一种适用于链霉菌的强启动子及其应用的制作方法

1.本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，尤其涉及一种适用于链霉菌的强启动子及其应用。


背景技术：

2.启动子是位于基因转录单元上游的一段特殊dna序列，具有启动基因转录的功能，并在调控基因转录水平中发挥着重要的作用。代谢工程常常需要表达外源基因或者调控内源基因的表达，而启动子的选择对基因的表达调控至关重要。启动子影响基因的转录水平，影响人工合成途径或本源途径中各基因间协调性，继而影响菌株的代谢功能。为了提高目的物产量，代谢工程中常用的手段是利用强启动子过量表达合成代谢途径中关键酶的编码基因。根据启动子类型可分为两种，即诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子在诱导表达过程中需添加诱导剂，但诱导剂通常比较昂贵，不适于大规模生产，细胞对诱导剂感应存在非均一性，还可能对细胞具有一定的毒性。组成型启动子不需要诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程，且具有相对较高的安全性，因此更适合在实际生产中应用。
3.链霉菌，革兰氏阳性菌，属于细菌域(原核生物界)、厚壁菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、链霉菌亚目、链霉菌科。链霉菌具有广泛的代谢和生物转化能力，能够分解和利用土壤中的各种有机物质，在自然界的物质循环中起重要的作用，也是一种重要的工业微生物。约60％具有商业和医学用途的抗生素是由链霉菌产生的，抗肿瘤的博莱霉素、丝裂霉素，抗真菌的制霉菌素，抗结核的链霉素，用作抗螨虫剂的抗霉素a，能有效防治水稻纹枯的井冈霉素等，都是链霉菌的次生代谢产物。
4.链霉菌基因组最大特点之一是富含次生代谢基因簇和调控基因，链霉菌中某一特定次生代谢途径相关的基因通常以基因簇的形式存在线状染色体上。将整个或部分次生代谢生物合成基因转入与其产生菌不同源(即异源)的宿主菌中，使其功能得到表达并产生该次生代谢产物或其部分结构的过程，称为异源表达。常用的异源表达系统有白色链霉菌(streptomyces albus)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)等。这些菌株已广泛应用于链霉菌遗传工具的开发，具有良好的生长能力和产孢能力，具有相对清晰的代谢背景，有利于异源表达产物的鉴定。链霉菌基因组具有较高的cg含量和复杂的转录调控，链霉菌的启动子也表现为较大的异质性，即一般在其他微生物中可用的启动子往往在链霉菌中表现不出活性。由于链霉菌经常存在的跨种属间的异源表达，导致基因簇并不能在宿主中得到正常表达，通常的解决办法是在引入外源基因簇的同时引入相容的启动子以诱导其表达。在链霉菌异源表达生产活性产物的发展过程中，只有有限数量的工程化启动子可以得到广泛使用。目前应用最广泛的是组成型启动子ermep*和kasop*。利用启动子ermep*带动jadomycin生物合成基因簇表达是第一例使用异源启动子重构生物合成途径(zheng et al.,2007)。jadomycins产自streptomyces venezuelae isp5230，属于具有广
谱细胞毒性的聚酮衍生物angucycline类抗生素。原宿主在标准培养条件下只能产生极少量的jadomycins，而在异源菌株表达条件下产量达到84.3mg/l。在天蓝色链霉菌和白色链霉菌异源表达btm基因簇，产量非常低，分别是1μg/l和4μg/l，将天然的启动子更换为启动子ermep*后，产量增加了20倍(huo et al.,2012)。来自s.peucetius菌的hopene生物合成基因簇的四个基因(hopa，hopb，hopd和hope)在ermep*带动下，在委内瑞拉链霉菌中异源表达出hopene(ghimire etal.,2015)。启动子kasop*插入到combamide基因簇前，能够产生1.5
‑
3mg/l的combamide(liu etal.,2018)。以上例子说明在异源基因簇的成功表达中，选择合适的启动子至关重要。
5.链霉菌作为生物活性代谢产物的主要来源具有重要的开发潜力，在医疗和农业中得到了大力的开发和广泛的应用。其中，启动子被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，且启动子改造是优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。但直到目前为止人们熟知的可以应用于链霉菌的启动子非常少，就组成型启动子而言仅仅有ermep*、sf14p和kasop*，诱导型启动子也只有tipap和nitap。在如今合成生物学发展的前景下，对好的组成型启动子的需求变得非常迫切。
6.因此，本领域的技术人员致力于开发一种可以在多种模式链霉菌中高效工作的组成型强启动子，为现有的链霉菌启动子工程提供更多选择。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何改造或者获得启动子，从而开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径的技术。
8.为实现上述目的，本发明提供了一种可以在多种模式链霉菌中高效工作的组成型强启动子，该强启动子的核苷酸序列包括(a)、(b)或(c)序列，(a)序列如序列表seq id no:1所示；(b)序列为：与(a)序列具有75％以上一致性，且具有启动子功能的核苷酸序列；(c)序列为：在高严谨条件下与(a)序列或(b)序列杂交且具有启动子功能的核苷酸序列。
9.进一步地，(a)序列是以绒毛链霉菌(streptomycesflocculus)为模板，扩增获得；绒毛链霉菌包括绒毛链霉菌cgmcc 4.1223；扩增的引物对为引物stnk4p
‑
f和引物stnk4p
‑
r；引物stnk4p
‑
f的核苷酸序列如序列表seq id no:2所示；引物stnk4p
‑
r的核苷酸序列如序列表seq id no:3所示。
10.进一步地，绒毛链霉菌cgmcc 4.1223购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，从该菌分离、克隆得到组成型强启动子。
11.本发明还提供一种含有上述强启动子的质粒载体，该质粒载体为游离型载体或整合型载体，游离型载体为含有革兰氏阳性菌均可识别的复制子和orit基因的广泛宿主穿梭质粒载体；整合型载体为含噬菌体整合酶基因int位点和orit基因的广泛宿主穿梭质粒载体。
12.进一步地，游离型载体包括pjtu1278质粒载体，整合型载体包括pset152质粒载体。
13.本发明还提供一种含有上述质粒载体的宿主细胞，该宿主细胞为链霉菌，包括白色链霉菌(streptomyces albus)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)和委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)。
14.进一步地，定向进化和点突变的方法对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
15.进一步地，“同一性”本来指天然核酸序列相似性，在本发明中“同一性”指与本发明的启动子(a)序列，其核苷酸序列如序列表seq id no:1所示，具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高相似性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价；使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
16.本发明还提供上述的强启动子在启动目的基因表达的应用。
17.进一步地，上述强启动子在蛋白高表达和重要代谢物异源高产菌株中的应用。
18.进一步地，目的基因包括3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的生物合成基因；在3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的生物合成基因前面插入强启动子以启动3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的生物合成基因的表达。
19.本发明还提供上述质粒载体在启动目的基因表达的应用。
20.进一步地，包含上述强启动子的质粒载体在蛋白高表达和重要代谢物异源高产菌株中的应用。
21.进一步地，含有该质粒载体的转化子在蛋白高表达和重要代谢物异源高产菌株中的应用。
22.本发明还提供上述的宿主细胞在启动目的基因表达的应用。
23.进一步地，包含上述质粒载体的宿主细胞在蛋白高表达和重要代谢物异源高产菌株中的应用。
24.进一步地，发现可以在多种链霉菌模式链霉菌如中白色链霉菌(streptomyces albus)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)中高效表达的强启动子stnk4p，以xyle作为报告基因，stnk4p启动子活性在四种模式菌株中均高于ermep*和kasop*；在3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的生物合成基因前面插入启动子stnk4p，可实现3
‑
羟基邻氨基苯甲酸在异源表达模式菌株天蓝色链霉菌m1154中的大量表达。
25.在本发明的较佳实施方式中，详细说明强启动子stnk4p宿主适应性测试及其结果；
26.在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明含启动子质粒载体的构建方式；
27.在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明启动子stnk4p高产3
‑
羟基邻氨基苯甲酸菌株的构建。
28.在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明启动子stnk4p高产3
‑
羟基邻氨基苯甲酸菌株发酵产物的检测。
29.本发明提供一个强启动子，包含该强启动子的序列、质粒载体及其在链霉菌中的高产应用。以绒毛链霉菌(streptomycesflocculus)cgmcc 4.1223为模板，扩增获得了一个强启动子序列，以xyle为报告基因，对该启动子进行了评价。stnk4p启动子活性在四种模式菌株中均高于ermep*和kasop*。这个强启动子可以在多种模式链霉菌中如白色链霉菌
(streptomyces albus)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)中高效表达。在3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的生物合成基因前面插入启动子stnk4p，可实现3
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羟基邻氨基苯甲酸在异源表达模式菌株天蓝色链霉菌m1154中的大量表达。新表征的启动子为现有的链霉菌启动子工程提供了更多选择，提供建立基因高效表达工具的主要表达元件，对开发优化蛋白表达水平和代谢途径技术有重要意义。
30.以下将结合附图对本发明的构思、具体结果及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
31.图1是本发明的一个较佳实施例1的启动子在不同菌株中的表达效果图；
32.图2是本发明的一个较佳实施例2的质粒载体pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/stnm2/stnn/stnm3的图谱；
33.图3是本发明的一个较佳实施例4的启动子高产3
‑
羟基邻氨基苯甲酸定量分析图。
具体实施方式
34.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
35.本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
36.实施例1、强启动子stnk4p宿主适应性测试
37.以绒毛链霉菌(streptomycesflocculus)cgmcc 4.1223为模板，扩增获得了一个强启动子stnk4p，以xyle为报告基因，对该启动子进行了评价。这个强启动子可以应用于四种常用的链霉菌模式菌株。如图1所示，四种常用的链霉菌模式菌株分别为白色链霉菌(streptomyces albus)、变铅青链霉菌(streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)、委内瑞拉链霉菌(streptomyces venezuelae)，对照启动子为ermep*和kasop*，强启动子stnk4p在每一种常用的链霉菌模式菌株中，对报告基因xyle的表达都远远高于对照启动子ermep*和kasop*相应的表达量。
38.实施例2、含启动子质粒载体的构建
39.(1)以绒毛链霉菌(streptomycesflocculus)cgmcc 4.1223基因组为模板，利用引物对为stnk4p
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f和stnk4p
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r，引物stnk4p
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f的核苷酸序列如序列表seq id no:2所示；引物stnk4p
‑
r的核苷酸序列如序列表seq id no:3所示；使用高保真酶进行pcr扩增，得到启动子stnk4p片段，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的stnk4p片段。
40.(2)以绒毛链霉菌(streptomycesflocculus)cgmcc 4.1223基因组为模板，利用引物对3haa
‑
f和3haa
‑
r，引物3haa
‑
f的核苷酸序列如序列表seq id no:4所示；引物3haa
‑
r的核苷酸序列如序列表seq id no:5所示；使用高保真酶进行pcr扩增，得到stnm1/m2/n/m3基因片段，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的stnm1/m2/n/m3基因片段。
41.(3)用快切酶xbaⅰ和bamhⅰ酶切质粒pset152，得到线性化质粒pset152，经电泳验
证，电泳胶回收后，得到纯化的线性化载体pset152
42.(4)使用一步克隆试剂盒(诺唯赞，c113
‑
01)将上述纯化的stnk4p片段、stnm1/m2/n/m3片段和线性化载体pset152连接成一个重组质粒pset152
‑
stnk4p
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stnm1/stnm2/stnn/stnm3，其图谱如图2所示，碱基长度为11012bp。
43.(5)连接产物转化入大肠杆菌dh5α中，涂布于含有50mg/l阿泊拉霉素的lb固体平板中，37℃培养12
‑
16h后进行菌落pcr检测，送擎科生物测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为e.coli/pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3。用质粒试剂盒提取质粒pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3备用，质粒图谱如图2所示。启动子stnk4p的核苷酸序列如seq id no.1所示。
44.实施例3、启动子stnk4p高产3
‑
羟基邻氨基苯甲酸菌株的构建
45.(1)将重组质粒pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3转化入大肠杆菌et12567/puz8002中，涂布于含有50mg/l阿泊拉霉素、50mg/l卡那霉素和25mg/l氯霉素的lb固体平板中，挑取单克隆于含有50mg/l阿泊拉霉素、50mg/l卡那霉素和25mg/l氯霉素lb培养基中37℃培养7
‑
8h。将菌液离心，去上清，用适量的20％甘油将菌体重悬，保存至
‑
80℃冰箱备用。
46.(2)将大肠杆菌et12567/puz8002(含有重组质粒)接种到4ml含有50mg/l阿泊拉霉素、50mg/l卡那霉素和25mg/l氯霉素lb培养基中，37℃培养过夜。之后吸取50μl菌液加入5ml含有50mg/l阿泊拉霉素、50mg/l卡那霉素和25mg/l氯霉素lb培养基中，在37℃下培养，直到od600达到0.6。
47.(3)将天蓝色链霉菌m1154接种于yeme培养基中，30℃培养，直到对数生长期(约36h)。
48.(4)进行菌丝体接合转移：离心大肠杆菌和链霉菌培养物(4000rpm,10min)，去上清后获得菌体、分别用lb洗涤菌体3次。离心后分别用500ul的lb重悬菌体，混合均匀后涂布于添加有mgcl2(终浓度为10mm)的ms平板(平板中含有25ml培养基)，吹干后在30℃下培养。10h
‑
14h后，用含有阿泊拉霉素和三甲氧苄氨嘧啶的无菌水覆盖(900μl无菌水中加25μl的50mg/l阿泊拉霉素和50μl的100mg/l阿泊拉霉素)。覆盖后继续在30℃下培养，大约4
‑
5天，可以观察到长出的接合子。挑取长出的接合子，抽提基因组，进行pcr验证。得到阳性菌，命名为streptomyces coelicolor m1154/pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3。
49.实施例4、启动子stnk4p高产3
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羟基邻氨基苯甲酸菌株发酵产物的检测
50.启动子stnk4p高产3
‑
羟基邻氨基苯甲酸菌株采用液体发酵，种子培养基为yeme培养基。将获得产生菌的孢子转接到25ml的yeme培养基中，培养1
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2天，至菌丝体长到细腻粘稠状为佳。1％接种量接种500μl到50ml发酵培养基中，培养4
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5天。之后将发酵培养物离心，分离菌体和上清，上清直接用高效液相色谱检测产物。
51.分析检测用高效液相色谱色谱柱规格agilent
‑
c18，5um，150
×
4.6mm，检测流速为0.6ml/min，检测紫外波段为uv210，254，280，310及375。进样量为20μl，流动相采用a相含0.1％甲酸的超纯水；b相为100％乙腈。洗脱方法为：10％b相至70％相(线性梯度，0
‑
40min)，70％b相至100％b相(线性梯度，41
‑
45min),100％b(恒梯度45
‑
50min)。lc
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ms分析检测条件流速变为0.3ml/min，检测紫外波段不变，流动相以及进样量不变，洗脱方法不变。
52.如图3所示，其中a部分为反应原理示意图，stnm3同源于吩嗪生物合成基因dahp合酶phzc，在分支酸合成中催化莽草酸途径的第一步，stnm3负责提供充足的生物合成前体。
dahp转化为分支酸的酶由宿主的初级代谢酶承担这些生物合成步骤。stnm1同源于anthranilate synthase phze，负责催化分支酸催化为adic。stnm2属于isochorismatase phzd，负责水解adic生成丙酮酸和dhha。stnn生物信息学分析是2,3
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双羟基苯甲酸
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2,3
‑
脱氢酶。stnm1/m2/n/m3位于一个操纵子，它们是共转录的，共同负责了3
‑
羟基邻氨基苯甲酸的合成。其中b部分为高效液相色谱图，ⅰ为菌株streptomyces coelicolor m1154
‑
pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3，stnm1/m2/n/m3操纵子在启动子stnk4p带动下可以产生大量3haa；ⅱ为菌株streptomyces coelicolor m1154
‑
pset152
‑
stnm3p
‑
stnm1/m2/n/m3，stnm1/m2/n/m3操纵子在原始启动子带动下，在高效液相色谱级别无法检测到3haa的生产；ⅲ为菌株streptomyces coelicolor m1154
‑
pset152，为阴性对照菌株；ⅳ为化合物3haa标品对照。其中c部分是streptomyces coelicolor m1154/pset152
‑
stnk4p
‑
stnm1/m2/n/m3菌株发酵液上清3
‑
羟基邻氨基苯甲酸产量定量分析，菌株发酵时间5天比较合适。
53.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。