靶向PSGL-1蛋白的抗体及其用途的制作方法

靶向psgl
‑
1蛋白的抗体及其用途
技术领域
1.本技术涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种靶向psgl
‑
1蛋白的抗体及其用途。


背景技术：

2.p
‑
选择素(p
‑
selectin)为分子质量140kd的糖蛋白，存在于血管内皮细胞的weibe
‑
l palade小体膜及血小板α颗粒膜上。组织胺、凝血酶、佛波酯和钙离子载体的刺激可迅速上调质膜p
‑
选择素表达，缺氧/再氧化或氧自由基也可诱导其表达。p
‑
选择素和e
‑
选择素在正常生理条件下的血管内皮上的表达量较低且可低至零，而在炎症条件下则在几分钟内快速上调。
3.p
‑
选择素糖蛋白配体1(p selectin glycoprotein ligand 1，简称psgl
‑
1)也称为cd162，对应氨基酸为selplg，由两个120kd同源唾液酸化粘蛋白通过二硫键连接而成。psgl
‑
1亚基合成后全长 412个氨基酸，合成后切除1
‑
17信号肽(signal peptide)序列，再经过加工切除18
‑
41前肽(propeptide)序列，最终成为成熟蛋白。研究发现，psgl
‑
1能结合所有的选择素包括p
‑
选择素，e
‑
选择素(e
‑
selectin)以及l
‑
选择素(l
‑
selectin)招募趋化因子，激活整合素进而调控t细胞。psgl
‑
1亚基的糖基化复杂多样，须经唾液酸化，海藻糖基化，硫酸化修饰后才能与p
‑
选择素等呈ca2 依赖性结合。psgl
‑
1的n
‑
末端糖基化差异形成多种psgl
‑
1同工型，对l
‑
或e
‑
选择素表现出不同的亲和力。
4.psgl
‑
1作为一种细胞表面粘附分子，在嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，单核细胞，树突状细胞、 t及b淋巴细胞，及一些cd34 干细胞中表达，在分化早期的血小板表面也有丰富表达。psgl
‑
1表达量在炎症条件下快速升高，通过与血管内皮细胞表面的l
‑
/e
‑
选择素结合而诱导白细胞在血管内皮细胞上滚动和栓系，并介导白细胞渗入或转移入炎症组织中。由于psgl
‑
1介导白细胞在炎症部位的病理性募集，故psgl
‑
1抗体或阻遏物成为潜在的抗炎药物候选。
5.目前尚未见临床可用的psgl
‑
1抗体药物。正在临床ii期试验中针对psgl
‑
1的抗体药物： neihulizumab和selk
‑
2，所对应的适应症分别为i型糖尿病、移植物抗宿主病、银屑病、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎和静脉血栓栓塞、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、克罗恩病。这些病症全部都与psgl
‑
1 介导白细胞的血管内滚动或栓系及募集到炎症部位有关系。已在170例患者中验证了概念和安全性的临床证明，目前正在开展多剂量试验对其进行研究。
6.另外，通过靶向肿瘤相关巨噬细胞上高表达的粘附分子psgl
‑
1，三生制药与verseautherapeutics,inc联合开发的psgl
‑
1抗体
‑
vtx
‑
0811，可将巨噬细胞重新编程为促炎状态，激活t细胞并吸引其他免疫细胞协同产生强大的抗肿瘤效应。在对pd
‑
1有响应和无响应的肿瘤中，vtx
‑
0811 均表现出比当前免疫治疗更强的炎症反应。
7.因此，针对psgl
‑
1这一重要的靶点，亟待开发具有更强阻断效应，抑制炎症反应的候选抗体。


技术实现要素：

8.本说明书实施例提供一种靶向psgl
‑
1蛋白方法、装置、设备和计算机可读介质，以提供一种具有更强阻断效应，抑制炎症反应的候选抗体。
9.为解决上述技术问题，本说明书实施例是这样实现的：
10.本说明书实施例提供了一种靶向人psgl
‑
1的抗体，包含轻链和重链，其中：所述轻链包含seqid no:1的氨基酸序列，所述重链包含seq id no:5的氨基酸序列；或者，所述轻链包含seq id no:9 的氨基酸序列的，所述重链包含seq id no:13的氨基酸序列。
11.本说明书实施例提供了一种靶向人psgl
‑
1的抗体，包括包含轻链可变区的轻链和包含重链可变区的重链，其中：所述轻链可变区包含seq id no:2的cdr1，seq id no:3的cdr2和seq id no:4 的cdr3；且所述重链可变区包含seq id no:6的cdr1，seq id no:7的cdr2和seq id no:8的 cdr3；或者，包含轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含seq id no:10的cdr1，seq id no:11 的cdr2和seq id no:12的cdr3；且所述重链可变区包含seq id no:14的cdr1，seq id no:15 的cdr2和seq id no:16的cdr3。
12.可选地，所述抗体为全抗体或fab片段。
13.可选地，所述抗体为单克隆抗体。
14.可选地，所述抗体还包含igg1亚型的重链恒定区。
15.可选地，所述抗体还包含κ亚型的轻链恒定区。
16.在可选的实施例中，所述抗体可以抑制内皮细胞与白细胞的黏附。
17.在可选的实施例中，所述抗体阻断thp
‑
1细胞与重组人p
‑
选择素/cd62p fc嵌合体的结合。
18.本说明书实施例还提供了一种药物组合物，其包含一种靶向人psgl
‑
1的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。可选地，该靶向人psgl
‑
1的抗体具体包括：包含seq id no:1的氨基酸序列的轻链以及包含seq id no:5的氨基酸序列的重链；或者，包含seq id no:9的氨基酸序列的轻链以及包含seq id no:13的氨基酸序列的重链。可选地，该靶向人psgl
‑
1的抗体具体包括：包含 seq id no:2的cdr1，seq id no:3的cdr2和seq id no:4的cdr3的轻链可变区以及包含seqid no:6的cdr1，seq id no:7的cdr2和seq id no:8的cdr3的重链可变区；或者，包含seqid no:10的cdr1，seq id no:11的cdr2和seq id no:12的cdr3的轻链可变区以及包含seq idno:14的cdr1，seq id no:15的cdr2和seq id no:16的cdr3的重链可变区。
19.本说明书实施例还提供了一种多核苷酸，其编码如本说明书实施例提供的一种靶向人psgl
‑
1的抗体或抗原结合部分。
20.本说明书实施例还提供了一种载体，其包含前述用于编码编码如本说明书实施例提供的一种靶向人psgl
‑
1的抗体或抗原结合部分的多核苷酸。
21.在本说明书的实施例中，提供了前述抗体或相应的药物组合物在用于治疗或防治炎性疾病的药物中的用途。
22.可选地，所述炎性疾病可以包括葡聚糖硫酸钠诱导的慢性结肠炎。具体地，所述治疗或防治可以包括：缓解结肠炎临床症状、减轻结肠受累程度、抑制炎症浸润、缓解水肿、减少表面坏死。
23.可选地，所述炎性疾病可以包括雨蛙肽诱导的急性胰腺炎。具体地，所述治疗或防
治可以包括：抑制炎症浸润、改善胰腺间质水肿、减少腺泡细胞坏死。
24.本说明书一个实施例至少能够达到以下有益效果：所提供的靶向psgl
‑
1的抗体，能够以高亲和力结合psgl
‑
1蛋白，从而发挥抑制炎症的作用，以用于预防或治疗炎症。
25.除非另外指明，本技术的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
26.除非另外指明，本技术中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
27.在本领域中，人psgl
‑
1还可被称为选择素p配体、selpg、cla、cd162或psgl1。
28.如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中不同组别小鼠的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多不同组别小鼠聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还涵盖包含其片段的多肽(诸如fab、fab’、f(ab’)2、fv)；单链可变片段(scfv)，单链双抗体(scdb)，串联单链可变片段(scfv)单元(串联scfv称为tafv)以及其突变体或其它构型、包含抗体部分的融合蛋白、包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。
29.通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(vh)和恒定区(ch)。每个轻链含有轻链变异区(vl)和恒定区(cl)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如igd、 ige、igg、iga或igm(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：iga、 igd、ige、igg及igm，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如igg1、igg2、 igg3、igg4、iga1及iga2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
30.如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(vh)、轻链变异区(vl)或上述两者。vh和vl中的每个通常含有三个互补决定区cdr1、cdr2及cdr3。本领域技术人员公知，互补决定区(cdr，通常有 cdr1、cdr2及cdr3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。vh或vl的cdr序列有两种常见的定义方式，即chothia定义和kabat定义。对于给定抗体的可变区序列，可以根据 chothia定义或者kabat定义来确定vh和vl序列中的cdr序列。对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列的中cdr序列。
31.在本文描述抗体结构时，涉及氨基酸位置编号的描述参照人igg1抗体的eunum be ring定义，这是本领域技术人员公知且容易查询到的。
32.如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
33.如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”表示抗体的从基本上同质的抗体群获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
34.如本文所用，“嵌合抗体”是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分和来自第二物种的恒定区的抗体。完整的嵌合抗体包含两个拷贝的嵌合轻链和两个拷贝的嵌合重链。嵌合抗体的产生是本领域已知的。通常，在这些嵌合抗体中，轻和重链两者的可变区模拟来源于一个哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一物种的抗体中的序列同源。此类嵌合形式的一个明显优势是例如，可以使用来自非人宿主生物体的易于获得的杂交瘤或b细胞与来源于例如人细胞制剂的恒定区组合从目前已知的来源方便地衍生可变区。虽然可变区具有易于制备的优势并且特异性不受其来源的影响，但是当注入抗体时，相较于来源于非人来源的恒定区，来自人的恒定区不太可能引发人受试者的免疫响应。然而，该定义不限于该特定实例。在一些实施方案中，在可变和/或恒定区中进行氨基酸修饰。
35.如本文所用，“人源化抗体”是指作为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如抗体的fv、fab、fab’、f(ab’)2或其它抗原结合子序列)的非人(如，鼠)抗体的形式，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(cdr)的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)的cdr(供体抗体)的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含既不在接受者抗体中也不在导入的cdr或框架序列中存在、但包括在内以进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体将基本上包含至少一个且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的fr 区，并且全部或基本上全部的fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区或结构域(如，fc结构域)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。
36.如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna 和/或rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过dna或rna聚合酶掺入聚合物中的任何基质(substrate)。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及它们的类似物。
37.如本文所用，“载体”意指能够在宿主细胞中递送并且理想地表达一种或多种目的基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的dna或rna表达载体、囊封于脂质体中的dna或rna表达载体和某些真核细胞诸如生产细胞。
38.如本文所用术语“炎性疾病”是指炎症作为其主要破坏因子的疾病的统称。炎症为组织对有害刺激的生物反应，其是一种病变，并且伴随有组织退化、循环紊乱和液体渗出三种事件，以及肥大。炎性疾病的实例包括急性和慢性疾病，包括但不限于过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
附图说明
39.为了更清楚地说明本说明书实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1示出了流式细胞分选仪对抗原特异性的记忆b细胞的分选结果；
41.图2示出了细胞培养上清的elisa检测结果；
42.图3示出了本说明书实施例使用的真核表达载体；
43.图4a示出了内皮细胞与白细胞的黏附情况的荧光显微镜观察结果；图4b和图4c示出了反映各组thp
‑
1细胞与重组人p
‑
选择素/cd62p fc嵌合体结合情况的流式细胞仪检测结果；
44.图5a至5d示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的疾病活动指数分析结果；图5e和5f示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的结肠缩短和充血情况；
45.图6a示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的全血细胞的流式细胞仪分析结果、中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比分析结果；图6b示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的结肠组织的染色结果；图6c示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠血浆及结肠组织中mpo活性检测结果；图6d示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠血浆中的炎性细胞因子水平分析结果；
46.图7a示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠胰腺组织的染色结果；图7b中示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠血浆淀粉酶水平分析结果；图7c示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠血浆中炎性细胞因子分析结果；图7d示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠全血细胞中中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比分析结果；
47.图8a示出了不同组别小鼠各器官的染色切片；图8b示出了不同组别小鼠的心脏毒性试验、肝功能试验和肾功能试验的分析结果图。
48.序列说明：
49.seq id no：1抗体rh001
‑
6的轻链可变区(vl)的氨基酸序列；
50.seq id no：2
‑
4抗体rh001
‑
6的vl cdr1至cdr3的氨基酸序列；
51.seq id no：5抗体rh001
‑
6的重链可变区(vh)的氨基酸序列；
52.seq id no：6
‑
8抗体rh001
‑
6的vh cdr1至cdr3的氨基酸序列；
53.seq id no：9抗体rh001
‑
22的轻链可变区(vl)的氨基酸序列；
54.seq id no：10
‑
12抗体rh001
‑
22的vl cdr1至cdr3的氨基酸序列；
55.seq id no：13抗体rh001
‑
22的重链可变区(vh)的氨基酸序列；
56.seq id no：14
‑
16抗体rh001
‑
22的vh cdr1至cdr3的氨基酸序列。
具体实施方式
57.在本说明书的实施例中，设计不同种psgl
‑
1的抗原疫苗免疫接种恒河猴，免疫三次，在免疫第三针后2周，抗原特异性记忆b细胞丰度较高。然后用psgl
‑
1特异性的抗原钓取记忆b细胞，进行体外培养，在cd40l、白介素2(il2)、白介素21(il21)作用下，体外培养2周，记忆b细胞将增殖分化成浆细胞分泌抗体。然后利用elisa检测上清中抗体特异性，后续再进行抗体基因克隆，获得新型的靶向psgl
‑
1的猴源单克隆抗体。最后，可以进行获得的新型抗体(例如，抗体rh001
‑
6 与rh001
‑
22)的表达纯化。并且，可以通过体内及体外实验，来鉴
定新获得的靶向psgl
‑
1的抗体(例如，rh001
‑
6与rh001
‑
22)的生物学功能。
58.基于本说明书实施例的方案，所获产品主要有效成分是猴源单克隆抗体，分子量150kd，溶剂为pbs，ph7.4，>95％纯度。所获单克隆抗体的基本结构是由四肽链组成的，即，由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成，其中，轻链为kappa(κ)亚型，重链为γ链(即igg亚型)。
59.本发明实施例所提供的靶向psgl
‑
1的抗体，能够以高亲和力与psgl
‑
1蛋白结合，发挥抑制炎症的作用，可以用于预防或治疗炎症，具有广阔的应用前景。
60.下面通过具体实施例详细说明。
61.实施例一：猴记忆b细胞体外培养以及抗体基因克隆构建
62.1.1猴记忆b细胞体外培养
63.1.1.1准备饲养细胞
64.从液氮中复苏人工构建的过表达人cd40l与il21的nih/3t3细胞系，传代至5代左右保持好的细胞状态，细胞密度80％。弃去培养基，换成含有50μg/ml丝裂霉素的完全培养基，放在37℃培养箱2个小时。弃去培养液，用dmem培养基洗7遍，用pbs洗3遍，将丝裂霉素完全洗除。再用胰酶消化细胞，吹散，离心，将细胞重悬在3t3培养基中，进行细胞计数。
65.1.1.2配制b细胞培养基
66.取45ml imdm培养基加5mlfbs、100μl复合抗生素mycozap plus
‑
pr、il
‑
2(终浓度100 u/ml)以及il
‑
21(终浓度100ng/ml)。
67.1.1.3用b细胞培养基重悬3t3细胞，取200μl加入96
‑
孔u底培养板(50000细胞/孔)。
68.1.1.4次日，抽取10ml至20ml新猴血液分离pbmc，采用流式细胞分选仪，分选抗原特异性的记忆b细胞(cd3
‑
cd14
‑
cd20 cd27 igg )，分到每孔5个细胞。如图1，示出了流式细胞分选仪对抗原特异性的记忆b细胞的分选结果。
69.1.1.5将含有b细胞和饲养细胞的96
‑
孔板放在37℃，8％二氧化碳培养箱中培养14天。
70.1.1.6培养两周后取50μl细胞培养上清进行elisa检测抗体特异性。
71.1.2elisa筛选与抗原hpsgl
‑1‑
ecd结合的克隆上清
72.将hpsgl
‑1‑
ecd抗原蛋白1μg/ml、100μl/孔包被过夜4℃；弃去液体，pbst洗2遍，200μl/ 孔；5％脱脂牛奶200μl/孔，常温封闭2小时；弃去液体，pbst洗2遍；加入50μl或100μlb细胞培养上清，室温孵育2小时；弃去液体，pbst洗4遍；每孔加入100μl的hrp标记山羊抗人fab 抗体作为第二抗体，1：1000至1：3000稀释，常温孵育1小时；弃去液体，pbst洗4遍；每孔加入100μl的tmb显色液避光孵育2至5分钟；加入50μl终止液(2n稀硫酸)，读取od450值。
73.图2示出了细胞培养上清的elisa检测结果。如图2所示，将高于本底值2倍以上的确定为阳性，合计筛选可以到10个阳性克隆。
74.1.3体外培养后混合b细胞抗体基因克隆
75.1.3.1弃去b细胞培养上清，加入200μl trizol室温裂解10分钟，提取rna。
76.1.3.2提取的rna进行反转录cdna合成。表1示出了，rna进行反转录cdna合成的反应体系。
77.表1 cdna合成反应体系
[0078][0079][0080]
1.4巢式pcr扩增抗体基因重链、轻链可变区
[0081]
1.4.1材料和方法
[0082]
第一轮pcr的引物，完全按照文献序列(文献参考：weixu meng,leike li,wei xiong,et al.(2015)efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody secreting cells,mabs,7:4,707
‑
718,doi: 10.1080/19420862.2015.1051440)，第二轮pcr的引物，在文献序列的5’端加上15bp克隆载体同源序列。每条序列配制成100μmol浓度，将不同亚型的基因序列引物等体积混合在一起，使每条引物终浓度为10μmol。dna聚合酶使用rrimestar gxl dna聚合酶。巢式pcr体系如下表2至表5：
[0083]
表2第一轮pcr反应体系
[0084][0085]
表3第一轮pcr反应条件
[0086][0087][0088]
表4第二轮pcr反应体系
[0089][0090]
表5第二轮pcr反应体系
[0091][0092]
1.4.2结果
[0093]
巢式pcr产物用2％的琼脂糖电泳鉴定，重链可变区大小约为400bp，轻链为350bp。将阳性 pcr目标条带切割，利用胶回收试剂盒回收抗体基因片段，利用同源重组试剂盒克隆抗体基因。分别构建至含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒cloning vector abvec
‑
higkappa或cloningvector abvec
‑
higg1，组成完整的抗体轻、重链全长基因，例如，包含编码seq id no：1，5，9，13 所示的可变区的抗体重链和轻链氨基酸序列。图3示出了本说明书实施例使用的真核表达载体。
[0094]
将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌top10中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒提取抗体轻重链质粒，以供测序以及真核表达使用。
[0095]
提取质粒进行二代测序。经过分可知为全新的抗体序列。
[0096]
实施例二：全长抗体的表达和纯化
[0097]
在本实施例中，将实施例一中获得的2个对结合hpsgl
‑1‑
ecd阻断活性较好的fab抗体构建为人igg1亚型，其中轻链均为κ型，抗体类型为全人抗体。
[0098]
通过expi293瞬转表达系统表达候选抗体rh001
‑
6与rh001
‑
22。具体方法如下：在250ml培养摇瓶中培养expi293细胞转染当天，确认细胞密度为7
×
106个活细胞/ml左右，细胞存活率>98％，采用37℃预温的expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为6
×
106个细胞/ml(终体积75ml)。取 4℃预冷的1ml expi293
tm
表达培养基稀释目的质粒(50μg)，同时，用1ml expi293
tm
表达培养基稀释转染试剂75μl fectopro，再将两者1ml等体积混合并轻轻混匀制备成expi293
tm
表达培养基/质粒dna混合液，室温孵育15分钟，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，置于细胞培养摇床中，在37℃， 5％co2条件下培养。在转染后24小时，添加fectopro booster至培养体系内(终浓度为0.6μl/ml)，继续置于37℃摇床和5％co2条件下培养。在转染后的第5天，缓慢添加相同体积的expi293
tm
表达培养基至培养体系内，在转染10天后收集细胞培养上清于4000g离心10分钟后，用protein g琼脂糖柱子进行亲和纯化，用100mm乙酸钠(ph3.0)洗脱目的蛋白，用1m tris
‑
hcl中和后，通过 30kd的超滤浓缩管将所得蛋白置换至pbs缓冲液中。
[0099]
经测定，两个候选抗体rh001
‑
6与rh001
‑
22的相对分子量为150kd，纯度均大于90％。具体地，用超微量分光光度计测定纯化抗体的蛋白浓度，将经测定的a280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为抗体浓度值。然后，将候选抗体分装并保存于
‑
80℃。
[0100]
实施例三：靶向psgl
‑
1的抗体rh001
‑
6与rh001
‑
22介导的内皮细胞及白细胞黏附能力检测
[0101]
3.1荧光显微镜观察rh001
‑
6与rh001
‑
22抗体抑制内皮细胞与白细胞的黏附
[0102]
3.1.1内皮细胞培养：取生长状态良好的人脐静脉内皮细胞huvec细胞，选用ecm培养基于 37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养。
[0103]
3.1.2取96
‑
孔细胞培养板，用ecm培养基重悬huvec细胞(1
×
105/ml)，每孔加入huvec 细胞100μl。
[0104]
3.1.3次日早上，分别将1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml的rh001
‑
6及rh001
‑
22抗体加入到huvec 细胞中，培养48小时。
[0105]
3.1.4准备人外周血单核细胞thp
‑
1细胞，thp
‑
1细胞培养于含有10％fbs 1％p/s的rpmi
‑
1640 培养基中，培养环境为37℃，5％co2。取生长状态良好的thp
‑
1细胞，白细胞浓度调整为1
×
109/ml，使用bcec
‑
f
‑
am对thp
‑
1细胞进行染色30分钟，随后使用1mlpbs清洗两遍，1000rpm，4℃，离心5分钟，最后用pbs重悬thp
‑
1细胞。
[0106]
3.1.5将染色完成的thp
‑
1细胞与处理完成的内皮细胞一起置于37℃，5％co2的细胞培养箱中共孵育1小时。随后使用pbs清洗三遍，去除未黏附的细胞。使用荧光显微镜观察内皮细胞与白细胞的黏附情况。
[0107]
如图4a，示出了内皮细胞与白细胞的黏附情况的荧光显微镜观察结果。结果显示，与阳性对照相比，rh001
‑
6及rh001
‑
22抗体处理后，显著降低了发荧光细胞的数目，即，rh001
‑
6及rh001
‑
22 抗体能够显著抑制内皮细胞与白细胞的黏附能力，并且具有明显的浓度依赖效应。
[0108]
3.2rh001
‑
6与rh001
‑
22抗体阻断thp
‑
1细胞与重组人p
‑
选择素/cd62p fc嵌合体
(recombinant human p
‑
selectin/cd62p fc chimera)的结合能力
[0109]
3.2.1将用hbss重悬的thp
‑
1细胞，分别加入流式管中(100μl/管)。
[0110]
3.2.2封闭外周血单个核细胞fc段抗原：向thp
‑
1悬液中加入纯化的鼠抗人cd16/cd32(鼠bdfc block试剂)室温孵育30分钟。
[0111]
3.2.31ml pbs终止抗原
‑
抗体结合反应，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清洗去多余抗体；重复洗涤一次，洗去残存抗体。
[0112]
3.2.4100μl pbs重悬thp
‑
1细胞后，将细胞分为四组：空白对照组，重组人p
‑
选择素/cd62p fc 嵌合体处理组，重组人p
‑
选择素/cd62p fc嵌合体加不同浓度的rh001
‑
6及rh001
‑
22抗体组。各处理组室温环境下共孵育30分钟。
[0113]
3.2.51ml pbs终止抗原
‑
抗体结合反应，4℃，2000rpm离心5分钟，弃上清洗去多余抗体；重复洗涤一次，洗去残存抗体。
[0114]
3.2.6100μl pbs重悬thp
‑
1细胞后加入荧光抗体(cd45 apc.cy7和cd62p bv605)，轻轻混匀避光室温孵育30分钟。
[0115]
3.2.7加入1ml pbs终止抗原
‑
抗体结合反应，洗去多余的抗体，4℃，2000rpm离心5分钟，重复洗涤一次。
[0116]
3.2.8加入200μl pbs重悬，流式细胞仪上机检测，用fcs express 6 flow research edition进行数据统计，统计各组cd62p cd45 /总cd45 细胞的百分比。
[0117]
如图4b和图4c，示出了反映各组thp
‑
1细胞与重组人p
‑
选择素/cd62p fc嵌合体结合情况的流式细胞仪检测结果。结果显示，在rh001
‑
6抗体10μg/ml的浓度时，cd62p cd45 /总cd45 细胞有近2倍的下降；在rh001
‑
22抗体10μg/ml的浓度时，cd62p cd45 /总cd45 细胞也有近1.5倍的减少。由此表明，rh001
‑
6和rh001
‑
22这两种抗体都能够阻断thp
‑
1细胞与重组人p
‑
选择素/cd62pfc嵌合体的结合能力，并且具有浓度依赖性效应。
[0118]
实施例四：抗体rh001
‑
6治疗显著改善葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的慢性结肠炎(ibd)
[0119]
4.1葡聚糖硫酸钠诱导小鼠慢性结肠炎模型的建立
[0120]
在本实施例中，雌性balb/c小鼠(6
‑
8周龄)被随机分成五组(每组5只)，称重并标记不同组别小鼠，置于12小时的光/暗循环环境中，并被允许随意获取标准食物和水。给予小鼠2％的dss水溶液7天，随后给予1％的dss水溶液10天，再给予2％的dss水溶液7天，对照组小鼠饮用正常水。
[0121]
从dss给药的第一天开始，每三天记录一次疾病活动指数(dai)：包括动物的体重、粪便稠度 /腹泻，以及利用粪便隐血检测试剂盒检测结肠出血。根据对疾病进行评分的临床参数dai：体重下降百分比10％
‑
20％、便溏/腹泻和出现隐性/大出血，判断ibd模型构建是否成功。
[0122]
4.2rh001
‑
6抗体显著缓解小鼠结肠炎症状
[0123]
为了验证rh001
‑
6抗体能否缓解结肠炎相关炎症症状，小鼠诱导ibd模型成功后，将小鼠分为对照组、dss组、给予ibd阳性治疗药物6
‑
硫鸟嘌呤2mg/kg的dss 6
‑
tg组(6
‑
tg做为一种免疫抑制药物，已经被证实可以用做慢性结肠炎的阳性治疗药物)、抗hpsgl抗体(rh001
‑
6)1mg/kg剂量组(即dss 1mg/kg rh001
‑
6组)和抗hpsgl抗体(rh001
‑
6)10mg/kg剂量组(即dss 10mg/kgrh001
‑
6组)。通过尾静脉注射给药，每三天给一次，共给药三次。开始
治疗前和治疗结束前每天对动物进行称重。每天检查动物粪便的稠度和粪便中是否有血液。
[0124]
如图5a至5d，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的疾病活动指数分析结果。结果显示，dss诱导组小鼠出现明显的体重下降、腹泻及结肠出血，dai评分高达4分，而给予6
‑
tg 及10mg/kg rh001
‑
6治疗后，dai评分明显降低，小鼠结肠炎临床症状得到明显缓解。
[0125]
4.3rh001
‑
6抗体可有效减轻小鼠结肠受累程度
[0126]
在治疗结束时，使用三溴乙烷深度麻醉处死动物。解剖结肠，从盲肠到肛门取出整个结肠，作为炎症的间接标志进行测量。
[0127]
如图5e和5f，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的结肠缩短和充血情况。结果显示，dss诱导后小鼠结肠明显缩短且出现充血肿胀，6
‑
tg治疗组小鼠结肠未见明显缩短且充血肿胀明显减弱，1mg/kg rh001
‑
6治疗组小鼠结肠见明显缩短，结肠充血有减弱的现象，10mg/kgrh001
‑
6治疗组小鼠结肠未见明显缩短且充血肿胀明显减弱，10mg/kg rh001
‑
6可有效减轻小鼠结肠受累程度。
[0128]
4.4rh001
‑
6抗体治疗后可显著降低中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比
[0129]
采集小鼠外周血，取血样用1
×
bd facs裂解液裂解，并在冰上黑暗中用fitc
‑
、apc
‑
、percpcy5.5
‑
和apc.cy7
‑
结合abs染色ly6c、ly6g、cd11b、cd45和同型匹配对照，荧光标记抗体染色30分钟，以鉴定不同组别全血细胞中的中性粒细胞及单核细胞占白细胞的百分比。标记和固定的样品立即或在24小时内通过流式细胞仪在facscanto iii系统上进行分析。在每次运行之前，bd血细胞计数器设置和跟踪珠用于内部校准。为每个样品准备适当的质控品，以补偿和检测非特异性结合。细胞荧光被量化为每个时间点的平均荧光强度或双阳性细胞的百分比。
[0130]
如图6a，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的全血细胞的流式细胞仪分析结果、中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比分析结果。结果显示，dss诱导后小鼠全血细胞中中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比明显升高，给予6
‑
tg及10mg/kg rh001
‑
6治疗后中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比显著降低。
[0131]
4.5rh001
‑
6抗体治疗可减少小鼠结肠组织的炎性细胞浸润
[0132]
将最远端结肠的0.3
‑
0.5厘米的两个部分进行横向切开和纵向切开并固定在10％中性缓冲福尔马林中。将结肠的剩余部分纵向切开，取出远端部分的内容物并在干冰上冷冻。用刮铲刮取远端结肠的粘液，放入100μl tris缓冲液(50mm tris，5mm乙二胺四乙酸，50mm氯化钠，ph8)中，在干冰上冷冻。冷冻的结肠样品储存在
‑
80℃下，直到用于进一步的实验。
[0133]
固定的组织样品在乙醇、异丙醇和二甲苯中脱水，并包埋在石蜡中。使用旋转式切片机将组织切割成大约5μm的厚度，并用苏木精和曙红染色(h&e)。图像取自选定的样本，并使用图像扫描仪数字化。根据染色切片，对炎症、水肿和表面坏死的程度以及粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞向组织的浸润进行评估。
[0134]
如图6b，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠的结肠组织的染色结果。结果显示，dss诱导后小鼠结肠组织出现明显的炎性细胞浸润、隐窝变形、上皮大部分被破坏，给予6
‑
tg 及10mg/kg rh001
‑
6治疗后小鼠结肠组织的炎性细胞浸润明显减少，上
皮及隐窝均完整有序。
[0135]
中性粒细胞髓过氧化物酶(mpo)及单核细胞/巨噬细胞(f4/80)表达水平检测：白细胞浸润，尤其是中性粒细胞和巨噬细胞，是导致ibd发生发展的重要过程。因此本实例使用免疫组织化学方法检测了不同组别小鼠结肠组织中白细胞的浸润。将石蜡包埋组织在二甲苯中脱蜡(两次，每次5 分钟)，在100％、95％和70％乙醇中再水合(各5分钟)，并在室温下用2％的正常山羊血清在tpbs 牛血清白蛋白中封闭30分钟。然后将它们与抗体mpo、f4/80以1:200稀释，在4℃过夜。切片用 pbs洗涤，接着使用通用二步法检测试剂盒检测。dab显色完成后进行苏木素染色，所有染色完成后进行脱水及封片。最后使用荧光显微镜捕捉和处理数字图像。
[0136]
如图6b，结果显示，dss诱导组小鼠的mpo阳性和f4/80阳性的白细胞浸润明显对照组多，给予6
‑
tg及10mg/kg rh001
‑
6治疗后白细胞浸润明显减少。
[0137]
4.6rh001
‑
6抗体治疗mpo活性明显降低
[0138]
血浆及结肠组织中mpo活性检测：全血经4000rpm，离心30分钟后获得血浆，从对照、dss 处理或治疗组的动物中获得组织样品包括从结肠中部到远端的组织样本(与用于组织学的组织相邻)，存放在
‑
80℃备用。mpo活性检测使用小鼠髓过氧化物酶酶联免疫试剂盒(mpo)进行。
[0139]
如图6c，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠血浆及结肠组织中mpo活性检测结果。结果显示，dss诱导组血浆及结肠组织中的mpo活性明显升高，6
‑
tg及10mg/kg rh001
‑
6 治疗组mpo活性相比dss组都有超过2倍的下降。
[0140]
4.7rh001
‑
6抗体减少th1和th17细胞因子的产生
[0141]
采用酶联免疫吸附试验检测血浆中的炎性细胞因子干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)和白介素
‑
6(il
‑
6)的水平。分别用小鼠ifn
‑
γ酶联免疫吸附试验试剂盒、小鼠tnf
‑
α酶联免疫吸附试验试剂盒和小鼠白介素
‑
6β酶联免疫吸附试验试剂盒进行检测。简而言之，将血清加入到涂有ifn
‑
γ、 tnf
‑
α或il
‑
6单克隆抗体的96孔板孔中，在37℃孵育2小时，用洗涤液洗涤4次，每次3分钟，然后在暗室中用辣根过氧化物酶连接的链霉亲和素溶液在37℃孵育30分钟。所有样品测试三次，用酶标仪在450nm处测量吸光度。
[0142]
如图6d，示出了dss诱导小鼠慢性结肠炎模型中不同组别小鼠血浆中的炎性细胞因子水平分析结果。结果显示dss诱导组th1(ifn
‑
γ和tnf
‑
α)和th17(il
‑
6)细胞因子的产生显著增加，6
‑
tg 及10mg/kg rh001
‑
6治疗组可减轻dss结肠炎，减少th1和th17细胞因子的产生。
[0143]
实施例五：抗体rh001
‑
6治疗显著改善雨蛙肽诱导的急性胰腺炎(ap)
[0144]
4.1雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型的建立
[0145]
在本实施例中，选择20只健康雄性balb/c小鼠(6
‑
8周龄)，体质量20
‑
25g，5只/盒分配于spf 级屏障系统中，温度(22
±
2)℃，湿度50％～60％，12h循环照明，小鼠自由摄取食、水。
[0146]
采用雨蛙肽腹腔注射诱导急性胰腺炎(ap)模型，用50μg.kg
‑1.h
‑1的诱导剂量，每隔1小时注射 1次，共注射7次。距离第一次注射24小时处死小鼠。在实验结束后，称取小鼠体质量，用三溴乙烷腹腔注射麻醉，仰卧位置于动物实验台上，固定四肢，脱毛后暴漏胸腹部，采用下腔静脉采血方法。室温静置30分钟后，3,000rpm，4℃离心15分钟，分离血清，测定
淀粉酶水平。解剖小鼠腹腔，取胰腺组织，滤纸吸干后称质量，其中一块进行he染色。其余胰腺组织分装于1.5ml离心管中，
‑
80℃低温保存。
[0147]
小鼠诱导ap模型成功后，将小鼠随机分为对照组、ap组、抗hpsgl抗体(rh001
‑
6)1mg/kg 剂量组(即ap 1mg/kg rh001
‑
6组)和抗hpsgl抗体(rh001
‑
6)10mg/kg剂量组(即ap 10mg/kgrh001
‑
6组)。通过尾静脉注射给药，雨蛙肽注射第一针后1小时开始给药，每3小时给一次，共给药三次。
[0148]
4.2rh001
‑
6抗体显著缓解小鼠胰腺炎的炎症反应和腺泡损伤
[0149]
在治疗结束时，使用三溴乙烷深度麻醉处死动物。解剖小鼠腹腔，取胰腺组织，滤纸吸干后称质量，并固定在10％中性缓冲福尔马林中，固定的组织样品包埋在石蜡中，并用苏木精和曙红染色(h&e)。
[0150]
如图7a，示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠胰腺组织的染色结果。结果显示，雨蛙肽诱导后小鼠胰腺组织结构破坏，组织中出现明显的水肿和白细胞浸润，腺泡细胞广泛坏死，而给予10mg/kg rh001
‑
6抗体治疗后小鼠胰腺组织结构完整，胰腺间质水肿、腺泡细胞坏死以及炎细胞浸润均明显减弱。
[0151]
图7b中，示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠血浆淀粉酶水平分析结果。雨蛙肽诱导后小鼠血浆淀粉酶水平明显高于对照组，而给予10mg/kg rh001
‑
6抗体治疗后血浆淀粉酶明显下调。
[0152]
图7c中，示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠血浆中炎性细胞因子分析结果。与ap小鼠相比，10mg/kg rh001
‑
6抗体治疗小鼠血浆中促炎细胞因子il
‑
6的水平明显下降。
[0153]
4.3rh001
‑
6抗体治疗后显著降低中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比
[0154]
取小鼠外周血，经过细胞裂解液裂解后，在冰上避光进行ly6c、ly6g、cd11b、cd45和同型匹配对照染色30分钟，分析不同组别全血细胞中的中性粒细胞及单核细胞占白细胞的百分比。
[0155]
如图7d，示出了雨蛙肽诱导小鼠急性胰腺炎模型中不同组别小鼠全血细胞中中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比分析结果。结果显示，雨蛙肽诱导后小鼠全血细胞中中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比明显升高，给予10mg/kg rh001
‑
6治疗后中性粒细胞及单核细胞占白细胞百分比显著降低。
[0156]
实施例六：抗体rh001
‑
6的生物相容性分析
[0157]
分别取不同组别小鼠的心脏、肝脏、肾脏、肺脏及脾脏固定于10％中性缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中，将组织切割成大约5μm的厚度，并用苏木精和曙红染色(h&e)。
[0158]
如图8a，示出了不同组别小鼠各器官的染色切片。显微镜下观察结果显示，在心、肾、肝、肺和脾脏的切片中没有观察到明显的病理损伤。小鼠尾静脉注射不同的rh001
‑
6引起的任何器官相关毒性也通过血浆生化参数进行评估。
[0159]
在本实施例中，体内评估了不同rh001
‑
6处理组的器官毒性。如图8b，示出了不同组别小鼠的心脏毒性试验、肝功能试验和肾功能试验的分析结果。结果显示，所有组的心脏毒性试验(ck)、肝功能试验(alt、ast和tbil水平)和肾功能试验(bun和cre水平)相似。这表明rh001
‑
6 在体内是生物相容的，对器官没有毒性，安全性高。
[0160]
结合本说明书的前述实施例可知，本说明书实施例提供的新型靶向psgl
‑
1的猴源
单克隆抗体，具有特异性高、阻断炎症发应更强、亲和力高、免疫原性低、稳定性强等优势。并且，经体内实验证明，本说明书实施例提供的新型靶向psgl
‑
1的猴源单克隆抗体可用于治疗炎症，且对脏器没有毒副作用，在临床治疗中具有非常巨大的应用价值。