合适的技术，例如合适的色谱技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳所确定的。
31.本文中的“e2蛋白的6b8表位”还指由本文公开的6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的表位。6b8表位可以至少包含氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)或stdeigllgagg(seq id no:2)。
32.术语“6b8单克隆抗体”是指6b8单克隆抗体或其抗原结合片段，其中6b8单克隆抗
体特异性识别6b8表位，特别是包含至少氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)或stdeigllgagg(seq id no:2)的6b8表位。优选地，术语6b8单克隆抗体是指包含由以登录号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体的cdr的单克隆抗体。优选地，术语6b8单克隆抗体是指一种单克隆抗体，其包括含有seq id no:3中所示氨基酸序列的vh cdr1、含有seq id no:4中所示氨基酸序列的vh cdr2、含有seq id no:5中所示氨基酸序列的vh cdr3、含有seq id no:6中所示氨基酸序列的vl cdr1，含有seq id no:7中所示氨基酸序列的vl cdr2，和含有seq id no:8中所示氨基酸序列的vl cdr3。更优选地，术语6b8单克隆抗体是指包含具有seq id no:9所述氨基酸序列的重链可变区(v
h
)和具有seq id no:10所述氨基酸序列的轻链可变区(v
l
)的单克隆抗体。更优选地，术语6b8单克隆抗体是指由以登录号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体。
33.如本文所使用的，“抗体”是指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论是天然的还是部分或全部合成的，例如重组的，产生的，包括其包含免疫球蛋白分子的至少一部分可变区的任何片段，该可变区保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合域的任何蛋白质。抗体包括抗体片段。因此，如本文所用，术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、体内和抗体片段。本文提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如igg、igm、igd、ige、iga和igy)、任何类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类(例如igg2a和igg2b)的成员。
34.本文所用的术语“可变区”是指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，这四个“框架区”在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“fr1”；“框架区2”或“fr2”；“框架区3”或“fr3”；以及“框架区4”或“fr4”；所述框架区被三个“互补决定区”或“cdr”中断，这三个“互补决定区”或“cdr”在本领域和下文中分别被称为“互补决定区1”或“cdr1”；“互补决定区2”或“cdr2”；“互补决定区3”或“cdr3”。因此，免疫球蛋白可变区的一般结构或序列可以指示如下:fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4。vh或vh是指重链可变区，并且vl或vl是指轻链可变区。类似地，vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3分别指重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3分别指轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。
35.如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指全长抗体的任何部分，其小于全长但包含抗体的可变区的至少一部分，所述可变区结合抗原(例如一个或多个cdr和/或一个或多个抗体结合位点)并因此保持结合特异性，和全长抗体的特异性结合能力的至少一部分。因此，抗原结合片段是指包含结合到与衍生抗体片段的抗体相同的抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶处理全长抗体产生的抗体衍生物，以及合成的，例如重组产生的衍生物。抗体片段包括在抗体中。抗体片段的示例包括但不限于fab、fab"、f(ab")2、单链fv(scfv)、fv、dsfv、双功能抗体、fd和fd"片段和其他片段，包括修饰片段(例如，参见分子生物学方法，第207卷:用于癌症治疗方法和协议的重组抗体(2003年)；第1章；3
‑
25页，kipriyanov)。该片段可以包括例如通过二硫键桥和/或通过肽接头连接在一起的多个链。抗原结合片段包括任何抗体片段，所述抗体片段在插入抗体框架中时(例如通过替换相应区域)产生免疫特异性结合于抗原(即，表现出至少或至少约107‑
108m
‑1的ka)的抗体。
36.术语“6b8单克隆抗体的抗原结合片段”是指6b8单克隆抗体的片段或至少编码特
异性识别6b8表位的氨基酸序列，特别是包含至少氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)或stdeigllgagg(seq id no:2)的6b8表位。该术语还包括编码包含seq id no:3所示氨基酸序列的vh cdr1、包含seq id no:4所示氨基酸序列的vh cdr2、包含seq id no:5所示氨基酸序列的vh cdr3和/或包含seq id no:6所示氨基酸序列的vl cdr1，包含seq id no:7中所示氨基酸序列的vl cdr2，和包含seq id no:8中所示氨基酸序列的vl cdr3的氨基酸片段。此外，该术语还包括氨基酸片段，其包括具有如seq id no:9中所示氨基酸序列的重链可变区(v
h
)和/或具有如seq id no:10中所示氨基酸序列的轻链可变区(v
l
)。更优选地，该术语包括由以登录号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体编码的氨基酸片段，该氨基酸片段特异性结合6b8表位。
37.术语“突变”包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。术语突变是本领域技术人员公知的，并且本领域技术人员可以毫不费力地产生突变。
38.在一个方面中，本发明的e2蛋白的6b8表位内的至少一个突变导致6b8单克隆抗体与这种突变的6b8表位的结合的特异性抑制。
39.术语“特异性抑制”是指与未修饰的6b8表位，特别是与具有氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)或stdeigllgagg(seq id no:2)的未修饰的6b8表位相比，6b8抗体与突变的6b8表位结合的亲和力低至少2倍，优选5倍，更优选10倍，并且再优选50倍。“亲和力”是抗体分子上单个抗原结合位点与单个表位之间的相互作用。其由缔合常数ka＝kass/kdiss或解离常数kd＝kdiss/kass表示。更优选地，术语“特异性抑制”是指6b8单克隆抗体，特别是由以登录号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体，在特异性免疫荧光测定法中，优选在如示例5所述的特异性免疫荧光测定法中，或在特异性斑点印迹测定法中，优选在如示例6所述的特异性斑点印迹分析中，不可检测地结合根据本发明的突变6b8表位。特异性免疫荧光测定和特异性斑点印迹测定均可用于确定特异性抑制，然而，如果从这两种测定获得冲突结果，则以斑点印迹测定的结果为准。
40.术语“取代”是指一个氨基酸在相同位置被另一个氨基酸替换。因此，术语取代涵盖去除/缺失一个氨基酸，然后在相同位置插入另一个氨基酸。
41.术语“e2蛋白”是指加工的e2蛋白，其作为来自csfv的多蛋白(npro
‑
c
‑
erns
‑
e1
‑
e2
‑
p7
‑
ns2
‑
ns3
‑
ns4a
‑
ns4b
‑
ns5a
‑
ns5b)的最终切割产物产生。本领域技术人员将认识到csfv的任何e2蛋白都可以用于本发明。在本发明的一个方面，重组e2蛋白衍生自野生型e2蛋白，所述野生型e2蛋白具有由6b8单克隆抗体特异性识别的6b8表位。例如，e2蛋白可衍生自已知的csfv株如c
‑
株，或衍生自新的分离株，如本文所定义的qz07或gd18。例如，野毒株qz07的e2蛋白具有seq id no:11中所示的氨基酸序列，野毒株gd18的e2蛋白具有seq id no:12中所示的氨基酸序列，野毒株gd191的e2蛋白具有seq id no:42中所示的氨基酸序列，并且c
‑
株的e2蛋白具有seq id no:29中所示的氨基酸序列。
42.在本发明的一个方面，所述重组e2蛋白包含与seq id no:11、12、42和29中的任何一个序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，但在6b8表位内含有本文公开的至少一个突变。
43.两个多肽序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。用于评估氨基酸或核苷酸序列之间的序列同一性水平的方法是本领域已知的。例如，经常使用序
列分析软件来确定氨基酸序列的同一性。例如，可以通过使用ncbi数据库中的blast程序来确定同一性。对于序列同一性的测定，参见例如计算分子生物学，lesk，a.m.，ed.，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算:信息学与基因组计划，史密斯,d.w.主编,学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第一部分，griffin，a.m.和griffin，h.g.，编辑，humana出版社，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析，冯海杰，g.，学术出版社，1987和序列分析引物，格里斯科夫，m.和devereux，j.，编辑，m stockton出版社，纽约，1991。
44.在本发明的一个优选方面，如本文公开的在6b8表位内具有至少一个突变的重组e2蛋白是免疫原性的，并且优选赋予针对csfv的保护性免疫。e2蛋白含有四个抗原结构域，a、b、c和d结构域，并且所有这些结构域都位于e2蛋白的n端。这四个结构域组成两个独立的抗原单元，一个是b/c结构域单元，并且另一个包括a/d结构域。b/c结构域位于氨基酸位置1至位置84/111，d/a结构域位于氨基酸位置77至位置111/177。此外，b/c结构域通过氨基酸4c与48c之间的推定二硫键连接，而单元d/a由两个二硫键形成，一个在氨基酸103c与167c之间，并且另一个在氨基酸129c与139c之间。这些半胱氨酸残基对e2蛋白的构象抗原结构至关重要。抗原基序(82
‑
85llfd)是e2蛋白与恢复期血清结合的重要抗原结构。还鉴定了另一个基序(rylaslhkkalpt，氨基酸位置64至76)，其对于e2蛋白的构象表位识别的结构完整性是重要的。此外，据报道，仅含有上述抗原结构域之一的e2蛋白仍然具有免疫原性，并能保护猪免受感染性csfv攻击。因此，在本发明的一个优选方面，本文所述的6b8表位内具有至少一个修饰的重组e2蛋白保留至少一个，优选至少一个如上所述的抗原结构域。优选地，本发明的重组e2蛋白可赋予针对csfv的保护性免疫。在一个方面中，可以引入如本文所定义的6b8表位内的至少一个突变，而基本上不影响重组e2蛋白针对csfv的保护性免疫原性。
45.在本发明的一个方面中，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由e2蛋白的位置14、位置22、位置24和/或位置24和25(“24/25”)处的氨基酸残基限定。
46.在本发明的一个方面，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由e2蛋白的氨基酸残基s14、g22、e24和/或e24/g25限定，例如对于分离株qz07、gd18或gd191。在本发明的一个方面，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由e2蛋白的氨基酸残基s14、g22、g24和/或g24/g25限定，例如对于c株。
47.氨基酸残基的编号是指在加工的e2蛋白中从n
‑
末端开始的氨基酸位置，例如以示例性方式到seq id no:11或12中提供的氨基酸位置。然而，氨基酸位置可以进一步相对于多蛋白(包含npro
‑
c
‑
erns
‑
e1
‑
e2
‑
p7
‑
ns2
‑
ns3
‑
ns4a
‑
ns4b
‑
ns5a
‑
ns5b)定义，例如相对于以示例性方式在seq id no:13或14提供的氨基酸位置定义。例如，e2蛋白的位置14、位置22、位置24和位置25处的氨基酸残基对应于多蛋白的位置703、位置711、位置713和位置714处的氨基酸残基。
48.在本发明的一个方面，由6b8单克隆抗体特异性识别的重组e2蛋白的6b8表位至少由氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)(例如对于分离株qz07、gd18或gd191)或stdeigllgagg(seq id no:2)(例如对于c株)来限定。在本发明的一个方面，由6b8单克隆抗体特异性识别的重组e2蛋白的6b8表位至少由氨基酸序列stneigplgaeg(seq id no:1)(例如对于分离株qz07、gd18或gd191)限定。在本发明的一个方面，由6b8单克隆抗体特异性识别的重组e2蛋白的6b8表位至少由氨基酸序列stdeigllgagg(seq id no:2)(例如对于c
‑
株)限定。
49.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置24/25处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代、和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
50.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置25处的取代。
51.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代。
52.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置25处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代。
53.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
54.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置25处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
55.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv包括在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
56.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
57.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置25处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代和在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
58.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的24位氨基酸被取代为r或k，24位氨基酸被取代为r或k，并且e2蛋白的25位氨基酸被分别取代为d，e2蛋白的14位氨基酸被取代为k、q或r，和/或e2蛋白的22位氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
59.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，并且e2蛋白的位置25处的氨基酸被取代为d。
60.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24的氨基酸被取代为r或k，并且e2蛋白的位置14的氨基酸被取代为k、q或r。
61.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置25处的氨基酸被取代为d，e2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为k、q或r。
62.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
63.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置25处的氨基酸被取代为d，e2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
64.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为k、q或r，e2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
65.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的
氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为k、q或r，e2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
66.在本发明的一个方面，在根据本发明的重组csfv e2蛋白中，e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置25处的氨基酸被取代为d，e2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为k、q或r，e2蛋白的位置22处的氨基酸被a、r、q或e取代，优选a和r。
67.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，在氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置25处将g取代为d，在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
68.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置25处的g取代为d。
69.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24的e或g取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k、q或r。
70.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24的e或g取代为r或k，在e2蛋白的氨基酸位置25的g取代为d，以及在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r。
71.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
72.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24的e或g取代为r或k，在e2蛋白的氨基酸位置25的g取代为d，以及在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
73.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r，以及在e2蛋白的氨基酸位置22的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
74.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k、q或r，以及在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
75.在本发明的一个方面，根据本发明的重组csfv e2蛋白包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e或g取代为r或k，在e2蛋白的氨基酸位置25处的g取代为d，在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k、q或r，以及在e2蛋白的氨基酸位置22的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
76.在本发明的一个方面，根据本发明的e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列ktneigplgard(seq id no:15)或ktneigpllaard(seq id no:16)或stneigplgard(seq id no:17)或stdeigllgard(seq id no:18)或ktdeigllaard(seq id no:19)或ktdeigllaard(seq id no:20)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列ktneigplgard(seq id no:15)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列ktneigplaard(seq id no:16)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列stneigplgard(seq id no:17)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列stdeigllgard(seq id no:18)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基
酸取代导致突变的6b8表位序列ktdeigllgard(seq id no:19)。在本发明的一个方面，e2蛋白的6b8表位内的氨基酸取代导致突变的6b8表位序列ktdeigllaard(seq id no:20)。
77.本领域技术人员将认识到，本发明的重组csfv e2蛋白可以衍生自各种csfv分离株，因为6b8表位在不同csfv株之间是进化保守的。
78.在本发明的一个方面，本发明的重组csfv e2蛋白衍生自基因型组2.1的分离株。在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如野毒株gd18或qz07。野外株qz07具有如seq id no:21所示的全长核苷酸序列，或者包含或表达具有seq id no:13所示的氨基酸序列的多蛋白。野外株gd18具有如seq id no:22所示的全长核苷酸序列，或者包含或表达具有seq id no:14所示氨基酸序列的多蛋白。
79.在本发明的一个方面，本发明的重组csfv e2蛋白衍生自基因型组1的分离株。在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自本领域公知的c
‑
株。
80.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如野毒株qz07或gd18，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a，r、q或e，优选a和r。
81.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如野毒株qz07或gd18，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置25处的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k，q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
82.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如野毒株gd18，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r，q或e，优选a和r。
83.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如野毒株gd18，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置25处的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k，q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
84.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如c
‑
株，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24的g取代为r或k，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
85.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白衍生自例如c
‑
株，并且包括在e2蛋白的氨基酸位置24的g取代为r或k，以及在e2蛋白的氨基酸位置25的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k，q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e取代，优选a和r。
86.在本发明的一个方面，为了获得可溶性e2蛋白，可以截短根据本发明的重组e2蛋白以除去跨膜结构域。例如，根据本发明的完整e2蛋白的c
‑
末端的最后约40个氨基酸(例如42或43个氨基酸)可以缺失。
87.在本发明的一个方面，为了获得根据本发明的重组e2蛋白的分泌形式，可以将信号肽添加到e2蛋白的n
‑
末端。例如，来自e1蛋白的最后约20个氨基酸，特别是最后16个氨基酸(例如，对于c
‑
株)或21个氨基酸(例如，对于gd18或qz07)可以添加到根据本发明的重组e2蛋白的n
‑
末端。在一个方面，信号肽可以包含选自seq id no:49
‑
51的氨基酸序列。本领
域技术人员将认识到，允许分泌表达的其它信号肽也可应用于本发明中。
88.在本发明的一个方面，可以截短e2蛋白以去除跨膜结构域，并且可以将信号肽添加到e2蛋白的n
‑
末端，从而获得可溶性和分泌的e2蛋白，例如，完整e2蛋白的最后43个氨基酸可以缺失，并且来自e1蛋白的最后16个氨基酸或21个氨基酸可以被添加到e2蛋白的n
‑
末端。
89.在本发明的一个方面，重组e2蛋白还可以包括用于识别和/或纯化的融合标签。这样的标签在本领域中是公知的，例如his标签或flag标签。
90.在本发明的一个方面，重组csfv e2蛋白包含选自seq id no:23
‑
28、30
‑
41和43
‑
48之一的氨基酸序列。
91.在本发明的一个方面，本发明的重组e2蛋白包含与seq id no23
‑
28、30
‑
41和43
‑
48中的任何一个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，其在6b8表位内包含至少一个突变。
92.一方面，本发明还提供了包含根据本发明的重组csfv e2蛋白的免疫原性组合物。
93.本文所用的术语“免疫原性组合物”是指包含至少一种抗原的组合物，所述抗原在施用免疫原性组合物的宿主中引发免疫应答。这种免疫应答可以是对本发明免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫应答。宿主也被描述为“受试者”。优选地，本文描述或提及的任何宿主或受试者是动物。
94.通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种以下效应:特异性针对本发明的免疫原性组合物中包括的抗原的抗体、b细胞、辅助t细胞、抑制性t细胞和/或细胞毒性t细胞和/或γ
‑
δt细胞的产生或活化。优选地，宿主将显示保护性免疫应答或治疗应答。
[0095]“保护性免疫应答”将通过感染宿主通常表现出的临床症状的减少或缺乏、更快的恢复时间和/或感染性持续时间的降低或感染宿主的组织或体液或排泄物中病原体滴度的降低来证明。
[0096]
本文所用的“抗原”是指，但不限于，在宿主中引发对包含这种抗原或其免疫活性组分的免疫原性组合物或感兴趣疫苗的免疫应答的组分。
[0097]
在宿主表现出保护性免疫应答使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低的情况下，免疫原性组合物被描述为“疫苗”。
[0098]
在一个方面，本发明的免疫原性组合物是疫苗。
[0099]
本文所理解的术语“疫苗”是包含抗原物质的用于兽医的疫苗，并且为了诱导针对由csfv感染引起的疾病的特异性和主动免疫的目的而施用。
[0100]
优选地，根据本发明的疫苗是亚单位csfv疫苗，其包含优选如本文所述的在宿主动物中引发保护性免疫应答的重组csfv e2蛋白。
[0101]
疫苗可附加包含药物组合物典型的其它组分。
[0102]
增强免疫应答的附加组分是通常称为“佐剂”的组分，或添加到疫苗中或在由这种附加组分(例如但不限于干扰素、白细胞介素或生长因子)各自诱导后由身体产生的辅助分子。本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷，例如quil a、qs
‑
21(cambridge biotech inc.，cambridge ma)、gpi
‑
0100(galenica pharmaceuticals，inc.，birmingham，al)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。该乳液可以特别基于轻质液体石蜡油(欧
洲药典类型)；类异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二
‑
(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三
‑
(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选是非离子表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇酯、甘露醇酯(例如脱水甘露醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯和任选乙氧基化的油酸、异硬脂酸酯、蓖麻油油酸酯或羟基硬脂酸酯，以及聚氧丙烯
‑
聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是普朗尼克产物，尤其是l121。见hunter等人，《佐剂的理论和实际应用》(edstewart
‑
tull，d.e.s.)，johnwiley and sons，ny，第51
‑
94页(1995年)和todd等人，疫苗15:564
‑
570(1997年)。示例性佐剂是m.powell和m.newman，plenum press，1995年编辑的“疫苗设计，亚单位和佐剂方法”的147页上描述的spt乳液，以及在同一本书的183页上描述的乳液mf59。
[0103]
佐剂的另一个示例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的助剂化合物是交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的聚合物。这些化合物以术语卡波姆而为人所知(phameuropa vol.8，no.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考美国专利2909462，其描述了用具有至少3个羟基，优选不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的丙烯酸类聚合物，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团替换。优选的基团是含有2至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团。不饱和基团本身可以含有其它取代基，例如甲基。以carbopol名义销售的产品；(bf goodrich，俄亥俄州，美国)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提及carbopol 974p、934p和971p。最优选的是使用cabopol 971p。在马来酸酐和链烯基衍生物的共聚物中，有共聚物ema(monsanto)，它是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致酸性溶液，该酸性溶液将被中和，优选为生理ph，以提供佐剂溶液，免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身将被掺入该佐剂溶液中。
[0104]
其它合适的佐剂包括但不限于ribi佐剂系统(ribi inc.)、嵌段共聚物(cytrx，atlanta ga)、saf
‑
m(chiron，emeryville ca)、单磷酰脂质a、avridine脂质胺佐剂、来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、ims 1314或鼠氨酰二肽、或其天然或重组细胞因子或类似物或内源性细胞因子释放的刺激物等。
[0105]
在一个方面，将免疫原性组合物与合适的佐剂配制成油包水乳液。助剂可以包括油和表面活性剂。在一个方面，佐剂是montanide
tm isa 71r vg(由seppic inc.制造，目录号:365187)。在一个方面，佐剂是seppic isa 206。佐剂的添加量可为每剂量约100μg至约10mg。甚至更优选的是，佐剂的加入量为每剂量约100μg至约10mg。甚至更优选的是，佐剂的加入量为每剂量约500μg至约5mg。甚至更优选的是，佐剂的加入量为每剂量约750μg至约2.5mg。最优选的佐剂以每剂量约1mg的量加入。在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物每剂量包含约7份含有佐剂的油相和约3份含有本发明e2蛋白的水相。
[0106]
在本发明的一个方面，如上所定义的，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位内的至少一个突变，例如e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、e2蛋白的氨基酸位置24/25处的取代、e2蛋白的氨基酸位置14处的取代，和/或e2蛋白的氨基酸位置22处的取代被用作标记。
[0107]
本文所用的术语“标记”是指根据本发明的突变体6b8表位。根据本发明的突变体
6b8表位不同于野生型csfv e2蛋白的6b8表位序列(未被遗传修饰的6b8表位)。因此，根据本发明的突变体6b8表位允许通过示例性免疫检测和/或基因组分析检测将具有未突变的6b8表位的自然感染动物与具有根据本发明的突变体6b8表位的接种动物区分开。
[0108]
在本发明的一个方面，本发明的免疫原性组合物是标记疫苗或diva(区分感染的与疫苗接种的动物)疫苗。
[0109]
术语“标记疫苗”或“diva(区分感染的与疫苗接种的动物)”是指具有上述标记的疫苗。因此，标记疫苗可用于区分疫苗接种的动物与自然感染的动物。本发明的免疫原性组合物用作标记疫苗，因为与用野生型csfv感染相反，在接种了本发明的疫苗的动物中，可以检测到根据本发明的取代的6b8表位。通过示例性免疫检测和/或基因组分析检测，根据本发明的取代的6b8表位可以与野生型csfv的6b8表位序列(未被遗传修饰的6b8表位)区分。最后，标记表位应该对病原体是特异性的，以避免由家畜中可能出现的其他有机体诱导的假阳性血清学结果。然而，由于6b8表位是进化保守的(通过序列比对)并且对csfv是特异性的(6b8 mab不结合bvdv)。因此，根据本发明的取代的6b8表位高度适合用于标记疫苗。
[0110]
有效标记疫苗的一个主要优点是，它允许在接种疫苗的猪群中采集样本之前的某个时间(例如至少约3周)检测被急性感染或感染的猪，并且因此提供了监测csfv在猪群中的传播或再引入的可能性。因此，根据实验室检测结果，有可能以一定的置信度宣布接种过疫苗的猪群没有csfv。
[0111]
本发明的标记疫苗理想地适用于在猪瘟检测或暴发的情况下的紧急接种。标记疫苗促进快速和有效的施用，并允许区分感染野病毒(疾病相关)的动物与接种过疫苗的动物。
[0112]
在本发明的一个方面，用本发明的免疫原性组合物治疗的动物可以通过使用免疫试验和/或基因组分析试验分析从所述动物获得的样品而与感染了自然发生的猪瘟病毒的动物区分开。
[0113]
术语“样品”是指体液的样品、分离细胞的样品或来自组织或器官的样品。体液样品可以通过公知技术获得，并且优选地包括血液、血浆、血清或尿液的样品，更优选地，血液、血浆或血清的样品。组织或器官样品可通过例如活组织检查从任何组织或器官获得。分离的细胞可以通过分离技术如离心或细胞分选从体液或组织或器官获得。
[0114]
术语“获得”可以包括本领域技术人员已知的分离和/或纯化步骤，优选使用沉淀、柱等。
[0115]
术语“免疫试验”和“基因组分析试验”具体如下。然而，分别对所述“免疫试验”和“基因组分析试验”的分析是区分用根据本发明的免疫原性组合物接种的动物与由自然发生的(疾病相关的)猪瘟病毒感染的动物的基础。
[0116]
在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用。
[0117]
有利地，本发明提供的实验数据公开了本发明的免疫原性组合物的单剂量施用可靠且有效地刺激保护性免疫应答。因此，在本发明的一个方面，所述免疫原性组合物被配制用于单剂量施用并通过单剂量施用有效。
[0118]
此外，本发明提供了本发明的免疫原性组合物用作药物的用途。
[0119]
在一个方面，本发明提供了预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法，该方法包括将本发明的免疫原性组合物施用于有需要的动物的步骤。在一个方面，与csfv相关
的疾病是csf。
[0120]
本发明还涉及一种用于免疫动物的方法，包括向这种动物施用根据本发明的任何免疫原性组合物。本发明还涉及一种用于免疫动物的方法，包括将本发明的任何免疫原性组合物单独施用于这种动物。优选地，用于免疫动物的方法通过将根据本发明的免疫原性组合物单次施用与这种动物而有效。
[0121]
术语“免疫”涉及通过向要免疫的动物施用免疫原性组合物、由此引起针对包括在这种免疫原性组合物中的抗原的免疫应答的主动免疫。
[0122]
免疫导致减少了特定csfv感染在畜群中的发生率，或者减少了由特定csfv感染引起或与特定csfv感染相关的临床症状的严重性。优选地，通过单次施用根据本发明的免疫原性组合物，免疫导致畜群中特定csfv感染的发生率降低，或者导致由特定csfv感染引起或与之相关的临床症状的严重性降低。
[0123]
根据本发明的一个方面，用本文提供的免疫原性组合物对需要的动物进行免疫，导致预防受试者通过csfv感染的感染，优选通过单次施用本发明的免疫原性组合物。甚至更优选地，免疫导致针对csfv感染的有效、持久的免疫应答。应当理解，所述时间段将持续2个月以上，优选3个月以上，更优选4个月以上，更优选5个月以上，更优选6个月以上。应当理解，免疫可能不是对所有免疫的动物都有效。然而，该术语要求畜群中相当大一部分的动物得到有效的免疫。
[0124]
优选地，在本文中设想了一群动物，其通常(即，在没有免疫的情况下)将发展出通常由csfv感染引起或与csfv感染相关的临床症状。畜群中的动物是否被有效免疫可由本领域技术人员在没有进一步ado的情况下确定。优选地，与没有用本发明之前可用但随后被csfv感染的免疫原性组合物免疫或免疫的动物相比，如果给定畜群的动物中的至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的临床症状在发病率或严重性方面降低至少10％、更优选至少20％、还更优选至少30％、甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，最优选至少95％，则免疫将是有效的。
[0125]
在本发明的一个方面中，该动物是猪。在一个方面，动物是仔猪。仔猪通常小于3至4周龄。在一个方面中，仔猪在1至4周龄之间接种疫苗。在一个方面，动物是母猪。在一个方面，动物是怀孕的母猪。
[0126]
在本发明的一个方面，免疫原性组合物被施用于皮内、气管内、阴道内、肌肉内、鼻内、静脉内、动脉内、腹膜内、口服、鞘内、皮下、皮内、心内、叶内、髓质内、肺内及其组合。然而，取决于化合物的性质和作用方式，免疫原性组合物也可以通过其它途径施用。
[0127]
本发明还提供了一种降低动物中一种或多种与csf相关的临床症状的发生率或严重性的方法，该方法包括以下步骤:将根据本发明的免疫原性组合物施用于需要其的动物，其中所述一种或多种临床症状的发病率或严重性的降低与不接受所述免疫原性组合物的动物有关。优选地，该方法包括施用单剂量的免疫原性组合物，并且通过免疫原性组合物的这种单次施用有效地降低一种或多种临床症状的发生率或严重性。
[0128]
这里使用的术语“临床症状”是指动物从csfv感染的症状。临床症状在下面进一步定义。然而，临床症状还包括但不限于可从活体动物直接观察到的临床症状。可从活体动物直接观察到的临床症状的示例包括鼻和眼分泌物、嗜睡、咳嗽、喘息、捶打、高热、体重增加
或减轻、脱水、腹泻、关节肿胀、跛行、消瘦、皮肤苍白、不节俭等。mittelholzer等人(vet.microbiol.，2000.74(4):p.293
‑
308)开发了一个用于确定csf动物实验中的临床得分的检查表。这个检查表包含了活力、身体张力、体型、呼吸、行走、皮肤、眼睛/结膜、食欲、排便和喂食过程中的残留物等参数。
[0129]
与未用本发明之前可获得的免疫原性组合物治疗或用免疫原性组合物治疗但随后被csfv感染的受试者相比，优选地，临床症状的发生率或严重性降低至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，并且最优选地，至少95％。
[0130]
在本发明的一个方面，免疫原性组合物被施用一次，并且通过这种单次施用是有效的。
[0131]
然而，虽然单剂量施用是优选的，但免疫原性组合物也可以施用两次或几次，其中在施用第二(增强剂)剂量之前施用第一剂量。优选地，在第一剂量后至少15天施用第二剂量。优选地，在第一剂量后15天至40天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量后至少17天施用第二剂量。还更优选地，在第一剂量后17天至30天之间施用第二剂量。甚至更优选地，在第一剂量后至少19天施用第二剂量。还更优选地，在第一剂量后19天至25天之间施用第二剂量。最优选地，在第一剂量后至少21天施用第二剂量。在两次施用方案的优选方面，免疫原性组合物的第一和第二剂量均以相同量施用。除了第一和第二剂量方案之外，可选实施例包括进一步的后续剂量。例如，在这些方面可以施用第三、第四或第五剂量。优选地，随后的第三、第四和第五剂量方案以与第一剂量相同的量施用，剂量之间的时间范围与上述第一和第二剂量之间的时间一致。
[0132]
在本发明的一个方面，所述一种或多种临床症状选自以下组:呼吸窘迫、呼吸困难、咳嗽、打喷嚏、鼻炎、呼吸急促、呼吸困难、肺炎、耳朵和外阴红/蓝变色、黄疸、淋巴细胞浸润、淋巴结病、肝炎、肾炎、厌食症、发热、嗜睡、无乳(agalatia)、腹泻、鼻挤出物、结膜炎、进行性体重减轻、体重减轻、皮肤苍白、胃溃疡、器官和组织的宏观和微观病变、淋巴病变、死亡率、病毒流产、死胎、仔猪畸形、木乃伊化及其组合。
[0133]
在一个方面中，本发明还提供了区分感染csfv的动物与接种根据本发明的免疫原性组合物的动物的方法，包括:
[0134]
a)获得样品，和
[0135]
b)在免疫检测中检测所述样品。
[0136]
术语“免疫检测”是指包含对csfv的e2蛋白的6b8表位特异的抗体的检测。所述抗体可以特异于根据本发明的突变体6b8表位或野生型csfv e2蛋白的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)。然而，术语“免疫检测”也指包含根据本发明的突变6b8表位肽或野生型csfv e2蛋白的6b8表位肽(未被遗传修饰的6b8表位)的检测。免疫检测的示例包括任何酶免疫或免疫化学检测方法，例如elisa(酶联免疫吸附测定)、eia(酶免疫测定)、ria(放射免疫测定)、夹心酶免疫试验、荧光抗体试验(fat)、电化学发光夹心免疫测定(eclia)、解离增强的镧系元素氟免疫测定(delfia)或固相免疫检测、免疫荧光试验(ift)、免疫组织学染色、蛋白质印迹分析或本领域技术人员可获得的任何其他合适方法。根据所用的试验，抗原或抗体可以用酶、荧光团或放射性同位素标记。例如，参见coligan等人，免疫学中的当前协议，
john wiley&sons inc.，new york，ny(1994)；以及frye等人，oncogen 4:1153
‑
1157，1987。
[0137]
优选地，使用对野生型csfv e2蛋白的6b8表位特异的抗体来检测血清细胞(例如白细胞)或分离器官(例如扁桃体、脾、肾、淋巴结，回肠的远端部分)来自怀疑感染了野生型csfv的动物(例如猪)或用包含根据本发明的重组csfv e2蛋白的疫苗接种的动物(例如猪)。在这种情况下，只有感染了野生型csfv的动物样品将显示出所述6b8表位特异性抗体的阳性结果。相反，用包含本发明的重组csfv e2蛋白的疫苗接种的动物的样品将由于根据本发明的6b8表位内的突变而没有显示所述6b8表位特异性抗体的结果。在另一种检测中，csfv从例如感染、怀疑感染了野生型csfv或接种了疫苗的动物中的器官(例如动物的扁桃体)或血清细胞(例如白细胞)中分离，并与用于病毒感染细胞的合适细胞系(例如sk
‑
6细胞或pk
‑
15细胞)孵育。随后使用6b8表位特异性抗体在细胞中检测复制的病毒，所述6b8表位特异性抗体区分场(野生型，疾病相关)csfv与根据本发明的重组csfv。此外，肽可用于阻断非特异性交叉反应。此外，对野生型csfv的其它表位特异的抗体可以用作阳性对照。
[0138]
更优选地，使用elisa，其中特异性针对野生型csfv e2蛋白的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的抗体交联至微孔测定板，用于区分感染的猪和接种了本发明疫苗的猪。所述交联优选通过锚定蛋白例如聚
‑
l
‑
赖氨酸进行。当与采用被动包被技术的elisa相比时，采用这种交联的elisa通常更敏感。野生型(疾病相关的)csfv结合到特异性针对野生型csfv e2蛋白的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的抗体。野生型csfv病毒与特异性针对野生型csfv的6b8表位的抗体的结合的检测可以通过针对csfv的另外的抗体来进行。在这种情况下，只有感染猪的样品将显示6b8表位特异性抗体的阳性结果。此外，肽可用于阻断非特异性交叉反应。此外，对野生型csfv的其它表位特异的抗体可以用作阳性对照。
[0139]
或者，微孔测定板可以与csfv特异性抗体交联，而不是野生型csfv e2蛋白的6b8表位特异性抗体(未被遗传修饰的6b8表位)。野生型(疾病相关)csfv与交联抗体结合。野生型csfv与交联抗体的结合的检测可以通过特异性针对野生型csfv e2蛋白的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的抗体来进行。
[0140]
如上所述，6b8表位是进化保守的并且对野生型csfv是特异性的。
[0141]
因此，更优选地，elisa用于在样品中检测针对根据本发明的突变体6b8表位或野生型csfv的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的抗体。这样的检测包括根据本发明的突变6b8表位肽或野生型csfv的6b8表位肽(未被遗传修饰的6b8表位)。
[0142]
例如，这样的检测可以包括具有根据本发明的取代的6b8表位或与微孔测定板交联的野生型csfv的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的孔。所述交联优选通过锚定蛋白例如聚
‑
l
‑
赖氨酸进行。用于获得突变体或野生型6b8表位的表达系统是本领域技术人员公知的。或者，所述6b8表位可以化学合成。必须理解，尽管突变体或野生型6b8表位本身可以用于本发明的检测中，但是可以方便地使用包含完整e2蛋白的蛋白或包含所述6b8表位的e2蛋白的片段的蛋白，而不是相对短的表位本身。特别是当表位例如用于标准elisa检测中孔的包被时，对于包被步骤，使用包含表位的较大蛋白质可能更有效。
[0143]
用包含根据本发明的重组csfv e2蛋白的疫苗接种的动物没有产生针对野生型6b8表位的抗体。然而，根据本发明，这些动物已经产生了针对取代的6b8表位的抗体。结果，没有抗体结合到用野生型6b8表位包被的孔上。相反，如果孔已经用本发明的突变体6b8表位包被，则抗体结合到所述突变体6b8表位。
[0144]
然而，感染了野生型csfv的动物将产生针对csfv的野生型表位的抗体。然而，根据本发明，这些动物没有产生针对突变体6b8表位的抗体。结果，没有抗体结合到用本发明的突变体6b8表位包被的孔上。相反，如果孔已经用野生型6b8表位包被，则抗体结合到野生型6b8表位。
[0145]
抗体与根据本发明的突变体6b8表位或野生型csfv的6b8表位(未被遗传修饰的6b8表位)的结合可以通过本领域技术人员公知的方法进行。
[0146]
优选地，elisa是夹心型elisa。更优选地，elisa是竞争性elisa。最优选地，elisa是双竞争性elisa。然而，不同的elisa技术是本领域技术人员公知的。wensvoort g.等.,1988(vet.microbiol.17(2):129
‑
140)、robiolo b.等.,2010(j.virol.methods.166(1
‑
2):21
‑
27)和colijn,e.o.等.,1997(vet.microbiology 59:15
‑
25)示例性地描述了ellsa。
[0147]
在本发明的一个方面，免疫检测包括检测特异性识别csfv e2蛋白的完整6b8表位的抗体是否与样品中的csfv e2蛋白结合。在本发明的一个方面，免疫检测包括检测样品中是否存在特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体，和/或检测样品中是否存在特异性识别csfv e2蛋白的突变6b8表位的抗体。这种突变的6b8表位包括如本文所定义的6b8表位中的突变。
[0148]
在本发明的一个方面，免疫学检测是eia(酶免疫测定)或elisa(酶联免疫吸附测定)。在本发明的一个方面，elisa是间接elisa、夹心elisa、竞争性elisa或双竞争性elisa，优选双竞争性elisa。
[0149]
在一个方面，本发明还提供编码根据本发明的重组csfv e2蛋白的核酸。
[0150]
术语“核酸”是指多核苷酸，包括dna分子、rna分子、cdna分子或衍生物。该术语包括单链和双链多核苷酸。本发明的核酸包括重组多核苷酸(即来自其天然背景的重组体)和遗传修饰形式。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修饰的多核苷酸如生物素化的多核苷酸。此外，应当理解，由于简并的遗传密码，本发明的重组csfv e2蛋白可以由大量多核苷酸编码。
[0151]
在一个方面，本发明还提供了包含编码根据本发明的重组csfv e2蛋白的核酸的载体。在一个方面，载体是表达载体。
[0152]
术语“载体”包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，例如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合到基因组dna中。这样的靶构建体优选包含足够长度的dna，用于同源或异源重组，如下文详细描述的。优选地，包含本发明核酸的载体还包括用于在宿主中繁殖和/或选择的选择性标记。可以通过本领域公知的各种技术将载体掺入宿主细胞中。例如，可以将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀物或氯化铷沉淀物中，或引入与带电脂质的复合物中，或引入碳基簇如富勒烯中。或者，可以通过热冲击或电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，则在应用于宿主细胞之前，可以使用合适的包装细胞系在体外包装载体。逆转录病毒载体可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒繁殖通常仅在互补的宿主/细胞中发生。更优选地，多核苷酸可操作地连接到允许在原核或真核细胞或其分离部分中表达的表达控制序列。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸的转录，优选转录为可翻译mrna。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调节元件是本领域公知的。它们优选包括确保转录起始的调节序列、和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly
‑
a信号。另外的调节元件可以
包括转录以及翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括例如大肠杆菌中的lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的示例是酵母中的aox1或gal1启动子，或者哺乳动物和其他动物细胞中的cmv
‑
、sv40
‑
、rsv
‑
启动子(rous肉瘤病毒)、cmv
‑
增强子、sv40
‑
增强子或珠蛋白内含子。此外，可诱导的表达控制序列可用于本发明所包括的表达载体中。这种可诱导的载体可包括tet或lac操纵子序列或可由热休克或其它环境因素诱导的序列。合适的表达控制序列是本领域公知的。例如，这些技术描述于sambrook，molecular cloning a laboratory manual，cold spring harbor laboratory(1989)n.y.和ausubel，分子生物学的当前协议，green publishing associates和wiley interscience，n.y.(1994)。优选地，本发明的载体是杆状病毒载体。
[0153]
一方面，本发明还提供了包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或真核细胞，如插入细胞。优选地，宿主细胞是sf9细胞。
[0154]
在一个方面，本发明还提供了生产本发明的重组csfv e2蛋白的方法，包括:
[0155]
(i)在适合于表达csfv e2蛋白的条件下培养如本文所定义的宿主细胞，以及
[0156]
(ii)分离和任选纯化csfv e2蛋白。
[0157]
在一个方面，本发明还提供了制备免疫原性组合物的方法，包括:(i)培养含有能够表达e2蛋白的表达载体的细胞；和(ii)收获e2蛋白或包含e2蛋白的全细胞培养物，其中e2蛋白包含被如上文所定义的6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位内的至少一个突变。
[0158]
在本发明的一个方面，表达载体是包含本发明核酸分子的重组杆状病毒。在一个方面，重组杆状病毒衍生自商业产品。在一个方面，重组杆状病毒衍生自以商标sapphiretm杆状病毒(allele biotechnology)销售的商业产品。在一个方面，细胞是昆虫细胞。在一个方面，昆虫细胞是sf 细胞。在一个实施例中，sf 细胞是蛋白质科学公司(meriden，ct)销售的商业产品。
[0159]
在本发明的一个方面，该方法包括制备包含本发明核酸分子的重组杆状病毒的步骤。在一个方面，重组杆状病毒衍生自商业产品。在一个方面，重组杆状病毒衍生自以商标sapphiretm杆状病毒(allele biotechnology)销售的商业产品。
[0160]
在本发明的一个方面，该方法包括用本发明的重组杆状病毒感染细胞的步骤。在一个实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一个实施例中，昆虫细胞是sf 细胞。在一个实施方案中，sf 细胞是蛋白质科学公司(meriden，ct)销售的商业产品。
[0161]
在本发明的一个方面，该方法包括制备包含本发明核酸分子的重组杆状病毒，并用重组杆状病毒感染昆虫细胞。在一个实施例中，重组杆状病毒衍生自以商标sapphiretm杆状病毒(allele biotechnology)销售的商业产品。在一个实施方案中，昆虫细胞是sf 细胞。在一个实施方案中，sf 细胞是蛋白质科学公司(meriden，ct)销售的商业产品。
[0162]
在本发明的一个方面，该方法包括:(i)制备包含本发明核酸分子的重组杆状病毒；(ii)用重组杆状病毒感染昆虫细胞；(iii)在培养基中培养昆虫细胞；以及(iv)收获本发明的e2蛋白或包含本发明的e2蛋白的全细胞培养物。在一个实施方案中，重组杆状病毒衍生自以商标sapphiretm杆状病毒(allele biotechnology)销售的商业产品。在一个实施方案中，昆虫细胞是sf 细胞。在一个实施方案中，sf 细胞是蛋白质科学公司(meriden，ct)销售的商业产品。
[0163]
在本发明的一个方面，用于培养本发明细胞的培养基将由本领域技术人员确定。在一个方面，培养基是无血清昆虫细胞培养基。在一个方面，培养基是ex
‑
cell 420(用于昆虫细胞的420无血清培养基，sigma
‑
aldrich，cat.14420c)。
[0164]
在本发明的一个方面，昆虫细胞在适于表达e2蛋白的条件下培养。在一个方面，将昆虫细胞孵育长达10天的时间，优选约2天至约10天，更优选约4天至约9天，并且甚至更优选约5天至约8天。在一个方面，适合于培养昆虫细胞的条件包括约22
‑
32℃，优选约24
‑
30℃，更优选约25
‑
29℃，甚至更优选约26
‑
28℃，并且最优选约27℃的温度。
[0165]
在本发明的一个方面，该方法还包括灭活本发明的细胞培养物的步骤。任何常规的灭活方法都可以用于本发明的目的，包括但不限于化学和/或物理处理。
[0166]
在一个方面，灭活步骤包括添加环化的二元乙撑亚胺(bei)，优选浓度为约1至约20mm，优选浓度为约2至约10mm，更优选浓度为约5mm或10mm。在一个实施例中，灭活步骤包括加入2
‑
溴亚乙基胺氢溴酸盐的溶液，该溶液将在naoh中环化形成bei。
[0167]
在一个方面，灭活步骤在25
‑
40℃之间进行，优选在28
‑
39℃之间，更优选在30
‑
39℃之间，更优选在35
‑
39℃之间。在一个实施例中，灭活步骤进行24
‑
72小时，优选30
‑
72小时，更优选48
‑
72小时。通常，进行灭活步骤直到检测不到病毒载体的复制。
[0168]
在本发明的一个方面，该方法还包括在灭活步骤之后的中和步骤。中和步骤包括加入等量的中和溶液中的灭活剂的试剂。在一个实施例中，灭活剂是bei。在一个方面，中和剂是硫代硫酸钠。在一个方面，当灭活剂是bei时，将加入等量的硫代硫酸钠。例如，在bei被添加到5mm的终浓度的情况下，添加1.0m硫代硫酸钠溶液以得到5mm的最终最小浓度，以中和任何残留的bei。在一个方面，中和步骤包括当灭活剂是bei时，加入硫代硫酸钠溶液至终浓度为1至20mm，优选为2至10mm，更优选为5mm或10mm。在一个方面，在灭活步骤完成之后加入中和剂，这意味着不能检测到病毒载体复制的复制。在一个方面，在失活步骤进行24小时之后加入中和剂。在一个方面，在失活步骤进行30小时之后加入中和剂。在一个方面，在失活步骤进行48小时之后加入中和剂。在一个方面，在失活步骤进行72小时之后加入中和剂。
[0169]
在一个方面中，本发明还提供了用于区分感染csfv的动物与接种根据本发明的免疫原性组合物的动物的试剂盒。在一个方面，试剂盒包含本文定义的抗体或其抗原结合片段，在6b8表位中具有突变的本发明的重组e2蛋白，和/或包含本文定义的6b8表位的csfv的野生型e2蛋白。该试剂盒还可包含使用说明。
[0170]
以下条款也在本文中描述并且是本发明公开的一部分:
[0171]
1.重组csfv(经典猪瘟病毒)e2蛋白，其在所述6b8表位内包含至少一个突变，其中所述未修饰的6b8表位被所述6b8单克隆抗体特异性识别。
[0172]
2.根据条款1所述的重组csfv e2蛋白，其中e2蛋白的6b8表位内的至少一个突变导致6b8单克隆抗体与这种突变的6b8表位的结合的特异性抑制。
[0173]
3.根据条款1或2所述的重组csfv e2蛋白，其中所述6b8单克隆抗体
[0174]
(i)由以保藏号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生，或
[0175]
(ii)包含具有seq id no:9所示氨基酸序列的重链可变区(v
h
)和具有seq id no:10所示氨基酸序列的轻链可变区(v
l
)，或者
[0176]
(iii)包含由以保藏号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体的cdr，或
[0177]
(iv)包含含有seq id no:3所示的氨基酸序列的vh cdr1、含有seq id no:4所示的氨基酸序列的vh cdr2、含有seq id no:5所示的氨基酸序列的vh cdr3、含有seq id no:6所示的氨基酸序列的vl cdr1，含有seq id no:7所示的氨基酸序列的vl cdr2，和含有seq id no:8所示的氨基酸序列的vl cdr3。
[0178]
4.根据条款1至3中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由e2蛋白的位置14、位置22、位置24和/或位置24/25的氨基酸残基限定。
[0179]
5.根据条款1至3中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由e2蛋白的氨基酸残基s14、g22、e24和/或e24/g25限定，或者至少由e2蛋白的氨基酸残基s14、g22、g24和/或g24/g25限定。
[0180]
6.根据第1至3中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中，由6b8单克隆抗体特异性识别的e2蛋白的6b8表位至少由氨基酸序列stneigplgaeg或stdeigllgagg限定。
[0181]
7.根据条款1至6中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其包括在e2蛋白的氨基酸位置24处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置24/25处的取代、在e2蛋白的氨基酸位置14处的取代和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的取代。
[0182]
8.根据条款1至7中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中e2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为r或k，e2蛋白的位置24和25处的氨基酸分别被取代为r或k和d，e2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为k、q或r，和/或e2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为a、r、q或e，优选a和r。
[0183]
9.根据条款1至8中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其包括在e2蛋白的氨基酸位置24的e或g取代为r或k，在e2蛋白的氨基酸位置24的e或g取代为r或k，在氨基酸位置25的g取代为d，e2蛋白的氨基酸位置14处的s取代为k，q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
[0184]
10.根据条款1至9中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中6b8表位内的氨基酸取代导致seq id no:15
‑
20中任一项的突变6b8表位序列。
[0185]
11.根据条款1至10中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白衍生自c株或野毒株qz07或gd18。
[0186]
12.根据条款1至11中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白衍生自野毒株qz07，并且包括在所述e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，或者在e2蛋白的氨基酸位置24的e取代为r或k，并且在氨基酸位置25的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
[0187]
13.根据条款1至11中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白衍生自野毒株gd18，并且包括在所述e2蛋白的氨基酸位置24处的e取代为r或k，或者在e2蛋白的氨基酸位置24的e取代为r或k，并且在e2蛋白的氨基酸位置25的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k、q或r，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22的g取代为a。
[0188]
14.根据条款1至11中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白衍生自c株，并且包括在所述e2蛋白的氨基酸位置24的g取代为r，以及在所述e2蛋白的氨基
酸位置25的g取代为d，并且任选地还包括在e2蛋白的氨基酸位置14的s取代为k，和/或在e2蛋白的氨基酸位置22处的g取代为a、r、q或e，优选a和r。
[0189]
15.根据条款1至11中任一项所述的重组csfv e2蛋白，其中所述重组csfv e2蛋白包含选自seq id no:23
‑
28、30
‑
41和43
‑
48之一的氨基酸序列。
[0190]
16.一种重组核酸，其编码根据条款1至15中任一项的重组csfv e2蛋白。
[0191]
17.一种载体，其包含条款16的核酸。
[0192]
18.一种宿主细胞，其包含条款16的核酸或条款17的载体。
[0193]
19.一种用于生产根据条款1至15中任一项的重组csfv e2蛋白的方法，包括:
[0194]
(i)在适合于表达csfv e2蛋白的条件下培养条款18的宿主细胞，以及
[0195]
(ii)分离和任选地纯化csfv e2蛋白。
[0196]
20.一种免疫原性组合物，其包含根据条款1至15中任一项所述的重组csfv e2蛋白、根据条款16所述的重组核酸或根据条款17所述的载体。
[0197]
21.根据条款20所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是疫苗，优选标记疫苗或diva(区分感染的与疫苗接种的动物)疫苗。
[0198]
22.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法中，所述方法包括向动物施用根据条款20或21的免疫原性组合物的步骤。
[0199]
23.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述动物是猪。
[0200]
24.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述动物是小猪。
[0201]
25.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述动物是1至4周龄的小猪。
[0202]
26.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述动物是母猪。
[0203]
27.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述动物是怀孕的母猪。
[0204]
28.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述免疫原性组合物仅施用一次。
[0205]
29.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述免疫原性组合物仅对动物施用一次，并且在所述免疫原性组合物的所述单次施用之后有效地预防和/或治疗与csfv相关的疾病。
[0206]
30.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述免疫原性组合物被施用一次或多次。
[0207]
31.根据条款20或21的免疫原性组合物，用于预防和/或治疗根据条款20或21的动物中与csfv相关的疾病的方法中，其中所述免疫原性组合物被施用于动物一次或多次，并且在所述免疫原性组合物的单次或多次施用之后有效地预防和/或治疗与csfv相关的疾病。
[0208]
32.一种预防和/或治疗动物中与csfv相关的疾病的方法，该方法包括将根据条款20或21的免疫原性组合物施用于有需要的动物的步骤。
[0209]
33.一种区分感染csfv的动物与接种条款20或21中任一项的免疫原性组合物的动物的方法，包括
[0210]
a)获得样品，和
[0211]
b)在免疫检测中检测所述样品。
[0212]
34.根据条款33的方法，其中免疫检测包括检测特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位或其抗原结合片段的抗体是否能够结合样品中的csfv e2蛋白。
[0213]
35.根据条款33或34的方法，其中免疫检测包括检测样品中是否存在特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体，和/或检测样品中是否存在特异性识别重组csfv e2蛋白的突变6b8表位的抗体。
[0214]
36.根据条款33至35中任一项的方法，其中免疫检测是eia(酶免疫测定)或elisa(酶联免疫吸附测定)，优选双竞争elisa。
[0215]
37.根据条款34至36中任一项的方法，其中特异性识别6b8表位的抗体
[0216]
(i)由以保藏号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生，或
[0217]
(ii)包含具有seq id no:9所示氨基酸序列的重链可变区(vh)和具有seq id no:10所示氨基酸序列的轻链可变区(vl)，或者
[0218]
(iii)包含由以保藏号cctcc c2018120保藏在cctcc的杂交瘤产生的单克隆抗体的cdr，或
[0219]
(iv)包含含有seq id no:3所示的氨基酸序列的vh cdr1、含有seq id no:4所示的氨基酸序列的vh cdr2、含有seq id no:5所示的氨基酸序列的vh cdr3、含有seq id no:6所示的氨基酸序列的vl cdr1，含有seq id no:7所示的氨基酸序列的vl cdr2，和含有seq id no:8所示的氨基酸序列的vl cdr3。
[0220]
38.一种用于区分感染csfv的动物与用条款19或20中任一项的免疫原性组合物接种的动物的试剂盒，其包含特异性识别csfv e2蛋白的6b8表位的抗体或其抗原结合片段。
[0221]
实施例
[0222]
随后的实施例以示例性方式进一步说明本发明。应当理解，本发明不限于如下所述的那些实施例中的任何一个。本领域技术人员理解，鉴于本发明的一般描述，这些实施例的性能、结果和发现可以在更广泛的意义上进行调整和应用。
[0223]
材料和方法
[0224]
1.细胞培养
[0225]
用含5％胎牛血清(fbs)的excell 420培养液培养sf9细胞，在27℃无co2培养。
[0226]
将sf 细胞在excell 420培养基中培养，在27℃、速度为120rpm的摇床上培养。
[0227]
用10％胎牛血清(fbs)培养pk/wrl细胞系，并在37℃和5％co2下孵育。
[0228]
2.基于pvl1393穿梭质粒的构建
[0229]
将qz07
‑
e2序列、qz07
‑
e2
‑
krd和qz07
‑
e2
‑
kard序列均进行密码子优化(seq id no:52
‑
54)并根据昆虫表达系统进行合成。为了获得可溶性和秘密形式的e2蛋白，在最终的优化序列中删除e2的最后43个氨基酸(aa)，同时添加来自e1蛋白的最后21个氨基酸作为信号肽。要表达的e2结构的示意图如图1所示。通过bamh i和ecor i将每个合成的序列克隆到pvl1393穿梭质粒中，以完成pvl1393穿梭质粒，用于进一步共转染。csfv e2和具有6b8表位突变的csfv e2的整个构建过程参见图2。kard是指s14k、g22a和e24r/g25d突变，氨基酸的
编号是指e2蛋白，如seq id no:11。还将其它突变组合，例如krd(s14k和e24r/g25d)分别引入e2蛋白中。
[0230]
c
‑
e2序列和c
‑
e2
‑
kard序列(分别为seq id no:55和56)各自被合成。为了获得可溶性和秘密形式的e2蛋白，在最终序列中删除e2的最后42个氨基酸(aa)，同时添加来自e1蛋白的最后16个氨基酸作为信号肽。要表达的e2结构的示意图如图1所示。通过bamh i和ecor i将每个合成的序列克隆到pvl1393穿梭质粒中，以完成pvl1393穿梭质粒，用于进一步共转染。csfv e2和具有6b8表位突变的csfv e2的整个构建过程参见图2。kard是指s14k、g22a和g24r/g25d突变，氨基酸的编号是指e2蛋白，如seq id no:29。
[0231]
3.e2表达盒重组杆状病毒的构建
[0232]
在六孔板中制备sf9细胞的一个孔(1.0x106)用于转染，并将另一个孔用作细胞对照。孵育1小时后，将细胞均匀地分布在表面上。将0.5ml无血清grace's昆虫培养基(未补充)和3μl dna穿梭转染剂混合在一个试管中制备dna脂质体转染混合物；在另一个试管中，加入1μl sapphire杆状病毒dna、1μg转移质粒和0.5ml无血清grace's昆虫培养基(未补充)；将两个管的内容物合并成一个，并且轻轻混合，并在室温放置20分钟。从细胞中取出培养基，并且每次用1ml无血清grace's昆虫培养基(未补充)冲洗单层两次，然后从细胞中取出培养基并加入dna/转染剂混合物。细胞单层在27℃孵育4
‑
5小时，并且将转染混合物用2ml含5％fbs的excell 420替换。在27℃继续孵育5
‑
6天。通过在4℃以3000rpm离心10分钟来收集细胞和细胞培养基。
[0233]
4重组杆状病毒的斑块纯化工艺
[0234]
制备具有sf9细胞(1.5
×
106细胞/孔)的六孔板，并在室温下放置1小时。制备各病毒的10倍系列稀释液(50μl病毒和450μl培养基)，从10
‑
1稀释到10
‑
6稀释。将细胞培养基从平板中取出，并将稀释10
‑3至10
‑6的每孔100μl病毒以逐滴方式添加到每个培养皿的中心(每份稀释物感染两个孔)。然后将板在室温下孵育1小时。在培养期间，在37℃水浴中制备1％(w/v)lgt琼脂糖培养基。从每个孔中取出病毒接种物，并将2ml的1％(w/v)lgt琼脂糖培养基移液并覆盖到每个孔中。将板在室温下孵育约15分钟直到固化。然后，将每孔1ml昆虫细胞培养基添加到琼脂糖覆盖层的顶部，并在27℃下孵育5天。最后，去除液体覆盖层，向每个孔中加入1ml中性红(1:20加培养基)，在27℃孵育2至4小时。为了清除斑块，将培养皿在黑暗中以倒置的位置放置4小时。计算斑块数并计算病毒滴度。用移液管尖端拾取单个斑块，并将其溶解在200μl培养基中，在4℃下储存直到繁殖。
[0235]
5e2蛋白纯化
[0236]
离心300ml培养上清液，然后过滤。将过滤的上清液与ni琼脂糖凝胶excel珠孵育2小时以捕获靶蛋白。用缓冲液pbs(ph7.4)洗涤珠子，并且然后分别用含有20mm、50mm、80mm咪唑的缓冲液洗涤，最后用含有200mm咪唑和500mm咪唑的缓冲液洗脱。进行sds page和蛋白质印迹以检查靶蛋白的纯度和浓度。
[0237]
实施例1:diva位点的鉴定和引入
[0238]
所需新疫苗的核心特征是其区分接种动物与感染动物(diva)的能力。diva特性将是对传统csfv e2亚单位疫苗的重要改进，并且具有重要的技术优势。引入diva特征的策略是改变免疫显性e2蛋白表面中的一个或多个关键表位，并使用elisa来证明不存在识别野生型表位的抗体作为疫苗接种的指示(阴性diva)。
[0239]
为了实施该策略，本发明人选择了强中和的小鼠mab 6b8。产生单克隆抗体6b8的杂交瘤获自浙江大学，并于2018年6月13日以保藏号cctcc c2018120保藏在cctcc(中国典型培养物保藏中心，china center for type culture collection)(wuhan university,wuhan 430072,p.r.china)。单克隆抗体6b8的测序显示，它具有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中重链可变区(vh)具有如seq id no:9所示的的氨基酸序列，轻链可变区具有如seq id no:10所示的的氨基酸序列。该抗体的cdr可以通过本领域已知的各种方法，例如kabat方法容易地确定。例如，mab6b8包含seq id no:3所示的氨基酸序列的vh cdr1、seq id no:4所示的氨基酸序列的vh cdr2、seq id no:5所示的氨基酸序列的vh cdr3、seq id no:6所示的氨基酸序列的vl cdr1、seq id no:7所示的氨基酸序列的vl cdr2和seq id no:8所示的氨基酸序列的vl cdr3。
[0240]
1.6b8 mab的特征
[0241]
为了研究mab 6b8是否可用于大多数csfv，本发明人检测了mab 6b8与各种csf病毒的结合，例如来自第1组(包括石门株和c株)和来自组2(包括qz07和gd18)的csfv，其中两种bvdv作为对照。结果如图5所示。来自基因型组2的另外8个野外csfv分离株也被检测为6b8 mab阳性(数据未示出)。这些数据表明6b8识别存在于大多数csf病毒上的保守表位，而不与bvdv病毒反应。
[0242]
2.6b8结合关键氨基酸的鉴定
[0243]
在mab 6b8存在下，c株病毒在pk/wrl细胞培养物中连续传代后，出现逃逸突变体，并且可以在中和浓度的6b8抗体存在下生长。获得了4个这样的逃逸突变体克隆，并且它们都逃逸了6b8结合。对它们的e2基因进行了测序，测序结果表明两个密码子发生了两个核苷酸的突变(ggaggt至agagagat)。这些变化转化为在连续位置24和25的两个氨基酸突变(gly
‑
gly到arg
‑
asp，或gg到rd)。
[0244]
然后，用bvdv与其他瘟病毒e2进行e2序列比对(qz07、gd18、gd191和c株)，以确定6b8结合的其他潜在关键氨基酸(图6)。通过该方法，鉴定了另外的潜在关键氨基酸，例如位置14和位置22的氨基酸。
[0245]
将所有这些潜在突变(s14k、g22a、e24r/g25d)分别导入e2表达载体以检测其对6b8结合的影响。将e2基因克隆到pci
‑
neo
‑
tag载体(promega，cat#e1841)中以产生表达载体。在确认e2蛋白的正确表达之后，将所有突变引入e2表达载体中。然后在24孔板中使用lipofectamine3000(invitrogen，cat#l3000015)将这些载体转染到pk/wrl细胞中。转染后24小时，用4％甲醛固定细胞，然后用0.1％的triton x
‑
100处理。然后用mab 6b8或抗csfv的兔多克隆抗体(用作阳性对照以检测具有修饰的6b8表位的csfv)和相应的alexa488缀合的第二抗体(invitrogen cat#21206)在ifa(免疫荧光测定)检测中对细胞进行染色。如图7a所示，显微镜检查显示s14k、g22a、e24r/g25d突变对于消除6b8结合是关键的。
[0246]
本发明人还分别检测了位置14、22、24和25处的其它突变对与6b8抗体结合的影响。如图7b所示，突变s14q、s14r和g22r完全消除了6b8的结合，而g22e、g22q部分影响了6b8的结合，进一步表明位置14和22对于6b8的结合是关键的。如图7c所示，单个突变g24k(对于c株)完全消除了6b8的结合，还支持位置24对于6b8结合是关键的。单独g25s不能消除6b8的结合。然而，由于位置25gly至asp突变与位置24处的突变一起出现，因此这两个突变可被认为是一个突变(24/25突变)。
[0247]
结果表明，位置14、22、24和/或24/25的突变可用于diva。结果还表明，6b8表位的突变基本上不改变e2蛋白的总体免疫原性，因为突变的e2蛋白仍然可以被抗csfv的多克隆抗体识别。
[0248]
实施例2:杆状病毒表达系统构建
[0249]
通过将pvl1393
‑
qz07
‑
e2、qz07
‑
e2
‑
kard、qz07
‑
e2
‑
krd、c
‑
e2和c
‑
e2
‑
kard与杆状病毒基因组dna共转染sf9细胞，用市售试剂盒(sapphire杆状病毒dna和转染试剂盒:allele biotech cat#abp
‑
bvd
‑
100029)建立每个构建体的杆状病毒表达系统，并对含有每个e2表达盒的重组杆状病毒在sf9细胞系上进行斑块纯化。转染后的细胞在6孔板中培养，并在27℃下孵育5天。收集每个转染样品的上清液，并在4℃下储存，以进一步纯化斑块。
[0250]
然后，如方法中所述，对为每个构建体收集的上清液进行斑块纯化测定。在两轮纯化后，成功构建了具有每个e2表达盒的最终重组杆状病毒。
[0251]
实施例3:e2和e2
‑
kard或e2
‑
krd的表达和纯化的放大
[0252]
通过在moi 5感染sf 细胞系，扩增了具有qz07
‑
e2、qz07
‑
e2
‑
kard、qz07
‑
e2
‑
krd、c
‑
e2和c
‑
e2
‑
kard表达盒的重组杆状病毒。从每个感染的sf 细胞收集的300ml上清液用于如方法中所述的纯化。
[0253]
通过sds page和蛋白质印迹分析验证最终产物。纯化的e2在110kda的二聚体形式和55kda的单聚体形式处显示正确的分子量，如图3。
[0254]
进一步的dot blot分析显示纯化的qz07
‑
e2
‑
kard、qz07
‑
e2
‑
krd和c
‑
e2
‑
kard与6b8 mab没有反应(图4)，表明每种diva形式的e2都被成功纯化并且可以进一步用作亚单位疫苗。结果还表明，6b8表位的突变基本上不改变e2蛋白的总体免疫原性，因为突变的e2蛋白仍然可以被多种恢复期猪血清和c株疫苗接种的血清识别。
[0255]
实施例4:e2和e2
‑
kard的效力评估
[0256]
本示例的目的是评价候选亚单位疫苗在3周龄仔猪中的效力。
[0257]
对示例2中表达的佐剂化的c
‑
e2和c
‑
e2
‑
kard的两种ivp(研究用兽医产品)进行效力评价。
[0258]
简单地说，将20头3周龄仔猪(3周龄)分成4组(第1、2、3和4组)，分别使用第1组(c
‑
e2)和第2组(c
‑
e2
‑
kard)中的5头仔猪进行ivp检测，而第3组中的另外5头仔猪作为攻击对照。第4组中的其余5头仔猪作为严格(阴性)对照。在第0天，第1组和第2组中的动物分别用2ml seppic isa 206佐剂的c
‑
e2(54.2μg/ml)或c
‑
e2
‑
kard(55.2μg/ml)为每只小猪接种(im)。第3组在第0天用2ml pbs 佐剂(seppic isa 206)接种(im)，作为攻击对照。第1、2和3组中的动物在第21天接种csfv石门株(im)，剂量≥105mld/ml。所有仔猪在第0天是临床健康的，不含csfv和prrsv抗体，并且不含bvdv、prv等抗原。所有动物在免疫时都是健康的。
[0259]
从第21天到37天，每天收集直肠温度和临床观察。从第7天开始，每7天收集血清样品。在第21、24、28、31和37天(dpc 0、3、7、10、16)，收集所有动物的全血样品和鼻拭子样品。
[0260]
体温
[0261]
如图8所示，攻击对照组(第3组)的平均体温在攻击后波动很大，当猪濒死时体温下降。第1组和第2组的体温在攻击后的几天内(d2
‑
d4)升高，但很快下降到与严格对照组相似的水平。
[0262]
白细胞计数
[0263]
如图9所示，攻击对照组的白细胞计数在攻击后显著下降，而接种组动物的白细胞计数在攻击后略有下降，然后上升。
[0264]
死亡率
[0265]
如图10所示，攻击对照组(第3组)仔猪全部死亡；其他组没有仔猪死亡。
[0266]
临床观察
[0267]
临床观察包括评估活动性、身体张力(僵硬、痉挛)、体型(身体状况、肌肉变薄)、呼吸、行走、皮肤、结膜外观、食欲和排便，如表1所示。零表示没有临床症状，并且增加的临床评分表示临床症状的严重程度增加。如果个体动物表现出总临床分数高于2且连续3个观察点，则被认为是csf相关临床症状。
[0268]
表1临床评分指导
[0269][0270]
[0271]
如图11所示，攻击对照组(第3组)的平均临床评分在攻击后越来越高；在研究期间，第1组、第2组和第4组的平均临床评分均为0。
[0272]
病毒分离
[0273]
通过本领域的标准方法测定全血、鼻拭子和扁桃体样品中的病毒分离。结果示于下表2中。来自第1组和组第2组的所有样品均为来自所有收集样品的vi(病毒分离)阴性。
[0274]
表2
[0275][0276]
wb:全血ns:鼻拭子；*:第3组仔猪在dpc16前全部死亡。
[0277]
血清学反应
[0278]
使用idexx elisa(目录号99
‑
43220)检测样品的抗体滴度。如图12所示，两个ivp组的抗体滴度在d21时为阳性(>40％)。
[0279]
结论
[0280]
猪在接种两种ivp后均得到保护，死亡率和发病率均为0％。ivp组未检测到病毒血症或屏蔽，并且扁桃体组织未发现csfv阳性。两个ivp组在第21天血清均为阳性。diva突变(在6b8表位中)的引入对效力没有影响。
[0281]
实施例5:免疫荧光分析(ifa)用于确定6b8 mab与突变的6b8表位的结合
[0282]
6b8 mab与突变的6b8表位(检测样品)的结合通过免疫荧光测定法(ifa)根据以下步骤测定:
[0283]
1.在96孔微量滴定板中，用1.0
×
106sf9细胞/孔接种，然后用moi为0.01的以下重组杆状病毒感染，一式两份:
[0284]
(i)检测样品:表达具有修饰的6b8表位的e2蛋白的重组杆状病毒；
[0285]
(ii)阳性对照:表达带有野生型6b8表位的e2蛋白的重组杆状病毒；
[0286]
(iii)阴性对照:表达具有本文所述6b8表位内kard突变的e2蛋白的重组杆状病毒。
[0287]
将杆状病毒感染的细胞在27℃左右的培养箱中保存5天。
[0288]
2.丢弃培养基，并且用1xpbs(200至250μl/孔)冲洗细胞一次。
[0289]
3.每孔加入100μl的冷甲醇/丙酮(50:50)，并在室温下孵育10分钟。
[0290]
4.将固定剂丢弃到限定的废物容器中，并在通风橱下干燥板15
‑
30分钟。
[0291]
5.用含有5％bsa的pbs将6b8特异性mab(如保藏在cctcc的杂交瘤产生的抗体，登录号为cctcc c2018120)稀释至1:500至1:1000，然后以50μl/孔的速度添加到测定板上。将板盖上盖子，并且在37℃下孵育1
‑
2小时。
[0292]
6.用1x pbs(250μl/孔)冲洗分析板3次。
[0293]
7.二抗alexa488缀合驴抗小鼠抗体，特异性结合6b8抗体(invitrogen，cat#21202)，用含5％bsa的pbs稀释400倍，以50μl/孔的速度添加到测定板上。将板盖上盖
子，并且在37℃下孵育1小时。
[0294]
8.用1xpbs(250μl/孔)冲洗分析板3次。最后，添加1xpbs，100μl/孔。用倒置荧光显微镜读出最终荧光信号。
[0295]
在该ifa中(在两个重复中)检测样品的阴性结果表明e2蛋白的6b8表位内的一个或多个突变导致6b8单克隆抗体与这种突变的6b8表位的结合的特异性抑制。
[0296]
实施例6:用于确定6b8 mab与突变的6b8表位的结合的斑点印迹分析
[0297]
6b8 mab与突变的6b8表位(检测样品)的结合根据以下步骤通过斑点印迹测定来确定:
[0298]
1.将1
‑
5ug稀释在pbs中的每种纯化蛋白点样到nc膜(pall，cat#66485)上，在通风橱下风干30分钟或更长时间
[0299]
(i)检测样品:表达具有修饰的6b8表位的e2蛋白的重组杆状病毒；
[0300]
(ii)阳性对照:表达带有野生型6b8表位的e2蛋白的重组杆状病毒；
[0301]
2.在室温下用封闭溶液(pbst中5％脱脂乳)将膜封闭1小时。
[0302]
3.将6b8特异性mab(如保藏在cctcc的杂交瘤产生的抗体，保藏号为cctcc c2018120)用含有5％脱脂乳的pbst稀释至1:800至1:1000，然后将10ml/膜加入每个点状膜中。用盖子密封膜，并且在37℃下孵育1
‑
2小时。
[0303]
4.丢弃第一抗体并用3*pbst洗涤每个膜3次。
[0304]
5.将与6b8抗体特异性结合的第二抗体，hrp
‑
缀合的抗小鼠抗体(bio
‑
rad，star117p)，用含有5％脱脂乳的pbst以2000倍稀释，在每个点状膜中添加10ml/膜。用盖子密封膜，并且在37℃下孵育1小时。
[0305]
6.丢弃第二抗体并用3*pbst洗涤每个膜3次。
[0306]
在室温下用1
‑
5ml超级信号试剂盒(thermo，cat#34080)开发每个膜的7个印迹信号。
[0307]
8.显影时间为1
‑
10秒，并且照片采用chemdoc(bio
‑
rad)拍摄。
[0308]
在该斑点印迹中检测样品的阴性结果表明e2蛋白的6b8表位内的一个或多个突变导致6b8单克隆抗体与这种突变的6b8表位的结合的特异性抑制。