IFI6蛋白或调控IFI6蛋白基因表达的物质在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用的制作方法

ifi6蛋白或调控ifi6蛋白基因表达的物质在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及ifi6蛋白相关物质在制备禽呼肠孤病毒所致疾病药物中的应用。


背景技术：

2.禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)是呼肠孤病毒科(reoviridae)，正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)一种双链rna病毒，广泛存在自然界中，能够感染鸡、鸭、鹅、鸽子、鹦鹉、鸵鸟、火鸡等多种禽类，引起病毒性关节炎、腱鞘炎、生长缓慢矮小、产蛋量低、吸收不良等病症，这些病症都会增加养禽生产的成本，严重制约了养禽业的经济发展。
3.arv病毒既可垂直传播也可水平传播，且对环境的抵抗力很强。因此对于arv的防控措施主要是通过接种疫苗，目前已有的疫苗有弱毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗，这些疫苗有一定的优势，也存在一些缺陷和不足。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物，和/或如何制备禽呼肠孤病毒抑制剂。
5.为了解决以上技术问题，本发明提供了ifi6蛋白或调控基因表达的物质的应用，所述基因编码所述ifi6蛋白，所述应用为下述任一种：
6.y1在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物中的应用；
7.y2在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用；
8.y3在抑制arvσc表达中的应用；
9.所述ifi6蛋白是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：
10.a1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；
11.a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同活性的蛋白质；
12.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
13.其中，序列表中的序列1由107个氨基酸残基组成。
14.上述应用中，所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
15.上述应用中，所述蛋白质标签(protein
‑
tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
16.上述应用中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源
性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，perresidue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
17.上述应用中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
18.本发明还提供调控所述ifi6蛋白活性的物质的应用，所述应用为下述任一种：
19.y1、在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物中的应用；
20.y2、在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用；
21.y3、在抑制arvσc表达中的应用。
22.本发明还提供调控所述ifi6蛋白含量的物质的应用，所述基因编码所述ifi6蛋白，所述应用为下述任一种：
23.y1、在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病或禽呼肠孤病毒感染的药物中的应用；
24.y2、在制备禽呼肠孤病毒抑制剂中的应用；
25.y3、在抑制arvσc表达中的应用。
26.上述应用中，所述禽呼肠孤病毒抑制剂具有抑制禽呼肠孤病毒复制的功能。
27.上述应用中，所述调控基因表达的物质为提高或增强所述基因表达的物质，调控所述ifi6蛋白活性的物质为提高或增强所述ifi6蛋白活性的物质，调控所述ifi6蛋白含量的物质为提高或增强所述ifi6蛋白含量的物质。
28.上述应用中，所述提高或增强所述基因表达的物质、提高或增强所述ifi6蛋白活性的物质或提高或增强所述ifi6蛋白含量的物质为与ifi6蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b5)中的任一种：
29.b1)编码ifi6的核酸分子；
30.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
31.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
32.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
33.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
34.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
35.上述应用中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
36.b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；
37.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子。
38.其中，序列表中的序列2由324个核苷酸组成，编码序列表中的序列1所示的蛋白质。
39.上述应用中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(ifi6基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达ifi6的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动ifi6基因转录的启动子，还可包括终止ifi6转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。
40.可用现有的真核表达载体构建含有所述ifi6基因表达盒的重组表达载体。所述真核表达载体可为pef1α
‑
myc、pegfp、pcdna3.1
‑
ha等。
41.上述应用中，所述动物细胞系具体可为鸡胚成纤维细胞(df1)。
42.上述应用中，所述禽呼肠孤病毒所致疾病可为禽类的病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和吸收不良综合征等。
43.本发明还保护禽呼肠孤病毒抑制剂。
44.所述抑制剂可只为增强或提高所述ifi6蛋白的活性和/或提高所述ifi6蛋白的基因的表达量和/或提高所述ifi6蛋白的含量的物质，也可还含有载体或赋形剂。
45.上述禽呼肠孤病毒抑制剂中，所述增强或提高所述ifi6蛋白的活性和/或提高所述ifi6蛋白的基因的表达量和/或提高所述ifi6蛋白的含量的物质为与ifi6蛋白相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
46.b1)编码ifi6的核酸分子；
47.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
48.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
49.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
50.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系。
51.上述禽呼肠孤病毒抑制剂中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
52.b1)编码链的编码序列是序列表中序列2的核苷酸的cdna分子或dna分子；
53.b2)编码链的核苷酸是序列表中序列2的cdna分子或dna分子。
54.上述禽呼肠孤病毒抑制剂中，所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中具体的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一
步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3
‑
丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
55.本发明通过将编码ifi6蛋白的基因转入鸡胚成纤维细胞(df1)，发现了df1细胞中过表达ifi6后arvσc的相对表达量极显著降低，抑制禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)病毒复制。本发明对感染禽呼肠孤病毒及类似病毒的治疗具有应用价值。
附图说明
56.图1为本发明实施例1中ifi6片段pcr扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。图中1号泳道为dl2000 dna marker；2号泳道为pcr扩增产物，箭头指示的是扩增的ifi6片段，大小约为324bp。
57.图2为本发明实施例1中pef1α
‑
myc
‑
ifi6以salⅰ和notⅰ双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图。图中1号泳道为dl5000 dna marker；2号泳道为pef1α
‑
myc
‑
ifi6；3号泳道为pef1α
‑
myc
‑
ifi6双酶切产物，箭头指示的是ifi6基因片段。
58.图3为本发明实施例1中间接免疫荧光验证ifi6真核表达的结果图。图中a:转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞；b:转染了pef1α
‑
myc
‑
ifi6质粒的df1细胞图4为本发明实施例1中western
‑
blot验证ifi6真核表达的结果图。
59.图5为本发明实施例1中rt
‑
qpcr检测arvσc相对表达量。图中所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以ttests分析各组显著性差异，****代表显著性分析结果为p<0.0001。
具体实施方式
60.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
61.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
62.下述实施例中鸡胚成纤维细胞(df1)记载于非专利文献“万丽军等.禽呼肠孤病毒σc蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析.中国兽医科学，2021，51(04)：0492
‑
0499”，公
众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
63.下述实施例中去内毒素的真核表达载体pef1α
‑
myc为clontech公司产品，货号631991。
64.下述实施例中arv病毒s1133毒株记载于非专利文献“万丽军等.禽呼肠孤病毒σc蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析.中国兽医科学，2021，51(04)：0492
‑
0499”，公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
65.下述实施例中所有的引物合成和测序均由瑞博兴科生物技术有限公司完成。
66.下述实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
67.实施例1
68.在前期工作中，申请人发现arv感染的体内和体外试验中，ifi6的表达都表现为上调，因此推测ifi6在抗arv病毒感染的过程中发挥着重要作用，对ifi6在arv感染机体所起作用的研究不仅有助于揭示arv的致病机理还为研制抗arv感染的特效药物提供了理论依据。
69.本次实验中使用的引物如下：
70.表1引物序列
[0071][0072]
注:下划线指示的序列为salⅰ酶识别位点，双下划线指示的序列为notⅰ酶识别位点。
[0073]
1过表达载体的构建及鉴定
[0074]
ifi6是氨基酸序列是序列1的蛋白质。
[0075]
以鸡胚成纤维细胞(df1)抽提的总rna反转录的cdna为模板，用特异性引物(ifi6
‑
u和ifi6
‑
d)pcr扩增ifi6基因(核苷酸序列为序列2)，琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，大小约324bp(见图1)。将ifi6基因的pcr产物连接到以salⅰ和notⅰ双酶切线性化的真核表达载体pef1α
‑
myc上，构建重组质粒pef1α
‑
myc
‑
ifi6。pef1α
‑
myc
‑
ifi6是用编码序列(cds)是序列表中序列2的ifi6基因替换pef1α
‑
myc载体的限制性核酸内切酶salⅰ和notⅰ识别位点间的片段(包括salⅰ的识别位点和notⅰ的识别位点在内的小片段)，保持pef1α
‑
myc载体的其它序列不变，得到的ifi6基因的重组表达载体
[0076]
将pef1α
‑
myc
‑
ifi6以salⅰ和notⅰ限制性内切酶双酶切验证，结果见图2，获得了目的条带，表明ifi6基因正确连接到了pef1α
‑
myc载体上了。
[0077]
2培养df1细胞及转染
[0078]
待df1细胞融合度达到70％
‑
90％且生长状态正常，将pef1α
‑
myc
‑
ifi6(实验组)、pef1α
‑
myc(对照组)分别转染df1细胞，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。
[0079]
3 ifi6蛋白表达的间接免疫荧光和western
‑
blot验证
[0080]
3.1间接免疫荧光验证
[0081]
步骤2转染48h后，弃去培养液，将转染pef1α
‑
myc
‑
ifi6后的df1细胞用4％组织细胞固定液固定10min，0.1％triton x
‑
100通透15min，5％bsa封闭液封闭1h后，加入稀释后的鼠源anti
‑
myc antibody(赛默飞世尔科技有限公司产品)，于37℃孵育2h；随后弃去，使用1
×
pbs buffer洗3次，每次5min；洗涤后加alexa fluor 488标记的山羊抗鼠igy(赛默飞世尔科技有限公司产品)，37℃孵育1h；使用1
×
pbs buffer洗3次，每次5min；以转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞蛋白为空白对照，通过荧光显微镜观察拍照，结果见图3，表明转染pef1α
‑
myc
‑
ifi6后的df1细胞表达ifi6蛋白，转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞没有表达ifi6蛋白。
[0082]
3.2 western
‑
blot验证
[0083]
步骤2转染48h后，弃去培养液，用1
×
的pbs洗三次，使用裂解液冰上30min裂解细胞，裂解后4℃离心，取上清即为转染了pef1α
‑
myc
‑
ifi6的df1细胞蛋白，进行sds
‑
page电泳，以转染了pef1α
‑
myc的df1细胞蛋白为空白对照。随后，转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用western封闭液封闭6h后，分别加入稀释后的鼠源anti
‑
myc antibody(赛默飞世尔科技有限公司产品)、β
‑
actine(赛默飞世尔科技有限公司产品，)，37℃孵育2h，使用1
×
tbst buffer洗3次，每次10min；洗涤后用碱性磷酸酯酶标记的igg(赛默飞世尔科技有限公司产品)于37℃孵育1h，使用1
×
tbst buffer洗3次后，bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天生物技术有限公司产品)对pvdf膜进行显色后拍照，结果见图4，表明转染pef1α
‑
myc
‑
ifi6后的df1细胞表达ifi6蛋白，转染了pef1α
‑
myc质粒的df1细胞没有表达ifi6蛋白。
[0084]
4 rt
‑
qpcr检测ifi6对arv病毒复制的影响
[0085]
按照步骤2将pef1α
‑
myc
‑
ifi6(实验组)、pef1α
‑
myc(对照组)分别转染df1细胞转染24h后，感染arv病毒，moi＝1。培养24h后，使用细胞刮刀分别刮取细胞，抽提病毒总rna，然后反转录为cdna，检测arvσc转录水平的表达量，针对arvσc的引物为arvσc
‑
u和arvσc
‑
d，针对内参gapdh的引物为gapdh
‑
u和gapdh
‑
d(见表1)。设置3次重复，以ttests分析各组显著性差异。
[0086]
结果见图5，实验组的arvσc相对表达量低于对照组，且差异性极显著，arvσc是位于arv外衣壳上的同源三聚体蛋白，通过检测σc基因的表达量来反应arv的表达量，图5说明df1细胞中过表达ifi6后能够抑制arv病毒复制，可用于制备禽呼肠孤病毒抑制剂，可用于预防和/或治疗禽呼肠孤病毒所致疾病。
[0087]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。