花粉形成能力低的甜菊植物的制作方法

1.本发明涉及花粉形成能力低的甜菊植物、其制作方法及筛选方法等。


背景技术：

2.甜菊为以南美巴拉圭为原产地的菊科多年生植物。甜菊含有具有砂糖的数十～数百倍的甜味的各种甜味成分，这些甜味成分被萃取而作为天然甜味剂使用(专利文献1)。然而，关于甜菊的基因信息或怎样的基因与机体内现象的控制相关等，未知的部分依然较多。
3.专利文献
4.专利文献1：wo2018/124142


技术实现要素：

5.本发明追求甜菊的基因信息的进一步解读。
6.本发明提供花粉形成能力低的甜菊植物体以及该植物体的制作方法及筛选方法等。
7.在一种方式中，本发明提供以下内容。
8.[1]一种甜菊植物体，其特征在于，与野生型相比花粉形成能力低。
[0009]
[2]根据[1]所述的植物体，其特征在于，对于与序列号151的79位相当的位置的碱基为c的等位基因呈异型或同型接合性、对于与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性及/或对于与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性。
[0010]
[3]根据[1]或[2]所述的植物体，其特征在于，进一步具有以下(1)～(7)的遗传性状的至少1种，
[0011]
(1)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0012]
(2)对于与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0013]
(3)对于与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性，
[0014]
(4)对于与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因呈同型接合性，
[0015]
(5)对于与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性，
[0016]
(6)对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈异型接合性，
[0017]
(7)对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性。
[0018]
[4]根据[3]所述的植物体，其特征在于，具有以下(1)～(2)的特征的至少1种，
[0019]
(1)干燥叶的每单位质量含有3％以上的rebd，
[0020]
(2)干燥叶的每单位质量含有0.2％以上的rebm。
[0021]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的植物体，其特征在于，为非转基因植物体。
[0022]
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的植物体，其特征在于，包含经突变诱发处理的甜菊植物体及其后代植物体。
[0023]
[7]一种种子、组织、组织培养物或细胞，其特征在于，为[1]～[6]中任一项所述的
植物体的种子、组织、组织培养物或细胞。
[0024]
[8]根据[7]所述的组织、组织培养物或细胞，其特征在于，选自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织。
[0025]
[9]一种花粉形成能力低的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含使[1]～[6]中任一项所述的植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。
[0026]
[10]根据[9]所述的方法，其特征在于，第2植物体为[1]～[6]中任一项所述的植物体。
[0027]
[11]一种萃取物，其特征在于，为[1]～[6]中任一项所述的植物体、[7]或[8]所述的种子、组织、组织培养物或细胞的萃取物。
[0028]
[12]一种甜菊萃取物的制造方法，其特征在于，包含从[1]～[6]中任一项所述的植物体、[7]或[8]所述的种子、组织、组织培养物或细胞中获得萃取物的工序。
[0029]
[13]一种甜菊醇糖苷精制品的制造方法，其特征在于，包含从[1]～[6]中任一项所述的植物体、[7]或[8]所述的种子、组织、组织培养物或细胞中获得萃取物的工序，以及从所得萃取物中提纯甜菊醇糖苷的工序。
[0030]
[14]根据[13]所述的方法，其特征在于，甜菊醇糖苷包含瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷o、甜菊苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、杜克苷a或它们的组合。
[0031]
[15]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包含以下工序，
[0032]
提供[11]所述的萃取物或其精制品的工序，及，
[0033]
将所述萃取物或精制品添加至饮食品、甜味组合物、香料或医药品的原料中的工序。
[0034]
[16]一种花粉形成能力低的甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包含从被检测甜菊植物体的基因组中，检测存在及/或不存在对于与序列号151的79位相当的位置的碱基为c的等位基因呈异型或同型接合性、对于与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性及/或对于与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性的遗传性状的工序。
[0035]
[17]根据[16]所述的方法，其特征在于，进一步包含从被检测甜菊植物体的基因组中，检测存在及/或不存在以下(1)～(7)的遗传性状的工序，
[0036]
(1)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0037]
(2)对于与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0038]
(3)对于与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性，
[0039]
(4)对于与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因呈同型接合性，
[0040]
(5)对于与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性，
[0041]
(6)从被检测甜菊植物体的基因组中，对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈异型接合性，
[0042]
(7)从被检测甜菊植物体的基因组中，对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性。
[0043]
[18]根据[16]或[17]所述的方法，其特征在于，检测遗传性状的工序利用caps法、
dcaps法或taqman pcr法来实施。
[0044]
[19]根据[16]～[18]中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包含评价被检测甜菊植物组织的花粉形成能力的工序。
[0045]
[20]一种花粉形成能力低的甜菊植物体的筛选试剂盒，其特征在于，包含用于检测存在及/或不存在对于与序列号151的79位相当的位置的碱基为c的等位基因呈异型或同型接合性、对于与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性及/或对于与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因呈异型或同型接合性的遗传性状的试剂。
[0046]
[21]根据[20]所述的试剂盒，且特征在于，进一步包含用于检测存在及/或不存在以下(1)～(7)的遗传性状试剂，
[0047]
(1)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0048]
(2)对于与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性，
[0049]
(3)对于与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性，
[0050]
(4)对于与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因呈同型接合性，
[0051]
(5)对于与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性，
[0052]
(6)对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈异型接合性，
[0053]
(7)对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性。
[0054]
[22]根据[20]或[21]所述的试剂盒，其特征在于，试剂包含caps法、dcaps法或taqman pcr法中使用的引物及/或探针。
[0055]
[23]一种花粉形成能力低的甜菊植物体的制作方法，其特征在于，包含在与序列号151的79位相当的位置上导入由t向c的变异的工序，及/或在与序列号152的65位相当的位置上导入由a向t的变异的工序，及/或在与序列号153的24位相当的位置上导入由a向t的变异的工序。
[0056]
[24]根据[23]所述的方法，其特征在于，变异的导入通过突变诱发处理来实施。
[0057]
根据本发明，可获得花粉形成能力低的甜菊植物体，提供制作这样的植物体的方法、从这样的植物体中所得的叶、含有从该叶中所得的萃取物的食物或饮料等。花粉形成能力低时，本来用于花粉形成的养分用于叶的成长，从而可期待提高叶的生产性，甚至叶中积蓄的甜菊醇糖苷含量增大。
附图说明
[0058]
图1为表示m1代个体中的甜味成分含量的频率分布的图。纵轴表示个体数，横轴表示干燥叶中的甜味成分浓度(％)。
[0059]
图2为表示分离群体a的变异c49a阳性个体(c49a

)及阴性个体(c49a
‑
)中的甜味成分含量的分布的图。纵轴表示干燥叶中的甜味成分浓度(％)，虚线表示分离群体a所属的全部个体的甜味成分浓度的平均值。
[0060]
图3为表示分离群体b的变异c49a阳性个体(c49a

)及阴性个体(c49a
‑
)中的甜味成分含量的分布的图。纵轴表示干燥叶中的甜味成分浓度(％)，虚线表示分离群体b所属的全部个体的甜味成分浓度的平均值。
具体实施方式
[0061]
以下对本发明进行详细说明。以下实施方式为用于说明本发明的例示，本发明并不仅限定于这些实施方式。只要不脱离该主旨，本发明可通过各种方式来实施。
[0062]
另外，本说明书中引用的所有文献及公开公报、专利公报以及其他专利文献，作为参考纳入本说明书。此外，本说明书包含2019年4月11日提出申请的作为本技术优先权主张的基础的日本专利申请(日本特愿2019
‑
075611号)的说明书及附图中所述内容。
[0063]
1.花粉形成能力低的甜菊植物体
[0064]
本发明提供与野生型相比花粉形成能力低的甜菊植物体(以下，有时总称为“本发明的植物体”或“本发明的甜菊植物体”)。
[0065]
甜菊为具有stevia rebaudiana bertoni的学名的植物。
[0066]“与野生型相比花粉形成能力低”是指，例如在相同栽培条件下进行栽培时，产生的花粉数比野生型甜菊植物体少。更具体而言，例如在相同栽培条件下进行栽培时，充分开花的花中所含的花粉数比野生型甜菊植物体少20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、91.5％以上、92％以上、92.5％以上、93％以上、93.5％以上、94％以上、94.5％以上、95％以上、95.5％以上、96％以上、96.5％以上、97％以上、97.5％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上、99.5％以上或100％。少100％是指，野生型甜菊植物体形成1个以上的花粉时，完全未形成花粉(即花粉数为0)。此外，作为代替“与野生型相比花粉形成能力低”的指标，也可使用以下指标：充分开花的花中所含的花粉为50个以下，例如45个以下、40个以下、35个以下、30个以下、25个以下、20个以下、19个以下、18个以下、17个以下、16个以下、15个以下、14个以下、13个以下、12个以下、11个以下、10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、2个以下或1个以下。另外，“充分开花”是指，柱头伸长至从侧面观察花时可看到至少1个柱头的程度的状态。
[0067]
在一种方式中，就本发明的甜菊植物体而言，具有对于与序列号151的79位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性或异型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状x
‑
1”)、对于与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性或异型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状x
‑
2”)及对于与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性或异型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状x
‑
3”)的至少1种的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状x”)。
[0068]
在一种方式中，本发明的甜菊植物体具有对于与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状a”)。
[0069]
在其他方式中，本发明的甜菊植物体具有以下(b
‑
1)～(b
‑
4)的至少1种的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状b”)。
[0070]
(b
‑
1)对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性(以下，有时称“本发明的遗传性状b
‑
1”)。
[0071]
(b
‑
2)对于与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性(以下，有时称“本发明的遗传性状b
‑
2”)。
[0072]
(b
‑
3)对于与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性(以
下，有时称“本发明的遗传性状b
‑
3”)。
[0073]
(b
‑
4)对于与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因呈同型接合性(以下，有时称“本发明的遗传性状b
‑
4”)。
[0074]
在其他方式中，本发明的甜菊植物体具有对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈异型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状c”)。
[0075]
在其他方式中，本发明的甜菊植物体具有对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性的遗传性状(以下，有时称“本发明的遗传性状d”)。
[0076]
在优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x(以下，如无特殊记载，指本发明的遗传性状x
‑
1～x
‑
3的至少1种)和遗传性状a。在其他优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x和遗传性状b(以下，如无特殊记载，指本发明的遗传性状b
‑
1～b
‑
4的至少1种)。在其他优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x和遗传性状c或d。在其他优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状b。在其他优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状c或d。在其他优选方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状b和遗传性状c或d。在更优选的方式中，本发明的甜菊植物体具有本发明的遗传性状x、a、b及c或d的全部。
[0077]
所谓“与～相当的位置(或部分)”，当在基因组中存在与标准序列(例如，序列号1～6、151～153等)相同的序列时，指在基因组中存在的该序列中的位置或部分(例如，201位、40位、44位、41位、55～72位、49位、79位、65位、24位等)，当在基因组中不存在与标准序列相同的序列时，指基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。在基因组中是否存在与标准序列相同或与其相当的序列，例如可通过以下方法决定：通过可用pcr对标准序列进行扩增的引物对作为对象的甜菊植物的基因组dna进行扩增，并实施扩增产物的测序，实施所得序列和标准序列的比对分析。作为与标准序列相当的序列的非限定例，例如可列举相对于标准序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列。基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分，可以考虑标准序列中的位置或部分的前后的碱基序列等而决定。例如，可通过对标准序列和基因组中的与标准序列相当的序列的比对分析，决定基因组中的与标准序列相当的序列中的与标准序列中的位置或部分相当的位置或部分。
[0078]
例如，以本发明的遗传性状a的“与序列号1的201位相当的位置”为例，当甜菊植物体的基因组具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分时，“与序列号1的201位相当的位置”为自基因组中的由与序列号1相同的碱基序列构成的部分的5’侧开始的201位。另一方面，当甜菊植物体的基因组与序列号1不同但是具有由与其相当的碱基序列构成的部分时，由于基因组不具有由与序列号1相同的碱基序列构成的部分，因此“与序列号1的201位相当的位置”并非一定是自与序列号1相当的部分的5’侧开始的201位，但是考虑序列号1的201位的前后的碱基序列等，可确定涉及的甜菊植物的基因组中的“与序列号1的201位相当的
位置”。例如，通过甜菊植物的基因组中的与序列号1相当的部分的碱基序列和序列号1的碱基序列的比对分析，可确定甜菊植物的基因组中的“与序列号1的201位相当的位置”。
[0079]“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”是指，例如由相对于序列号1的碱基序列具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列一致性的碱基序列构成的部分。
[0080]
在一部分的方式中，在“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”中包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物体的基因组的部分：与从序列号1的5’末端开始15～25个碱基长的部分的互补序列杂交的正向引物和与从序列号1的3’末端侧开始15～25个碱基长的部分杂交的反向引物。
[0081]
这里为了简洁，以本发明的遗传性状a为例进行了说明，但是对于本发明的遗传性状x(包括遗传性状x
‑
1～x
‑
3)、b(包括遗传性状b
‑
1～b
‑
4)、c及d也是同样的。
[0082]
在特定方式中，在“由与序列号151相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号154的碱基序列的正向引物和包含序列号155的碱基序列的反向引物。
[0083]
在特定方式中，在“由与序列号152相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号156的碱基序列的正向引物和包含序列号157的碱基序列的反向引物。
[0084]
在特定方式中，在“由与序列号153相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号158的碱基序列的正向引物和包含序列号159的碱基序列的反向引物。
[0085]
在特定方式中，在“由与序列号1相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号7的碱基序列的正向引物和包含序列号8的碱基序列的反向引物。
[0086]
在特定方式中，在“由与序列号2相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号9的碱基序列的正向引物和包含序列号10的碱基序列的反向引物。
[0087]
在特定方式中，在“由与序列号3相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号11的碱基序列的正向引物和包含序列号12的碱基序列的反向引物。
[0088]
在特定方式中，在“由与序列号4相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号13的碱基序列的正向引物和包含序列号14的碱基序列的反向引物。
[0089]
在特定方式中，在“由与序列号5相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通过使用了以下引物的pcr进行扩增的甜菊植物的基因组的部分：包含序列号15的碱基序列的正向引物和包含序列号16的碱基序列的反向引物。
[0090]
在特定方式中，在“由与序列号6相当的碱基序列构成的部分”中，例如，包含可通
allele specific hybridization)法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe(primer oligo base extension)法、vset(very short extension)法、survivor assay、sniper assay、luminex assay、good法、lcx法、snapshot法、mass array法、pyrosequencing法、snp
‑
it法、熔解曲线分析法等，但检测方法并不限定于这些。
[0103]
在特定方式中，本发明的遗传性状可通过以下引物集及限制酶的组合进行检测。
[0104]
候选植物体具有遗传性状x
‑
1时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号169所示的碱基序列的正向引物及具有序列号170所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，对所得pcr产物(约166bp长，例如，序列号171)实施基于限制酶alui的处理时，产生约120bp长(例如，序列号172)及约46bp长(例如，序列号173)的条带。另一方面，通过pcr扩增，例如即使得到序列号174的pcr产物(约166bp长)，而对其实施alui限制酶处理也仅可产生约166bp长的条带(例如，序列号174)时，该候选植物体不具有遗传性状x
‑
1。
[0105]
候选植物体具有遗传性状x
‑
2时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号169所示的碱基序列的正向引物及具有序列号175所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，对所得pcr产物(约340bp长，例如，序列号176)实施基于限制酶tsp45i的处理时，产生约225bp长(例如，序列号177)及约115bp长(例如，序列号178)的条带。另一方面，通过pcr扩增，例如即使得到序列号179的pcr产物(约340bp长)，而对其实施tsp45i限制酶处理也仅可产生约340bp长的条带(例如，序列号179)时，该候选植物体不具有遗传性状x
‑
2。
[0106]
候选植物体具有遗传性状x
‑
3时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号169所示的碱基序列的正向引物及具有序列号180所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，对所得pcr产物(约293bp长，例如，序列号181)实施基于限制酶nlaiii的处理时，产生约259bp长(例如，序列号182)及约34bp长(例如，序列号183)的条带。另一方面，通过pcr扩增，例如即使得到序列号184的pcr产物(约293bp长)，而对其实施nlaiii限制酶处理也仅可产生约293bp长的条带(例如，序列号184)时，该候选植物体不具有遗传性状x
‑
3。
[0107]
候选植物体具有遗传性状a时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号37所示的碱基序列的正向引物及具有序列号38所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，对所得pcr产物(约196bp长，例如，序列号39)实施基于限制酶hpy188i的处理时，产生约96bp长的条带(例如，序列号41)和约100bp长的条带(例如，序列号42)。另一方面，通过pcr扩增，例如得到序列号40的pcr产物(约196bp长)，通过限制酶hpy188i产生约43bp(例如，序列号43)及约57bp(例如，序列号44)的限制酶处理产物时，该候选植物体不具有遗传性状a。
[0108]
候选植物体具有遗传性状b
‑
1时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号45所示的碱基序列的正向引物及具有序列号46所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，即使对所得pcr产物(约297bp长，例如，序列号47)实施kpni限制酶处理也仅可获得约297bp长的条带(例如，序列号47)。另一方面，通过pcr扩增，例如得到序列号48的pcr产物(约297bp长)，通过限制酶kpni产生约258bp的限制酶处理产物(例如，序列号49)时，该候选植物体不具有遗传性状b
‑
1。
[0109]
候选植物体具有遗传性状b
‑
2时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号50所示的碱基序列的正向引物及具有序列号51所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，即使对所得pcr产物(约383bp长，例如，序列号52)实施xbai限制酶处理也仅可获得约383bp长的条带(例如，序列号52)。另一方面，通过pcr扩增，例如得到序列号53的pcr产物
(约297bp长)，通过限制酶xbai产生约344bp长的限制酶处理产物(例如，序列号54)时，该候选植物体不具有遗传性状b
‑
2。
[0110]
候选植物体具有遗传性状b
‑
3时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号55所示的碱基序列的正向引物及具有序列号56所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，即使对所得pcr产物(约390bp长，例如，序列号57)实施aflii限制酶处理也仅可获得约390bp长的条带(例如，序列号57)。另一方面，通过pcr扩增，例如得到序列号58的pcr产物(约297bp长)，通过限制酶aflii产生约347bp长的限制酶处理产物(例如，序列号59)时，该候选植物体不具有遗传性状b
‑
3。
[0111]
候选植物体具有遗传性状b
‑
4时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号60所示的碱基序列的正向引物及具有序列号61所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增时，仅产生约140bp的pcr产物(例如，序列号62)。另一方面，产生140bp长(例如，序列号62)及158bp长(例如，序列号63)的pcr产物时，该候选植物体不具有遗传性状b
‑
4。
[0112]
候选植物体具有遗传性状c或d时，例如，对候选植物体的基因组dna，使用具有序列号64所示的碱基序列的正向引物及具有序列号65所示的碱基序列的反向引物进行pcr扩增，对所得pcr产物(约367bp长，例如，序列号66)以限制酶spei进行处理时，获得约367bp长(例如，序列号66)及约321bp长(例如，序列号68)的条带。另一方面，通过pcr扩增，例如得到序列号67的pcr产物(约367bp长)，通过限制酶spei仅产生约367bp长的限制酶处理产物(例如，序列号67)时，该候选植物体不具有遗传性状c及d。
[0113]
关于上述bp长，所谓“约”是指
±
5bp。限制酶处理可遵循使用的各限制酶的销售商推荐的条件实施。
[0114]
花粉形成能力，例如可通过已知的任意方法或实施例6中记载的方法进行评价。作为花粉形成能力评价法的非限定例，例如可列举以下方法。
[0115]
(1)使被检测甜菊植物体开花。
[0116]
(2)对开花的花中所含的花粉数进行计数。
[0117]
被检测甜菊植物体可单独栽培，也可与野生型甜菊植物体(对照)在同一环境下一同栽培。单独栽培时，上述评价方法中，也可包含对被检测甜菊植物体形成的花粉数与在同样条件下栽培的野生型甜菊植物体形成的花粉数(例如，基于文献或其他实验中所得的数据)进行比较的工序。与野生型甜菊植物体一同栽培时，上述评价方法中，也可包含对被检测甜菊植物体形成的花粉数与一同栽培的野生型甜菊植物体形成的花粉数进行比较的工序。
[0118]
开花可在短日照条件下进行诱导。就短日照条件而言，暗期为超过10小时，优选为11小时以上。具体的暗期的长度，例如可为11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时等。
[0119]
在特定方式中，花粉的计数在花充分开花的状态下实施。
[0120]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，干燥叶每单位质量含有3％以上的rebd。这是指，例如规定质量的干燥叶(例如，50mg)中，含有3质量％以上的比例的rebd(例如，1.5mg以上)。该方式中的干燥叶每单位质量的rebd的比例并无限定，例如可为3.0％以上、3.1％以上、3.2％以上、3.3％以上、3.4％以上、3.5％以上、3.6％以上、3.7％以上、3.8％以上、3.9％以上、4.0％以上、4.1％以上、4.2％以上、4.3％以上、4.4％以上、4.5％以上、
4.6％以上、4.7％以上、4.8％以上、4.9％以上、5.0％以上、5.1％以上、5.2％以上、5.3％以上、5.4％以上、5.5％以上、5.6％以上、5.7％以上、5.8％以上、5.9％以上、6.0％以上等，优选3.3％以上，更优选3.6％以上。干燥叶每单位质量的rebd的比例的上限并无特别限定，例如可为20％、15％、10％等。如实施例所示，遗传性状a～d与该方式的关联性高。
[0121]
此处，干燥叶是指通过使本发明的甜菊植物体的新鲜叶干燥而将含水量降低至3～4重量％的叶。
[0122]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，干燥叶每单位质量含有2.6％以上的rebd和0.4％以上的rebm。这是指，例如规定质量的干燥叶(例如，50mg)中含有2.6质量％以上比例的rebd(例如，每干燥叶50mg为1.3mg以上)和0.4质量％以上的rebm(例如，每干燥叶50mg为0.2mg以上)。该方式中的干燥叶每单位质量的rebd和rebm的比例，作为(rebd的比例：rebm的比例)时，并无限定，例如可为(2.6％以上：0.4％以上)、(2.8％以上：0.4％以上)、(3％以上：0.4％以上)、(3.2％以上：0.4％以上)、(3.4％以上：0.4％以上)、(3.6％以上：0.4％以上)、(3.8％以上：0.4％以上)、(4％以上：0.4％以上)、(4.2％以上：0.4％以上)、(4.4％以上：0.4％以上)、(4.6％以上：0.4％以上)、(4.8％以上：0.4％以上)、(5％以上：0.4％以上)、(2.6％以上：0.5％以上)、(2.8％以上：0.5％以上)、(3％以上：0.5％以上)、(3.2％以上：0.5％以上)、(3.4％以上：0.5％以上)、(3.6％以上：0.5％以上)、(3.8％以上：0.5％以上)、(4％以上：0.5％以上)、(4.2％以上：0.5％以上)、(4.4％以上：0.5％以上)、(4.6％以上：0.5％以上)、(4.8％以上：0.5％以上)、(5％以上：0.5％以上)、(2.6％以上：0.6％以上)、(2.8％以上：0.6％以上)、(3％以上：0.6％以上)、(3.2％以上：0.6％以上)、(3.4％以上：0.6％以上)、(3.6％以上：0.6％以上)、(3.8％以上：0.6％以上)、(4％以上：0.6％以上)、(4.2％以上：0.6％以上)、(4.4％以上：0.6％以上)、(4.6％以上：0.6％以上)、(4.8％以上：0.6％以上)、(5％以上：0.6％以上)、(2.6％以上：0.7％以上)、(2.8％以上：0.7％以上)、(3％以上：0.7％以上)、(3.2％以上：0.7％以上)、(3.4％以上：0.7％以上)、(3.6％以上：0.7％以上)、(3.8％以上：0.7％以上)、(4％以上：0.7％以上)、(4.2％以上：0.7％以上)、(4.4％以上：0.7％以上)、(4.6％以上：0.7％以上)、(4.8％以上：0.7％以上)、(5％以上：0.7％以上)、(2.6％以上：0.8％以上)、(2.8％以上：0.8％以上)、(3％以上：0.8％以上)、(3.2％以上：0.8％以上)、(3.4％以上：0.8％以上)、(3.6％以上：0.8％以上)、(3.8％以上：0.8％以上)、(4％以上：0.8％以上)、(4.2％以上：0.8％以上)、(4.4％以上：0.8％以上)、(4.6％以上：0.8％以上)、(4.8％以上：0.8％以上)、(5％以上：0.8％以上)等，优选(3.6％以上：0.4％以上)。干燥叶每单位质量的rebd的比例的上限并无特别限定，例如可为20％、15％、10％等，rebm的比例的上限也无特别限定，可为10％、5％、3％等。如实施例所示，遗传性状a～d与该方式的关联性高。
[0123]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，干燥叶每单位质量合计含有3.7％以上的rebd和rebm。这是指，例如规定质量的干燥叶(例如，50mg)中所含的rebd和rebm合计质量为3.7质量％以上(例如，1.85mg以上)。该方式中的干燥叶每单位质量的rebd和rebm的合计比例并无限定，例如可为3.7％以上、3.8％以上、3.9％以上、4.0％以上、4.1％以上、4.2％以上、4.3％以上、4.4％以上、4.5％以上、4.6％以上、4.7％以上、4.8％以上、4.9％以上、5.0％以上、5.1％以上、5.2％以上、5.3％以上、5.4％以上、5.5％以上、5.6％以上、5.7％以上、5.8％以上、5.9％以上、6.0％以上、6.1％以上、6.2％以上、6.3％以上、6.4％以上、
6.5％以上、6.6％以上、6.7％以上、6.8％以上、6.9％以上、7.0％以上等，优选4.9％以上。干燥叶每单位质量的rebd和rebm的合计比例的上限并无特别限定，例如可为25％、20％、15％等。如实施例所示，遗传性状a～d与该方式的关联性高。
[0124]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，rebd和rebm相对于总甜菊醇糖苷(total steviol glycoside：tsg)的质量比合计为37.8％以上。这是指，例如将叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的rebd和rebm的合计质量作为相对于从叶中所得的甜菊醇糖苷的总质量的比率以rebd rebm/tsg％进行表示时，rebd rebm/tsg的值为37.8％以上。该方式中的rebd rebm/tsg的值并无限定，例如可为37.8％以上、37.9％以上、38.0％以上、38.1％以上、38.2％以上、38.3％以上、38.4％以上、38.5％以上、38.6％以上、38.7％以上、38.8％以上、38.9％以上、39.0％以上、39.2％以上、39.4％以上、39.6％以上、39.8％以上、40.0％以上、40.2％以上、40.4％以上、40.6％以上、40.8％以上、41.0％以上、41.2％以上、41.4％以上、41.6％以上、41.8％以上、42.0％以上、42.4％以上、42.8％以上、43.2％以上、43.6％以上、44.0％以上、44.4％以上、44.8％以上、45.2％以上、45.6％以上、46.0％以上等，优选38.1％以上。rebd rebm相对于总甜菊醇糖苷的质量比的上限并无特别限定，例如可为85％、75％、65％、55％等。如实施例所示，遗传性状a～d与该方式的关联性高。
[0125]
tsg为可测定的甜菊醇糖苷的总称，不包含未知的甜菊醇糖苷或以低于检测界限的量存在的甜菊醇糖苷。总甜菊醇糖苷优选为选自reba、rebb、rebd、rebe、rebf、rebi、rebj、rebk、rebm、rebn、rebo、rebq、rebr、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷中的2种以上的任意组合。例如，在某种实施方式中，总甜菊醇糖苷由reba、rebb、rebm、rebd、rebf、rebm及甜菊苷构成，在其他实施方式中，总甜菊醇糖苷也可由reba、rebb、rebm、rebd、rebf、rebm、rebn、rebo及甜菊苷构成。在特定的实施方式中，总甜菊醇糖苷由reba、rebb、rebc、rebd、rebf、rebm、rebn及rebo构成。
[0126]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，干燥叶每单位质量含有0.2％以上rebm。这是指，例如，规定质量的干燥叶(例如，50mg)中所含的rebm的质量为0.2质量％以上(例如，0.1mg以上)。该方式中的干燥叶每单位质量的rebm的比例并无限定，例如可为0.20％以上、0.25％以上、0.30％以上、0.35％以上、0.40％以上、0.45％以上、0.50％以上、0.55％以上、0.60％以上、0.65％以上、0.70％以上、0.75％以上、0.80％以上、0.85％以上、0.90％以上、0.95％以上、1.00％以上、1.05％以上、1.10％以上、1.15％以上、1.20％以上、1.25％以上、1.30％以上、1.35％以上、1.40％以上、1.45％以上等，优选0.4％以上。干燥叶每单位质量的rebm的比例的上限并无特别限定，例如可为15％、10％、5％等。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联性高。
[0127]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，rebm相对于总甜菊醇糖苷的质量比为2％以上。这是指，将例如叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的rebm的质量，作为相对于从叶中所得的甜菊醇糖苷的总质量的比率以rebm/tsg％进行表示时，rebm/tsg的值为2％以上。该方式中的rebm/tsg的值并无限定，例如可为2％以上、2.5％以上、3％以上、3.5％以上、4％以上、4.5％以上、5％以上、5.5％以上、6％以上、6.5％以上、7％以上、7.5％以上、8％以上、8.5％以上、9％以上、9.5％以上、10％以上、10.5％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上等，优选3.5％以上。rebm相对于总甜菊醇糖苷的质量比的上限并无特别限定，例如可为50％、45％、40％、
35％等。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联性高。
[0128]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，将每100g野生型甜菊植物体的叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中所含的瑞鲍迪苷m的量(g)作为100％时，与野生型甜菊种相比，以300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、1100％以上、1200％以上、1300％以上、1400％以上、1500％以上、1600％以上、1700％以上、1800％以上、1900％以上、2000％以上、2100％以上、2200％以上、2300％以上、2400％以上、2500％以上、2600％以上、2700％以上、2800％以上、2900％以上、3000％以上的高含量含有瑞鲍迪苷m。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联性高。
[0129]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，干燥叶每单位质量含有1％以上的rebd。这是指，例如规定质量的干燥叶(例如，50mg)所含的rebd的质量为1质量％以上(例如，0.5mg以上)。该方式中的干燥叶每单位质量的rebd的比例并无限定，例如可为1.00％以上、1.05％以上、1.10％以上、1.15％以上、1.20％以上、1.25％以上、1.30％以上、1.35％以上、1.40％以上、1.45％以上、1.50％以上、1.55％以上、1.60％以上、1.65％以上、1.70％以上、1.75％以上、1.80％以上、1.85％以上、1.90％以上、1.95％以上、2.00％以上、2.05％以上、2.10％以上、2.15％以上、2.20％以上、2.25％以上、2.30％以上、2.35％以上、2.40％以上、2.45％以上、2.50％以上、2.55％以上、2.60％以上、2.65％以上、2.70％以上、2.75％以上、2.80％以上、2.85％以上、2.90％以上、2.95％以上、3.00％以上、3.05％以上、3.10％以上、3.15％以上、3.20％以上、3.25％以上、3.30％以上、3.35％以上、3.40％以上、3.45％以上、3.50％以上、3.55％以上或3.57％以上等，优选0.4％以上。干燥叶每单位质量的rebd的比例的上限并无特别限定，例如可为15％、10％、5％等。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联高。
[0130]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，将叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的rebm及rebd的含量以rebm/rebd的比率进行表示时，rebm/rebd的值的下限为0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.8以上、1.0以上。另一方面，rebm/rebd的值的上限为0.3以下、0.4以下、0.5以下、0.6以下、0.8以下、1.0以下、1.1以下、1.2以下。就该下限与上限的组合而言，只要为上限值高于下限值的组合即可，并无特别限定，优选为0.2以上且1.2以下，或0.6以上且1.1以下。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联高。
[0131]
在一种方式中，就本发明的植物体而言，将叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中的rebm及rebd的含量作为相对于甜菊醇糖苷总量的比率，以(rebd rebm)/tsg％进行表示时，(rebd rebm)/tsg的值的下限为14％以上、16％以上、18％以上、20％以上、22％以上、24％以上、26％以上、28％以上、30％以上、32％以上、34％以上、36％以上、38％以上。另一方面，(rebd rebm)/tsg的值的上限为18％以下、20％以下、22％以下、24％以下、26％以下、28％以下、30％以下、32％以下、34％以下、36％以下、38％以下、40％以下。就该下限与上限的组合而言，只要为上限值高于下限值的组合即可，并无特别限定，优选为14％以上且40％以下，或者16％以上且40％以下。如实施例所示，遗传性状b与该方式的关联高。
[0132]
rebd及rebm可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应，以萃取液的状态进行萃取。萃取条件等可参照ohta et al.,j.appl.glycosci.,vol.57,no.3,199
‑
209(2010)或wo2010/038911中所述的方法或后述实施例中所述的方法。
[0133]
进一步，相对于如此而得的萃取液，可通过使用乙酸乙酯以及其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography:hplc)、气相色谱法、飞行时间型质量分析(time
‑
of
‑
flight mass spectrometry:tof
‑
ms)、超高效液相色谱法(ultra(high)performance liquid chromatography:uplc)等公知的方法来提纯rebd。
[0134]
rebd或rebm的含量可通过上述ohta et al.或wo2010/038911中所述的方法或后述的实施例中所述的方法来测定。具体而言，可从本发明的甜菊植物体采集新鲜叶作为样本，并通过实施lc/ms
‑
ms来测定。
[0135]
本发明的植物体不仅包含植物体整体，还可包含植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵状组织等)或各种形态的植物细胞(例如悬浊培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。此外，叶也可为上述干燥叶。
[0136]
此外，本发明的植物体还可包含组织培养物或植物培养细胞。这是因为通过培养这样的组织培养物或植物培养细胞，可再生植物体。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的示例，可列举胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根尖、花瓣、原生质体、叶的切片及愈伤组织等，但并不限定于此。
[0137]
2.本发明的植物体的制作方法
[0138]
本发明在其他实施方式中，提供一种比野生型花粉形成能力低的甜菊植物体的制作方法(以下，有时称“本发明的制作方法”)，其特征在于，包含使本发明的甜菊植物体与第2甜菊植物体杂交的工序。
[0139]
通过该方法制作的“比野生型花粉形成能力低的甜菊植物体”与本发明的植物体具有相同表型和遗传性质。
[0140]
通过本发明的制作方法获得的植物体的花粉形成能力、rebd及rebm含量的范围等，如关于本发明的植物体中所述。
[0141]
在一种方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x。在一种方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状a。在其他方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状b。在其他方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状c或d。在优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x和遗传性状a。在其他优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x和遗传性状b。在其他优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x和遗传性状c或d。在其他优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状b。在其他优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状c或d。在其他优选方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x、遗传性状b和遗传性状c或d。在更优选的方式中，通过本发明的制作方法获得的植物体具有本发明的遗传性状x、a、b及c或d的全部。
[0142]
在本发明的制作方法中，所谓“使其杂交”是指通过使本发明的植物体(第一代(s1))和第2植物体(s1)交配获得其子植物体(根据本发明的制作方法制作的植物体(第二代(s2)))。作为杂交方法，优选回交。所谓“回交”是使在本发明的植物体和第2植物体之间诞生的子植物体(s2)进一步与本发明的植物体(即，具有本发明的遗传性状的植物体)(s1)
杂交，制作具有本发明的基因的特征的植物体的方法。本发明的制作方法中使用的第2植物体(s1)与本发明的植物体具有相同的表型和遗传性质时实质上为回交。
[0143]
或者，本发明的植物体也可通过自体受精进行制作。自体受精可通过使本发明的植物体的雄蕊的花粉向本发明的植物体的雌蕊自花传粉来实施。
[0144]
根据本发明的制作方法制作的植物体的表型及遗传性质与本发明的植物体相同，因此通过使根据本发明的制作方法制作的植物体进一步与第3甜菊植物体杂交，也可制作与本发明的植物体具有相同表型的甜菊植物体。
[0145]
作为其他方式，本发明的植物体也可通过对上述组织培养物或植物培养细胞进行培养而再生植物体的方式制作。关于培养条件，与野生型甜菊植物的组织培养物或植物培养细胞的培养条件相同，是公知的(protocols for in vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants,method in molecular biology,vo.1391,pp113
‑
123)。
[0146]
进一步，作为其他方式，本发明的植物体也可通过向甜菊植物体的基因组中导入本发明的变异来制作。变异的导入可通过转基因的方法来实施，也可通过非转基因的方法来实施。作为“非转基因的方法”的示例，可列举不导入外来基因而诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因变异的方法。作为那样的方法可列举使植物细胞的诱变剂产生作用的方法。作为那样的诱变剂，可列举甲磺酸乙酯(ems)及叠氮化钠等。例如甲磺酸乙酯(ems)可以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度对植物细胞进行处理。处理时间为1～48小时、2～36小时、3～30小时、4～28小时、5～26小时、6～24小时。处理流程自身为公知的，可通过使经过吸水过程的吸水种子在以上述浓度含有诱变剂的处理液中浸渍上述处理时间来实施。
[0147]
或者，作为非转基因的方法的示例，也可为使x射线、γ射线、紫外线等放射线或光线照射植物细胞的方法。此时，将用适当的紫外线的照射量(紫外线灯强度、距离、时间)进行照射后的细胞以选择培养基等培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。此时的照射强度为0.01～100gr、0.03～75gr、0.05～50gr、0.07～25gr、0.09～20gr、0.1～15gr、0.1～10gr、0.5～10gr、1～10gr，照射距离为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间根据放射线的种类或作为照射对象的状态(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，只要为本领域技术人员则可进行适当调整。
[0148]
此外，细胞融合、花药培养(单倍体培养)、远系杂交(单倍体培养)等方法也是公知的。
[0149]
一般而言，植物细胞由于有时在培养期间伴随变异，因此为了维持更稳定的性状优选恢复为植物个体。
[0150]
以本发明的植物体为宿主，事后进行转基因(例如通过基因组编辑等)而得的植物体(例如，以本发明的植物体为宿主实施转基因，进一步附加了其他性状的植物体)也不从本发明的范围中排除。
[0151]
具有多个不同本发明的遗传性状的植物体，可通过使互相具有不同本发明的遗传性状的植物体杂交来制作。例如，具有本发明的遗传性状x和a的植物体，可通过使具有本发
明的遗传性状x的植物体与具有本发明的遗传性状a的植物体杂交来获得。具有本发明的遗传性状x和b的植物体、具有本发明的遗传性状x和c或d的植物体、具有本发明的遗传性状a和b的植物体、具有本发明的遗传性状a和c或d的植物体及具有本发明的遗传性状b和c或d的植物体等也可通过同样的杂交来获得。此外，例如具有本发明的遗传性状x、a和b的植物体可通过使具有本发明的遗传性状x和a的植物体与具有本发明的遗传性状b的植物体杂交、使具有本发明的遗传性状x和b的植物体与具有本发明的遗传性状a的植物体杂交及使具有本发明的遗传性状x的植物体与具有本发明的遗传性状a和b的植物体杂交等来获得。具有本发明的遗传性状x、b和c或d的植物体、具有本发明的遗传性状a、b和c或d的植物体等也可通过同样的杂交来获得。杂交优选横跨二代以上来实施，而遗传性状为异型接合性等时，有时通过一代即可获得具有所期望的遗传性状的组合。
[0152]
3.本发明的植物体的筛选方法
[0153]
本发明的植物体及与本发明的植物体具有相同表型和遗传性质的植物体，可通过从该植物体的组织中检测本发明的遗传性状来筛选。此时，“筛选”是指，对本发明的植物体和其以外的植物体进行识别，并选择本发明的植物体。
[0154]
从而，本发明在其他侧面提供一种花粉形成能力低的甜菊植物体的筛选方法(以下，有时称“本发明的筛选方法”)，其特征在于，包含从被检测植物的基因组中，检测存在及/或不存在本发明的遗传性状x、a、b、c及d的至少1种的工序。
[0155]
在一种方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x。在其他方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状a。在其他方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状b。在其他方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状c。在其他方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状d。在优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x和遗传性状a。在其他优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x和遗传性状b。在其他优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x和遗传性状c或d。在其他优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状b。在其他优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x、遗传性状a和遗传性状c或d。在其他优选方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x、遗传性状b和遗传性状c或d。在更优选的方式中，作为检测对象的遗传性状为本发明的遗传性状x、a、b及c或d的全部。
[0156]
本发明的筛选方法可进一步包含从被检测植物中选择检测出存在上述的至少1种的遗传性状的植物体的工序。
[0157]
存在本发明的遗传性状，可通过检测存在选自以下的等位基因来确定，
[0158]
(x
‑
1)与序列号150的79位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号160、161或162的碱基序列的等位基因)，
[0159]
(x
‑
2)与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号163、164或165的碱基序列的等位基因)，
[0160]
(x
‑
3)与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号166、167或168的碱基序列的等位基因)，
[0161]
(a)与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号69的碱基序列的等位基因)，
[0162]
(b
‑
1)与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号70的碱基序列的等位基因)，
[0163]
(b
‑
2)与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号71的碱基序列的等位基因)，
[0164]
(b
‑
3)与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号72的碱基序列的等位基因)，
[0165]
(b
‑
4)与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因(例如，包含序列号73的碱基序列的等位基因)，及
[0166]
(c)与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号74的碱基序列的等位基因)，
[0167]
及/或通过检测不存在选自以下的等位基因来确定，
[0168]
(x
‑
1)与序列号151的79位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号185、186或187的碱基序列的等位基因)，
[0169]
(x
‑
2)与序列号152的65位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号188、189或190的碱基序列的等位基因)，
[0170]
(x
‑
3)与序列号153的24位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号191、192或193的碱基序列的等位基因)，
[0171]
(a)与序列号1的201位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号1的碱基序列的等位基因)，
[0172]
(b
‑
1)与序列号2的44位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号2的碱基序列的等位基因)，
[0173]
(b
‑
2)与序列号3的40位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号3的碱基序列的等位基因)，
[0174]
(b
‑
3)与序列号4的48位相当的位置的碱基为g的等位基因(例如，包含序列号4的碱基序列的等位基因)，
[0175]
(b
‑
4)与序列号5的55～72位相当的部分未缺失的等位基因(例如，包含序列号5的碱基序列的等位基因)，及
[0176]
(c)与序列号6的49位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号6的碱基序列的等位基因)。
[0177]
不存在本发明的遗传性状，可通过检测不存在选自以下的等位基因来确定，
[0178]
(x
‑
1)与序列号151的79位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号160、161或162的碱基序列的等位基因)，
[0179]
(x
‑
2)与序列号152的65位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号163、164或165的碱基序列的等位基因)，
[0180]
(x
‑
3)与序列号153的24位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号166、167或168的碱基序列的等位基因)，
[0181]
(a)与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号69的碱基序列的等位基因)，
[0182]
(b
‑
1)与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号70的
碱基序列的等位基因)，
[0183]
(b
‑
2)与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号71的碱基序列的等位基因)，
[0184]
(b
‑
3)与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号72的碱基序列的等位基因)，
[0185]
(b
‑
4)与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因(例如，包含序列号73的碱基序列的等位基因)，及
[0186]
(c)与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号74的碱基序列的等位基因)，
[0187]
及/或通过检测存在选自以下的等位基因来确定，
[0188]
(x
‑
1)与序列号151的79位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号185、186或187的碱基序列的等位基因)，
[0189]
(x
‑
2)与序列号152的65位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号188、189或190的碱基序列的等位基因)，
[0190]
(x
‑
3)与序列号153的24位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号191、192或193的碱基序列的等位基因)，
[0191]
(a)与序列号1的201位相当的位置的碱基为t的等位基因(例如，包含序列号1的碱基序列的等位基因)，
[0192]
(b
‑
1)与序列号2的44位相当的位置的碱基为a的等位基因(例如，包含序列号2的碱基序列的等位基因)，
[0193]
(b
‑
2)与序列号3的40位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号3的碱基序列的等位基因)，
[0194]
(b
‑
3)与序列号4的48位相当的位置的碱基为g的等位基因(例如，包含序列号4的碱基序列的等位基因)，
[0195]
(b
‑
4)与序列号5的55～72位相当的部分未缺失的等位基因(例如，包含序列号5的碱基序列的等位基因)，及
[0196]
(c)与序列号6的49位相当的位置的碱基为c的等位基因(例如，包含序列号6的碱基序列的等位基因)。
[0197]
作为本发明的遗传性状的检测方法的具体例，可列举pcr法、taqman pcr法、测序法、微阵列法、invader法、tilling法、rad法、rflp法、pcr
‑
sscp法、aflp法、sslp法、caps法、dcaps法、aso法、arms法、dgge法、ccm法、dol法、maldi
‑
tof/ms法、tdi法、锁式探针法、分子信标法、dash法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe法、vset法、survivor assay、sniper assay、luminex assay、good法、lcx法、snapshot法、mass array法、pyrosequencing法、snp
‑
it法、熔解曲线分析法等，但并不限定于这些。
[0198]
在pcr法的情况下，优选制作3’末端部分具有与本发明的多态性部位互补的序列的引物。若使用这样设计的引物，当作为模板的样本具有多态性时，由于引物完全与模板杂交，发生聚合酶延伸反应，模板不具有本发明的变异时，由于引物的3’末端的核苷酸与模板产生不匹配，不发生延伸反应。从而，使用这样的引物实施pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳等对扩增产物进行分析，若能确认规定大小的扩增产物，则作为样本的模板具有变异，扩增产
物不存在时，可判断模板不具有变异。
[0199]
或者，使本发明的多态性不和引物序列重复，且设计可使本发明的基因变异pcr扩增的引物序列，通过对扩增的核苷酸片段的碱基序列测序，可检测本发明的遗传性状。
[0200]
关于pcr及琼脂糖凝胶电泳，参考以下：sambrook,fritsch and maniatis,“molecular cloning:a laboratory manual”2nd edition(1989),cold spring harbor laboratory press。
[0201]
所谓taqman pcr法是利用基于经荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸和taq dna聚合酶的pcr反应的方法(livak,k.j.genet.anal.14,143(1999)；morris t.et al.,j.clin.microbiol.34,2933(1996))。
[0202]
所谓测序法是通过pcr使包含变异的区域扩增，使用dye terminator等对dna序列进行测序，分析变异的有无的方法(上述sambrook,fritsch and maniatis)。
[0203]
dna微阵列为核苷酸探针的一端在支持体上固定为阵列的物质，包含dna芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。通过使用包含与本发明的多态性互补的序列的探针可详尽地检测本发明的多态性的有无。作为dna芯片等dna微阵列测定可列举基因芯片测定(affymetrix公司；参考美国专利第6,045,996号，同第5,925,525号及同第5,858,659号)。基因芯片技术为利用贴附于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列的技术。
[0204]
所谓invader法为组合：对于snp等多态性的各自的等位基因呈特异性的2种reporter探针及1种invader探针向模板dna的杂交，和基于具有识别dna的结构并切断的特殊的核酸内切酶活性的cleavase酶的dna的切断的方法(livak,k.j.biomol.eng.14,143
‑
149(1999)；morris t.et al.,j.clin.microbiol.34,2933(1996)；lyamichev,v.et al.,science,260,778
‑
783(1993)等)。
[0205]
所谓tilling(targeting induced local lesions in genomes)法为，通过pcr扩增和celi核酸酶处理对导入变异的突变体群体的基因组中的变异不匹配进行筛选的方法。
[0206]
在一种方式中，本发明的遗传性状x
‑
1可通过caps法进行检测，并无限定，该caps法使用可对包含序列号160～162的任一项中记载的序列的区域进行扩增的引物集，和序列号160～162的多核苷酸会切断，但序列号185～187的多核苷酸不会切断的限制酶(例如，alui)，或序列号160～162的多核苷酸不会切断，但序列号185～187的多核苷酸会切断的限制酶。作为引物集的非限定例，可列举以下引物集。
[0207]
正向引物：acggtttacatctctcagtcatctc(序列号169)
[0208]
反向引物：gccacgtcattataatcatccacaa(序列号170)
[0209]
在一种方式中，本发明的遗传性状x
‑
2可通过caps法进行检测，并无限定，该caps法使用可对包含序列号163～165的任一项中记载的序列的区域进行扩增的引物集，和序列号163～165的多核苷酸会切断，但序列号188～190的多核苷酸不会切断的限制酶(例如，tsp45i)，或序列号163～165的多核苷酸不会切断，但序列号188～190的多核苷酸会切断的限制酶。作为引物集的非限定例，可列举以下引物集。
[0210]
正向引物：acggtttacatctctcagtcatctc(序列号169)
[0211]
反向引物：gtcgagcttacaaaaccatttacca(序列号175)
[0212]
在一种方式中，本发明的遗传性状x
‑
3可通过使用以下引物集和限制酶的dcaps法进行检测，并无限定。
[0213]
·
引物集：
[0214]
一种引物集，其包含一种正向引物和一种反向引物，其中正向引物包含自序列号181或184的257位起位于5’侧的任意的连续的15碱基以上的序列(例如，序列号169)，反向引物包含从选自序列号180、194～201中的序列的3’末端起15～29碱基长的连续序列。引物的序列可在满足上述条件的范围内进行最优化。关于引物设计的最优化参考例如上述sambrook and russell，“molecular cloning：a laboratory manual”3rd edition(2001)，cold spring harbor laboratory press等。此外，上述各引物可为15～50碱基长、18～48碱基长、20～45碱基长、30～65碱基长等。
[0215]
·
限制酶：
[0216]
以下示出与序列号180、194～201各自对应的限制酶。
[0217]
[表1]
[0218]
表1与反向引物中所含的序列对应的限制酶
[0219]
反向引物中所含的序列限制酶aaagtctcttgtgttgaaattctggggcc(序列号180)nlaliiaaagtctcttgtgttgaaattctggggcc(序列号194)bsrdiaaagtctcttgtgttgaaattctggggcc(序列号195)ms1iaaagtctcttgtgttgaaattctggcggc(序列号196)bsphiaaagtctcttgtgttgaaattctggggcg(序列号197)claiaaagtctcttgtgttgaaattctgccgct(序列号198)cviriaaagtctcttgtgttgaaattctggtgca(序列号199)swaiaaagtctcttgtgttgaaattctggagct(序列号200)vspiaaagtctcttgtgttgaaattctggagac(序列号201)hinfiii
[0220]
在特定方式中，本发明的遗传性状x
‑
3可通过使用以下引物集和限制酶的dcaps法进行检测。
[0221]
[表2]
[0222]
表2引物集和限制酶的组合
[0223]
正向引物的序列反向引物的序列限制酶序列号169序列号180nlalii序列号169序列号194bsrdi序列号169序列号195ms1i序列号169序列号196bsphi序列号169序列号197clai序列号169序列号198cviri序列号169序列号199swai序列号169序列号200vspi序列号169序列号201hinfiii
[0224]
在一种方式中，本发明的遗传性状a可通过caps法进行检测，并无限定，该caps法使用可对包含序列号19～21的任一项中记载的序列的区域进行扩增的引物集，和序列号19～21的多核苷酸会切断，但序列号75～77的多核苷酸不会切断的限制酶或序列号19～21的
多核苷酸不会切断，但序列号75～77的多核苷酸会切断的限制酶(例如hpy188i)。作为引物集的非限定例，可列举以下引物集。
[0225]
正向引物：atggtttgggaatagctctgttgtt(序列号37)
[0226]
反向引物：agaactttgttcttgaacctcttg(序列号38)
[0227]
在一种方式中，本发明的遗传性状b可通过使用以下引物集和限制酶的dcaps法进行检测，并无限定。
[0228]
(b
‑
1)一种引物集，包含：包含序列号45所示的碱基序列的正向引物及包含序列号46所示的碱基序列的反向引物，
[0229]
(b
‑
2)一种引物集，包含：包含序列号50所示的碱基序列的正向引物及包含序列号51所示的碱基序列的反向引物，
[0230]
(b
‑
3)一种引物集，包含：包含序列号55所示的碱基序列的正向引物及包含序列号56所示的碱基序列的反向引物，或
[0231]
(b
‑
4)一种引物集，包含：包含序列号60所示的碱基序列的正向引物及包含序列号61所示的碱基序列的反向引物。
[0232]
其中，引物集并不限定于具有序列号45、46、50、51、55、56、60或61的序列，例如，作为正向引物，只要在3’末端具有从序列号45、50、55或60的3’侧末端开始至上游15个碱基为止的序列(参考下表)即可，作为反向引物，只要在3’末端具有从序列号46、51、56或61的3’侧末端开始至上游15个碱基为止的序列(参考下表)即可。这样的引物可为15～50个碱基长、20～45个碱基长的长度。
[0233]
[表3]
[0234]
表3引物集的例子
[0235][0236]
引物集并不限定于具有序列号45、46、50、51、55、56、60或61的序列，例如，作为正向引物，只要具有或包含序列号45、50、55、或60中的任意连续的15个碱基以上的序列即可，作为反向引物，只要具有或包含序列号46、51、56或61中的任意连续的15个碱基以上的序列即可。
[0237]
(b
‑
1”)一种引物集，包含：具有或包含序列号45中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物及具有或包含序列号46中的任意连续的15个碱基以上的序列的反向引物，
[0238]
(b
‑
2”)一种引物集，包含：具有或包含序列号50中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物及具有或包含序列号51中的任意连续的15个碱基以上的序列的反向引物，
[0239]
(b
‑
3”)一种引物集，包含：具有或包含序列号55中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物及具有或包含序列号56中的任意连续的15个碱基以上的序列的反向引物，
或者(b
‑
4”)一种引物集，包含：具有或包含序列号60中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物及具有或包含序列号61中的任意连续的15个碱基以上的序列的反向引物。
[0240]
这样的引物，只要上述任意连续的15个碱基以上的序列存在于3’侧末端即可，可为15～50个碱基长、20～45个碱基长、30～65个碱基长的长度。
[0241]
作为与上述引物组合的限制酶，可列举以下限制酶。
[0242]
[表4]
[0243]
表4与引物组合的限制酶
[0244]
引物限制酶b
‑
1、(b
‑1’
)、(b
‑
1”)kpnib
‑
2、(b
‑2’
)、(b
‑
2”)xbaib
‑
3、(b
‑3’
)、(b
‑
3”)aflii
[0245]
在一种方式中，本发明的遗传性状c或d可通过使用以下引物集和限制酶的dcaps法进行检测。
[0246]
·
引物集
[0247]
一种引物集，其包含一种正向引物和一种反向引物，其中正向引物包含位于3’末端的选自序列号86～109、150中的序列和以任意选择附加于所述序列的5’末端的从序列号6的28位起向5’侧接续的任意的连续序列(例如，任意长度的连续序列)，反向引物包含与自序列号6的50位起位于3’侧的任意的连续的20碱基以上的序列互补的序列(例如，序列号65、110)。引物的序列可在满足上述条件的范围内进行最优化。关于引物设计的最优化参考例如上述sambrook and russell等。此外，上述各引物可为15～50碱基长、18～48碱基长、20～45碱基长、30～65碱基长等。
[0248]
·
限制酶
[0249]
以下示出与序列号86～109、150各自对应的限制酶。另外，下述序列中，“r”表示a或g，“y”表示c或t。
[0250]
[表5]
[0251]
表5与正向引物中所含的序列对应的限制酶
[0252]
正向引物中所含的序列限制酶ttcaggtaataaaaggcctt(序列号86)ddeittcaggtaataaaaggcact(序列号87)maei/speittcaggtaataaaaggctta(序列号88)aflii/mseittcaggtaataaaaggcttg(序列号89)bce83ittcaggtaataaaaggcctc(序列号90)bsemiittcaggtaataaaaggcacg(序列号91)bsiittcaggtaataaaagtcatg(序列号92)bsphi/hpy178iiittcaggtaataaaaggctrt(序列号93)sfeittcaggtaataaaaggcttr(序列号94)sm1ittcaggtaataaaaggcagc(序列号95)ecop15ittcaggtaataaaaggcycg(序列号96)avaittcaggtaataaaagtgatc(序列号97)bcli
ttcaggtaataaaagggagg(序列号98)bserittcaggtaataaaaggctgc(序列号99)cviri/pstittcaggtaataaaaggaacc(序列号100)drdiittcaggtaataaaaggctga(序列号101)eco57ittcaggtaataaaaggctgg(序列号102)gsuittcaggtaataaaaggggtg(序列号103)hphittcaggtaataaaaggtctg(序列号104)hpy188ittcaggtaataaaagggaag(序列号105)mboiittcaggtaataaaaggtcgt(序列号106)pflll08ittcaggtaataaaagttata(序列号107)psiittcaggtaataaaaggctcg(序列号108)taqi/xhoittcaggcgataaaaggcgtt(序列号109)styskittcaggtaataaaaggcatt(序列号150)spei
[0253]
在特定方式中，本发明的遗传性状c或d可通过使用以下引物集和限制酶的dcaps法进行检测。
[0254]
[表6]
[0255]
表6引物集与限制酶的组合
[0256]
正向引物的序列反向引物的序列限制酶序列号64序列号65spei序列号111序列号65ddei序列号112序列号65maei/spei序列号113序列号65aflii/msei序列号114序列号65bce83i序列号115序列号65bsemii序列号116序列号65bsii序列号117序列号65bsphi/hpy178iii序列号118序列号65sfei序列号119序列号65smli序列号120序列号65ecop15i序列号121序列号65avai序列号122序列号65bcli序列号123序列号65bseri序列号124序列号65cviri/psti序列号125序列号65drdii序列号126序列号65eco57i序列号127序列号65gsui序列号128序列号65hphi序列号129序列号65hpy188i序列号130序列号65mboii
序列号131序列号65pfl1108i序列号132序列号65psii序列号133序列号65taqi/xhoi序列号134序列号65stvski
[0257]
本发明的筛选方法可进一步包含评价检测出本发明的遗传性状的被检测甜菊植物的花粉形成能力的工序。花粉形成能力的评价，如本发明的植物体的项目所述。此外，在该方式中，从检测出本发明的遗传性状的被检测甜菊植物体中，选择花粉形成能力低的个体，使其与其他甜菊植物体交配，对于所得子植物体，也可适用本发明的筛选方法。从而，本发明的筛选方法可包含以下1个以上的工序。
[0258]
(i)从被检测甜菊植物的基因组中，检测本发明的遗传性状(例如，本发明的遗传性状x)的工序，
[0259]
(ii)评价检测出本发明的遗传性状的被检测甜菊植物组织的花粉形成能力的工序，
[0260]
(iii)在检测出本发明的遗传性状的被检测甜菊植物体中，选择花粉形成能力低的个体的工序，
[0261]
(iv)使所选择的花粉形成能力低的个体与其他甜菊植物体交配的工序，
[0262]
(v)从通过交配而得的子植物体的基因组中，检测本发明的遗传性状(例如，本发明的遗传性状x)的工序，
[0263]
(vi)评价检测出本发明的遗传性状的子植物组织的花粉形成能力的工序，
[0264]
(vii)在检测出本发明的遗传性状的子植物体中，选择花粉形成能力低的个体的工序。
[0265]
所选择的花粉形成能力低的个体，例如，可为检测出本发明的遗传性状的被检测甜菊植物体中，花粉形成能力低至排名前50％为止、排名前40％为止、排名前30％为止、排名前20％为止、排名前10％为止、排名前5％为止、排名前4％为止、排名前3％为止、排名前2％为止或排名前1％为止的个体等。此外，进行交配的其他甜菊植物体，可含也可不含本发明的遗传性状。上述方式中，工序(iv)～(vii)可重复数次。如此，可筛选花粉形成能力更低的甜菊植物体。
[0266]
在本发明的筛选方法中，被检测甜菊植物体可为天然植物体，也可为非转基因植物体。关于非转基因植物体，如本发明的植物体的项目中所述。
[0267]
在本发明的筛选方法中，被检测甜菊植物体可包含经突变诱发处理的甜菊植物及其后代植物。关于突变诱发处理，如本发明的植物体的项目中所述，包含基于诱变剂的处理、基于放射线或光线的照射的处理等。
[0268]
此外，本发明提供上述记载的引物集，例如包含上述序列号169的正向引物和序列号170的反向引物的引物集、包含上述序列号169的正向引物和序列号175的反向引物的引物集、上述表2中记载的引物集、包含上述序列号37的正向引物和序列号38的反向引物的引物集、选自上述(b
‑
1)～(b
‑
4)、(b
‑1’
)～(b
‑4’
)及(b
‑
1”)～(b
‑
4”)中的任意1个以上的引物集，及/或上述表6中记载的引物集。本发明进一步提供可通过pcr对具有选自序列号151～153、202～204、1～6、69～74中的碱基序列的区域进行扩增的引物集，例如，包含序列号154的碱基序列的正向引物和包含序列号155的碱基序列反向引物的引物集、包含序列号156的
碱基序列正向引物和包含序列号157的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号158的碱基序列的正向引物和包含序列号159的碱基序列的反向引物的引物集，包含序列号7的碱基序列的正向引物和包含序列号8的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号9的碱基序列的正向引物和包含序列号10的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号11的碱基序列的正向引物和包含序列号12的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号13的碱基序列的正向引物和包含序列号14的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号15的碱基序列的正向引物和包含序列号16的碱基序列的反向引物的引物集、包含序列号17的碱基序列的正向引物和包含序列号18的碱基序列的反向引物的引物集。
[0269]
进一步本发明提供一种可检测本发明的遗传性状的存在及/或不存在的探针(以下，有时称“本发明的探针”)。本发明的探针可具有适用于存在及/或不存在本发明的遗传性状的各种检测方法的结构。例如，本发明的探针可包含与包含本发明的变异部位的基因组的部分具有互补性的碱基序列。作为涉及的探针的非限定例，可列举包含选自序列号160～168、185～193、19～36、75～77、135～149中的碱基序列的探针。这些序列中，序列号160～168、19～36对于包含本发明的变异的等位基因呈特异性，序列号185～193、75～77、135～149对于不包含本发明的变异的等位基因呈特异性。存在本发明的遗传性状可通过检测出包含本发明的变异的等位基因及/或未检测出不包含本发明的变异的等位基因进行检测，不存在本发明的遗传性状可通过未检测出包含本发明的变异的等位基因及/或检测出不包含本发明的变异的等位基因进行检测。本发明的探针优选具有标记。作为涉及的标记的非限定例，可列举荧光标记、发光标记、放射性标记、色素、酶、失活剂(quencher)、与可以检测的标记结合的部分等。在特定方式中，本发明的探针具有与选自序列号160～168、185～193、19～36、75～77、135～149中的碱基序列互补的碱基序列和标记。
[0270]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含引物集及限制酶，其中引物集为可对包含序列号160～162的任一项所述的序列的区域进行扩增的引物集，例如，包含：包含序列号169的碱基序列的正向引物和包含序列号170的碱基序列的反向引物的组合的引物集，限制酶为切断序列号160～162的多核苷酸但不会切断序列号185～187的多核苷酸的限制酶(例如，alui)或不切断序列号160～162的多核苷酸但会切断序列号185～187的多核苷酸的限制酶。
[0271]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含引物集及限制酶，其中引物集为可对包含序列号163～165的任一项所述的序列的区域进行扩增的引物集，例如，包含：包含序列号169的碱基序列的正向引物和包含序列号175的碱基序列的反向引物的组合的引物集，限制酶为切断序列号163～165的多核苷酸但不会切断序列号188～190的多核苷酸的限制酶(例如，tsp45i)或不切断序列号163～165的多核苷酸但会切断序列号188～190的多核苷酸的限制酶。
[0272]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含引物集，例如表2中记载的引物集，及与其对应的限制酶，其中引物集包含：包含自序列号181的257位起位于5’侧的任意的连续的15碱基以上的序列(例如，序列号169)的正向引物，和包含从选自序列号180、194～201中的序列的3’末端起15～25碱基长的连续序列的反向引物。
[0273]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含引物集及限制酶，其中引物集为可对包含序列号19～21的任一项所述的序列的区域进行扩增的引物
集，例如，包含：包含序列号7的碱基序列的正向引物和包含序列号8的碱基序列的反向引物的组合的引物集，限制酶为切断序列号19～21的多核苷酸但不会切断序列号75～77的多核苷酸的限制酶或不切断序列号19～21的多核苷酸但会切断序列号75～77的多核苷酸的限制酶(例如，hpy188i)。
[0274]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含选自上述(b
‑
1)～(b
‑
4)、(b
‑1’
)～(b
‑4’
)及(b
‑
1”)～(b
‑
4”)中的任意1种以上的引物集，并根据情况而包含限制酶。
[0275]
在该试剂盒中，使用选自(b
‑
1)、(b
‑1’
)及(b
‑
1”)中的任意1种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为kpni。
[0276]
在该试剂盒中，使用选自(b
‑
2)、(b
‑2’
)及(b
‑
2”)中的任意1种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为xbai。
[0277]
在该试剂盒中，使用选自(b
‑
3)、(b
‑3’
)及(b
‑
3”)中的任意1种以上的引物集时，所述试剂盒中所含限制酶为aflii。
[0278]
本发明进一步提供一种试剂盒，例如筛选用试剂盒，其特征在于，包含引物集，例如上述表6中记载的引物集，及与其对应的限制酶，其中引物集包含：包含位于3’末端的选自序列号86～109、150中的序列，以任意选择附加在所述序列的5’末端的自序列号6的28位向5’侧接续的任意的连续序列(例如，任意长度的连续的序列)的正向引物，和包含与自序列号6的50位起位于3’侧的任意的连续的20碱基以上的序列互补的序列(例如，序列号65、110)的反向引物。
[0279]
在该试剂盒的其他方式中，
[0280]
上述引物集包含：具有或包含序列号45中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物时，上述限制酶包含kpni，
[0281]
上述引物集包含：具有或包含序列号50中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物时，上述限制酶包含xbai，
[0282]
上述引物集包含：具有或包含序列号55中的任意连续的15个碱基以上的序列的正向引物时，上述限制酶包含aflii。
[0283]
本发明还提供一种筛选用试剂盒，其特征在于，包含可通过pcr对具有选自序列号160～168、185～193、1～6、19～36、69～77、135～149中的碱基序列的区域进行扩增的引物集和本发明的探针。
[0284]
这些引物集、探针及试剂盒可用于本发明的遗传性状的检测，用于本发明的筛选方法等。此外，在这些引物集及试剂盒中可包含记录有以下内容的媒体：包含与本发明的遗传性状的检测或本发明的筛选方法相关的说明的指示，例如，与使用说明书或使用方法相关的信息，该媒体例如为软盘、cd、dvd、蓝光光盘、存储卡、usb存储器等。
[0285]
5.来自植物体的萃取物的制造方法及使用该萃取物的制品
[0286]
在本发明的进一步的方式中，提供一种甜菊萃取物的制造方法(以下，有时称“本发明的萃取物的制造方法”)，其特征在于，包含从本发明的植物体或该植物体的种子或者叶(例如，干燥叶或新鲜叶)中获得萃取物的工序。进一步提供一种甜菊醇糖苷精制品的制造方法(以下，有时称“本发明的甜菊醇糖苷精制品的制造方法”)，其特征在于，包含从通过本发明的萃取物的制造方法获得的萃取物中提纯甜菊醇糖苷的工序。
[0287]
具体而言，提供一种甜菊醇糖苷精制品的制造方法，其特征在于，包含从本发明的甜菊植物体、通过本发明的筛选方法筛选的甜菊植物体或通过本发明的方法制造的甜菊植物体中获得含有甜菊醇糖苷的萃取物的工序，及从所得萃取物中提纯甜菊醇糖苷的工序。
[0288]
含有甜菊醇糖苷的萃取物可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干燥叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)反应来获得。萃取条件等可参考上述ohta et al或wo2010/038911中所述的方法或后述的实施例中所述的方法。
[0289]
此外，可通过用乙酸乙酯及其他有机溶剂：水的梯度、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography:hplc)、气相色谱法、飞行时间型质量分析(time
‑
of
‑
flight mass spectrometry:tof
‑
ms)、超高效液相色谱法(ultra(high)performance liquid chromatography:uplc)等公知的方法对含有甜菊醇糖苷的萃取物进行各个甜菊醇糖苷的提纯。
[0290]
作为甜菊醇糖苷，可列举reba、rebb、rebc、rebd、rebe、rebf、rebi、rebj、rebk、rebm、rebn、rebo、rebq、rebr、杜克苷a、甜叶悬钩子苷、甜菊醇糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷等。在一种方式中，甜菊醇糖苷包含reba、rebb、rebc、rebd、rebe、rebf、rebm、rebn、rebo、甜菊苷、甜菊双糖苷、甜叶悬钩子苷、杜克苷a或它们的组合。在优选方式中，甜菊醇糖苷包含rebd、rebm或它们的组合。
[0291]
根据本发明的萃取物的制造方法所得的萃取物(以下，称“本发明的萃取物”)的一种方式与野生型甜菊种相比以更高含量含有rebd、rebm或该两者。
[0292]
本发明的萃取物与从野生型甜菊种中获得的萃取物相比，可以300％以上、400％以上、500％以上、600％以上、700％以上、800％以上、900％以上、1100％以上、1200％以上、1300％以上、1400％以上、1500％以上、1600％以上、1700％以上、1800％以上、1900％以上、2000％以上、2100％以上、2200％以上、2300％以上、2400％以上、2500％以上、2600％以上、2700％以上、2800％以上、2900％以上、3000％以上、3100％以上、3200％以上、3300％以上、3400％以上、3500％以上、3600％以上、3700％以上、3800％以上、3900％以上、4000％以上、4100％以上、4200％以上、4300％以上、4400％以上、4500％以上、4600％以上、4700％以上、4800％以上、4900％以上、5000％以上的高含量含有rebd、rebm或该两者。在此，本发明的萃取物与从野生型甜菊种中获得的萃取物，可通过相同方法获得。
[0293]
通过将如此获得的本发明的萃取物及/或通过本发明的甜菊醇糖苷精制品的制造方法获得的甜菊醇糖苷精制品(例如rebd及/或rebm)与其他成分混合，可制造含有甜菊醇糖苷的医药品、香料或饮食品。于是，本发明，作为其他实施方式，提供一种医药品、香料或饮食品的制造方法，其特征在于，包含将本发明的萃取物及/或通过本发明的甜菊醇糖苷精制品的制造方法获得的甜菊醇糖苷精制品与其他成分混合的工序。进一步，本发明提供一种医药品、香料或饮食品，其特征在于，含有通过所述制造方法获得的甜菊醇糖苷。此处，饮食品是指饮料及食品。从而，在某种实施方式中，本发明提供一种医药品、香料、饮料或食品，还提供一种该医药品、香料、饮料或食品的制造方法。
[0294]
6.本发明的植物体涉及的碱基序列
[0295]
本发明在其他实施方式中，提供本发明的甜菊植物体涉及的碱基序列。
[0296]
具有遗传性状x
‑
1的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号160～162、202的碱基序列或由其构成。具有遗传性状x
‑
2的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号
163～165、203的碱基序列或由其构成。具有遗传性状x
‑
3的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号166～168、204的碱基序列或由其构成。具有遗传性状a的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号19～21、69的碱基序列或由其构成。具有遗传性状b
‑
1的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号22～24、70的碱基序列或由其构成。具有遗传性状b
‑
2的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号25～27、71的碱基序列或由其构成。具有遗传性状b
‑
3的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号28～30、72的碱基序列或由其构成。具有遗传性状b
‑
4的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号31～33、62、73的碱基序列或由其构成。具有遗传性状c或d的甜菊植物体涉及的碱基序列，包含选自序列号34～36、74的碱基序列或由其构成。
[0297]
实施例
[0298]
以下对本发明涉及的实施例等进行记载，但本发明并不限定于这些具体的方式。
[0299]
[实施例1]rebm含量与遗传性状b的关联性的验证(1)
[0300]
以市售甜菊种子为基础，以生育状况、叶形态、总甜菊醇糖苷(tsg)、reba、rebd、rebm的含量等为标准进行个体选拔，得到2个分离群体，第i及第ii个体组。使用来自第i个体组中的62个体，来自第ii个体组中的109个体，进行验证。基于rebm含量，将各个体分成0.2％以上、0.1％以上～低于0.2％、0％以上～低于0.1％的3组，调查有无遗传性状b
‑
1。具体而言，使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(kpni)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0301]
引物的序列如下所示。
[0302]
正向引物：5
’‑
taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtac
‑3’
(序列号45)
[0303]
反向引物：5
’‑
gaggaagacattggcaactc
‑3’
(序列号46)
[0304]
对所得pcr产物(约297bp长)实施kpni限制酶处理，将未产生约260bp的限制酶处理产物(例如，序列号49)的个体作为b
‑
1阳性。结果，含有0.2％以上的组通过本遗传性状而优先检测出，证明阳性个体的出现频率在组间在统计上显著不同(基于卡方检验的一致性检验，无效假设设定标记检验结果和表型无相关性而频率分布均等。检验结果参考下表)。
[0305]
[表7]
[0306]
表7第i个体组的检验结果(62个体)
[0307][0308]
卡方检验结果(df＝2)36.81
**
[0309]
[表8]
[0310]
表8第ii个体组的检验结果(109个体)
[0311][0312]
卡方检验结果(df＝2)75.94
**
[0313]
[实施例2]rebm含量与遗传性状b的关联性的验证(2)
[0314]
使用遗传性状b实施高rebm植物体的选拔时，除验证用群体以外，在分离群体中，如下表所示也可选拔rebm比率为2％以上的个体，确认可作为实用的选拔标记。高rebm植物体的选拔结果示于下表。表中的
“○”
表示遗传性状b的检验结果为阳性。
[0315]
另外，遗传性状b
‑
1以与实施例1相同的方式检测，遗传性状b
‑
2～b
‑
4以以下方式检测。
[0316]
在遗传性状b
‑
2的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(xbai)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0317]
引物的序列如下所示。
[0318]
正向引物：5
’‑
aaggttctttatttttaaacttatgttaatttattgtatctag
‑3’
(序列号50)
[0319]
反向引物：5
’‑
ccttatgtacacatgctacac
‑3’
(序列号51)
[0320]
对所得pcr产物(约383bp长)实施xbai限制酶处理，将未产生约344bp的限制酶处理产物(例如，序列号54)的个体作为b
‑
2阳性。
[0321]
在遗传性状b
‑
3的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(aflii)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0322]
引物的序列如下所示。
[0323]
正向引物：5
’‑
cgatggtttttgctacatgaaaaccctagaagacgaaacccgcttaa
‑3’
(序列号55)
[0324]
反向引物：5
’‑
accagcaataatccttgaattag
‑3’
(序列号56)
[0325]
对所得pcr产物(约390bp长)实施aflii限制酶处理，将未产生约347bp的限制酶处理产物(例如，序列号59)的个体作为b
‑
3阳性。
[0326]
在遗传性状b
‑
4的检测中使用以下引物实施pcr，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht对pcr产物实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0327]
引物的序列如下所示。
[0328]
正向引物：5
’‑
cgcaaacacgtatactaatc
‑3’
(序列号60)
[0329]
反向引物：5
’‑
tttagcatggtatgtacaac
‑3’
(序列号61)
[0330]
将仅产生约140bp的pcr产物(例如，序列号62)的个体作为b
‑
4阳性。
[0331]
[表9]
[0332][0333]
[实施例3]高tsg甜菊植物与遗传性状c的关联性的验证
[0334]
(1)甜味成分含量高的个体的分离(m0代)
[0335]
将野生型甜菊种子(市售品种，2014年8月导入)约2000个(重量换算)分成3组，对各组实施0.1％、0.2％或0.3％的甲磺酸乙酯(ems)处理进行基因改变。
[0336]
将该经ems处理的种子及无处理的种子播种于三得利研究中心内的温室中，获得该ems处理代(m0代)苗。处理浓度间未观察到发芽率差异。
[0337]
从ems处理代(m0代)及无处理个体中采集适量的新鲜叶作为样本，通过lc/ms
‑
ms(岛津lcms8050)对甜味成分的浓度进行定量。具体而言，通过冷冻干燥对0.25g的新鲜叶进行干燥，将粉碎干燥物0.05g投入纯水中。通过20分钟超声波处理进行萃取，离心及过滤后得到0.33ml的萃取液。以lcms8050离子模式(岛津lcms8050)对萃取液实施lc/ms
‑
ms分析，对reba、rebb、rebc、rebd、rebf、rebm、rebn及rebo的浓度进行定量，将其合计作为甜味成分的浓度。将甜味成分浓度约20％的个体作为亲本个体1(p1)。此外，作为亲本个体2(p2)，选择来自其他甜菊植物体群体且干燥叶中的甜味成分浓度为5％的个体。
[0338]
(2)甜味成分高含量型个体的分离(m1代)及基因解析
[0339]
通过亲本个体1(p1)和亲本个体2(p2)的交配采集处理第一代(m1代)种子，在三得利研究中心内的温室内中播种，得到m1代苗(1603个体的分离群体)。从上述m1代个体中采集适量新鲜叶作为样本，以与上述(1)同样的方式通过lc/ms
‑
ms(岛津lcms8050)对甜味成分进行定量。结果示于图1。
[0340]
从甜味成分的含量最高的30个体(甜味成分高含量个体)与最低的30个体(甜味成分低含量个体)的新鲜叶中提取基因组dna，对仅存在于两个体组的任一方的变异进行调查。在基因组分析中检测的变异中，针对基因组信息量充分(序列覆盖为
×
5以上)，变异不连续，无序列的插入或缺失的306处变异，研究各变异存在于哪个个体。结果明确了序列号1的49位上由c向a的变异(c49a)存在于甜味成分高含量个体，但不存在于低含量个体中。
[0341]
(3)变异c49a与甜味成分含量的关系性的验证
[0342]
使以异型具有变异c49a的甜菊植物体与不具有变异c49a的甜菊植物体交配，获得2个分离群体(分离群体a(443个体)及分离群体b(446个体))。对两分离群体的各个体中有无变异c49a以及甜味成分含量进行调查。有无变异c49a的调查中使用dcaps法。从各个体中提取基因组dna，使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(spei)，于37℃下进行酶促反应。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht(perkinelmer)实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0343]
正向引物：5
’‑
ttatttaatgatccaatggagggggtgattcaggtaataaaaggcact
‑3’
(序列号112)
[0344]
反向引物：5
’‑
tgagggttctcaattgatttccgattgg
‑3’
(序列号65)
[0345]
对所得约367bp的pcr产物(例如，序列号66或67)实施spei限制酶处理，将产生约321bp的限制酶处理产物(例如，序列号68)的个体作为变异c49a阳性。
[0346]
甜味成分含量的定量以与(1)同样的方式实施。
[0347]
各分离群体的变异c49a阳性个体及阴性个体中的甜味成分含量的分布示于图2～3。由这些结果可知，变异c49a阳性个体中的甜味成分含量比各分离群体全体的甜味成分含量的平均值高。
[0348]
此外，各分离群体的变异c49a阳性个体及阴性个体中的甜味成分含量的平均值及中值总结于以下。
[0349]
[表10]
[0350]
表10各分离群体中的干燥叶中的
[0351]
甜味成分浓度的平均值及中值(％)
[0352][0353]
[实施例4]高rebd甜菊植物与遗传性状a～c的关联性的验证
[0354]
1.试验系统的制作
[0355]
使具有tsg高含量型的遗传性状的雄株(p1)与具有rebm高含量型的遗传性状的雌株(p2)交配，采集杂交种第1代(s1代)种子，在三得利研究中心内的温室内中播种，得到s1代苗。
[0356]
rebm高含量型的遗传性状具有以下的至少1种的特征。
[0357]
b
‑
1：对于与序列号2的40位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性。
[0358]
b
‑
2：对于与序列号3的44位相当的位置的碱基为t的等位基因呈同型接合性。
[0359]
b
‑
3：对于与序列号4的48位相当的位置的碱基为c的等位基因呈同型接合性。
[0360]
b
‑
4：对于与序列号5的55～72位相当的部分缺失的等位基因呈同型接合性。
[0361]
如实施例1～2所示，这些遗传性状与rebm高含量的特性相关。
[0362]
tsg高含量型的遗传性状具有以下性状。
[0363]
c：对于与序列号6的49位相当的位置的碱基为a的等位基因呈异型接合性。
[0364]
如实施例3所示，上述的遗传性状与tsg高含量的特性相关。
[0365]
此外，p1及p2均为通过甲磺酸乙酯(ems)处理而基因被改变的个体的后代。
[0366]
从p1、p2及s1代个体中采集适量新鲜叶作为样本，通过冷冻干燥对0.25g的新鲜叶进行干燥，将粉碎干燥物0.05g投入纯水中。通过20分钟超声波处理进行萃取，离心及过滤后得到0.33ml的萃取液。以lcms8050离子模式(岛津lcms8050)对萃取液实施lc/ms
‑
ms分析，对reba、rebb、rebc、rebd、rebf、rebm、rebn及rebo的浓度(相对于干燥叶的质量％)进行定量，将其合计作为总甜菊醇糖苷(tsg)浓度。结果示于下表。
[0367]
[表11]
[0368]
表11 交配亲本及s1代个体中的糖苷浓度
[0369][0370]
如上述结果所示，通过p1和p2的交配，获得以干燥叶为基础rebd含量超过3.3质量％的rebd高含量个体(s1
‑
1～s1
‑
3)。
[0371]
[实施例5]高rebd甜菊植物体特有的遗传性状的检测
[0372]
从实施例4中试验的各个体的新鲜叶中提取基因组dna，调查遗传性状b
‑
1及c的拥有状况。
[0373]
在遗传性状b
‑
1的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(kpni)，于37℃下进行酶促反应，实施基于限制酶的处理。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0374]
引物的序列如下所示。
[0375]
正向引物：5
’‑
taatcatccaaaccctaatctcgccaaacaaccgggtac
‑3’
(序列号45)
[0376]
反向引物：5
’‑
gaggaagacattggcaactc
‑3’
(序列号46)
[0377]
对所得pcr产物(约297bp长)实施kpni限制酶处理，将未产生约260bp的限制酶处理产物(例如，序列号49)的个体作为遗传性状b
‑
1阳性。
[0378]
在遗传性状c的检测中使用以下引物实施pcr，向pcr产物中添加限制酶(spei)，于37℃下进行酶促反应。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht(perkinelmer)实施电泳，根据电泳后的带型对标记进行识别。
[0379]
正向引物：5
’‑
ttatttaatgatccaatggagggggtgattcaggtaataaaaggcact
‑3’
(序列号112)
[0380]
反向引物：5
’‑
tgagggttctcaattgatttccgattgg
‑3’
(序列号65)
[0381]
对所得约367bp的pcr产物(例如，序列号66或67)实施spei限制酶处理，将产生约321bp的限制酶处理产物(例如，序列号68)的个体作为遗传性状c阳性。
[0382]
结果示于下表12。表中“〇”表示检测到对应的变异，
“×”
表示未检测到。
[0383]
[表12]
[0384]
表12
[0385][0386]
如上述结果所示，分别观察到拥有遗传性状b
‑
1的个体，与无遗传性状b
‑
1的个体相比有rebm含量高的倾向，拥有遗传性状c的个体，与无遗传性状c个体相比有tsg含量高的倾向。这是确认了基于本技术人的上述优先申请中所示的结果。
[0387]
为了找出用于识别rebd高含量个体的标记，从各个体的新鲜叶中提取基因组dna，实施基于ngs(hiseq 2500，illumina)的基因测序。结果，仅在rebd高含量个体中观察到以下遗传性状。
[0388]
a：对于与序列号1的201位相当的位置的碱基为a的等位基因呈同型接合性。
[0389]
如上述结果所示，rebd高含量个体(s1
‑
1～s1
‑
3)均拥有遗传性状a、b
‑
1及c，与无遗传性状a的个体相比，观察到rebd含量高的倾向。
[0390]
[实施例6]花粉形成能力与遗传性状x的关联性的验证
[0391]
对野生型甜菊植物系统2种(w201、w202)和作为通过基于甲磺酸乙酯(ems)的变异诱发处理而基因被改变的个体的后代的变异型甜菊植物系统1种(m201)进行插枝后，将展开8枚真叶的植物体移动到8小时照明的恒温箱中，诱导花芽。开花5～7日后，从在侧面观察花时可看到柱头的充分开花的花中采集花粉，对花粉数进行计数。结果示于下表(各处理区5朵花的平均值)。
[0392]
[表13]
[0393]
表13
[0394][0395]
如上述结果所示，m201的花粉形成能力与野生型系统相比显著较低。为了调查与该表型相关的遗传性状，确定各系统的基因序列，进行对比的结果，仅在m201中观察到遗传
性状x
‑
1～x
‑
3。
[0396]
工业实用性
[0397]
通过本发明可提供叶或甜菊醇糖苷的收率高的甜菊植物，因此可使甜菊醇糖苷的产生效率化。此外，通过本发明，由于可在花粉形成前选出花粉形成能力低的个体，因此可提高育种效率。