新型DAHP合成酶的制作方法

新型dahp合成酶
技术领域
1.本发明涉及一种新型dahp合成酶。此外，本发明涉及用于在体内筛选工程化酶突变体的方法。


背景技术：

2.微生物已被广泛改造以从可再生原料中生产增值化合物(becker等人，2015年；lee和kim，2015年；liao等人，2016年)。为此，生物合成途径的工程改造发挥着至关重要的作用。已经开发了几种基于基因表达和酶浓度调节的策略(alper等人，2005年；blazeck和alper，2013年；hwang等人，2018年；zhou和zeng，2015年)。然而，他们无法克服一些与酶本身相关的固有限制。例如，酶活性的调节机制，如反馈抑制或前馈抑制(chen等人，2018年；zurawski等人，1981)限制酶的特定活性或底物特异性(mora
‑
villalobos和zeng，2017年)。在这方面，高效途径的构建不可避免地需要蛋白质工程改造(chen等人，2013；chen等人，2011b；ger等人，1994年；林等人，2012)。
3.通常，蛋白质工程改造由三个不同的步骤组成：(i)基因突变体文库的构建；(ii)文库的筛选和(iii)候选酶突变体的进一步表征(boville等人，2018年；buller等人，2018年)(图1b)。它已被广泛和成功地用于改善许多酶的性能(chen等人，2011a；rees等人，2017年；孙等人，2016年)。然而，由于一些限制因素，从常规蛋白质工程改造方法获得的含有酶突变体的突变菌株可能在表型上难以区分，这不仅使得筛选和鉴定所需的酶突变体非常有难度和耗时(ren等人，2018年)，而且很难在明显改善的酶突变体中找到表现最佳的酶突变体(ren等人，2015年)。此外，通过筛选确定的表现最佳的酶突变体的后续体外和体内表征可能与使用宿主微生物的实际生物生产过程无关。有鉴于此，用于鉴定具有改进特性并适用于实际生物生产过程的酶突变体的方法倍受关注。
4.最近，用于基因组编辑的crispr/cas9技术取得了很大进展并受到了广泛关注(cho等人，2018年；donohoue等人，2017年；等人，2015年；zhang等，2018)。其中，它被应用于微生物生产菌株的工程化改造(等人，2015年；蒋等人，2015；schuster等人，2018年)。由于其简单和高效，crispr/cas9是一种合适的基因组编辑工具，用于快速有效地将靶酶的基因突变体整合到生产菌株的染色体中(guo等人，2018)。
5.l
‑
色氨酸是一种必需氨基酸，广泛应用于医药、食品工业、动物饲料工业(becker等人，2015年)，还是其他产品的前体(huccetogullari等人，2019年；noda和kondo，2017年；vargas
‑
tah等人，2015年；wendisch，2014年)。因此，能够以简单且具有成本效益的方式生产色氨酸非常令人关注。通过发酵的生物技术生产色氨酸，如用大肠杆菌(e.coli)，已经成为该氨基酸的重要来源。然而，色氨酸等芳香族氨基酸的生物合成仍需优化。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种生产芳香族氨基酸，特别是色氨酸的改进的生物技术方法。
7.为了达到上述目的，本发明提供了一种突变的dahp合成酶(arog)突变体，其序列为seq id no:1，该序列中第6和7位的氨基酸不同时为天冬氨酸。
8.与野生型酶相比，本发明的dahp合成酶不受或明显较少受苯丙氨酸(phe)反馈抑制，并且在40mm phe存在的情况下，显示出比现有技术中已知的参考突变体arog
s180f
更高的特异酶活性。
9.术语“工程酶突变体”是指与野生型酶相比，其氨基酸序列经过生物技术改变的酶。在工程酶突变体中，野生型酶中给定位置的一个或多个氨基酸可以例如有目的地或随机地被其他氨基酸取代。术语“突变酶”也可以用于所述酶突变体。
10.术语“有机化合物的营养缺陷型”是指细胞或生物体无法合成其生长所需的特定有机化合物。
11.术语“重组工程系统”(也称为“重组系统”)涉及同源重组系统的一个或多个组成部分，即重组介导的基因工程系统，其是体内同源重组所必需的。重组工程系统的一个实例为lamda
‑
red(λ
‑
red)重组工程系统。所述λ
‑
red重组工程系统由dsdna同源重组所必需的三种成分组成，即蛋白质exo、beta和gam。重组工程系统的另一个实例为rec e/t系统，由蛋白质rec e和rec t组成。
12.与编码dna序列相关的术语“可表达”是指该dna序列可以在诱导型启动子或组成型启动子的控制下转录成rna转录物并翻译成相应的蛋白质产物。例如，就重组工程系统或基因而言，这意味着重组工程系统或基因的组分可以在诱导型启动子或组成型启动子的控制下转录成rna转录物，并翻译成重组工程系统或基因的相应蛋白质组分。关于非编码的dna序列，该术语应理解为在诱导型启动子或组成型启动子的控制下，由dna序列形成rna转录物。在本文中，术语“可表达的crispr向导rna”涉及编码crispr向导rna的dna序列，即其转录导致rna转录物成为crispr向导rna的dna序列。
13.术语“在有机化合物存在下经基因工程合成报告分子”是指在有机化合物存在下合成报告分子。“报告分子”是一种易于检测的分子，例如可视化的分子。例如，报告分子可以是荧光分子。报告分子的合成可以直接或间接取决于有机化合物的存在。报告分子的一个实例为绿色荧光蛋白(gfp)或其突变体，例如增强绿色荧光蛋白(egfp)。
14.术语“cas蛋白”是指crispr相关蛋白。crispr是术语“规律间隔成簇短回文重复序列”的缩写，用于表示包含回文重复序列的原核生物dna片段，由可变间隔dna片段间隔。该术语包括作为crispr
‑
cas系统一部分的蛋白质家族，分为两类(第1类和2类)和几种类型(i至vi)及亚型。第1类包括i、iii和iv型，第2类包括ii、v和vi型。cas型通常以特征蛋白为特征。例如，cas9是casii型的特征蛋白。例如，参见makarova等人，2015年；koonin等人，2017年；haft等人，2005年，wright等人，2016年。cas蛋白具有核酸酶活性，并使用crispr rnas(crrnas)将cas核酸酶组分导向要切割的靶核酸分子。
15.术语“cas9蛋白”或“cas9”是指crispr相关蛋白9。cas9是一种rna导向的dna核酸内切酶，例如来自化脓性链球菌。本文使用的术语“cas9”还包括所有cas9直系同源物以及重组体，即其工程突变体。cas9核酸酶在与向导rna形成复合物时具有活性，所述向导rna可以由两个单独的rna分子组成，即tracrrna和crrna，或者由融合在一起的tracrrna和crrna组成的单链的rna分子。部分crrna序列通过与靶dna序列的碱基互补配对来确定核酸酶的特异性。通过指定crrna的靶向序列，可以将crispr
‑
cas9系统导向合适的靶位点(“前间隔
序列”)。cas9介导的dna靶向的进一步要求是在靶位点附近，例如接近靶位点的下游，存在短的(例如2
‑
6个碱基对)和保守的前间隔序列邻近基序(pam)。pam序列因不同的cas蛋白而异，也可以通过改造cas蛋白进行调整。
16.术语“crrna”是指crispr rna，是指能够与tracrrna互补的rna分子。crrna赋予cas蛋白，如cas9，靶向特异性。rna：由crrna和tracrrna组成的rna双链体，可以融合在一起形成单链rna分子，也称为向导rna(grna)，并与cas蛋白结合。在细菌crispr基因座中，crrna位于crispr重复序列/间隔序列区域，由与靶基因互补的间隔序列和与tracrrna互补的重复序列组成。
17.术语“tracrrna”是指反式激活rna，一种小的反式编码的rna，与crrna部分互补并与crrna碱基配对，从而形成crrna：tracrrna双链体。
18.术语“crispr向导rna”，也称为“crispr grna”或“grna”，指的是一种crrna:tracrrna双链体。crrna和tracrrna可以结合或不结合到单链rna分子上。因此，术语“crispr向导rna”包括术语“crispr单链向导rna”(sgrna)。
19.术语“碱基对”或“杂交”涉及通过互补核酸分子之间的碱基配对形成双链体，例如两个rna或dna分子之间或一个rna和一个dna分子之间。
20.术语“基因组dna”在本文中与染色体dna的含义相同，而不是指如质粒dna等染色体外的dna。本文使用的术语“基因组”也指基因组遗传物质，即染色体上的遗传物质，而不是例如质粒上的遗传物质。
21.术语“在不存在有机化合物的情况下，在适合细胞生长的生长培养基中培养细胞”是指在不存在有机化合物的固体、液体或半固体培养基中培养细胞，但在没有机化合物的情况下，含有支持细胞生长的营养物质。因此，如果细胞能够合成有机化合物，则细胞能够在培养基上生长，否则将不能生长。生长培养基可以是含有细胞生长所需的基本营养物质的基础培养基。
22.术语“测定细胞的生长”涉及生长参数的定性和/或定量测定，例如生长速率、生长效率(产量系数)或最大生物量，优选为生长速率。生长效率与消耗的碳源量和产生的生物量之间的关系相关。
23.术语“测定报告分子的合成”涉及报告分子合成的定性和/或定量测定。例如，这可以包括测量荧光报告分子的荧光。具体的，该术语涉及测定报告分子产生的信号强度，例如荧光强度。
24.术语“dahp合成酶”涉及磷酸
‑2‑
脱氢
‑3‑
脱氧庚糖酸醛缩酶(ec 2.5.1.54；也为3
‑
脱氧
‑
d
‑
阿拉伯庚酮糖
‑7‑
磷酸合成酶)催化由磷酸烯醇丙酮酸和d
‑
赤藓糖4
‑
磷酸合成dahp(3
‑
脱氧
‑
d
‑
阿拉伯
‑
庚
‑2‑
酮酸
‑7‑
磷酸)。术语“arog”涉及来源于大肠杆菌的受氨基酸苯丙氨酸(phe)反馈抑制的dahp合成酶同工型，并且在本文也可以作为术语“dahp合成酶”的同义词使用。
25.术语“芳香族氨基酸”涉及具有芳香环的氨基酸，特别是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
26.在优选的实施方案中，突变的dahp合成酶(arog)具有seq id no：2、seq id no：3或seq id no：4的序列中的一种。本发明突变的dahp合成酶(arogs)的实施方案，在此表示为arog
d6g
‑
d7a
(seq id no:2)、arog
d6l
‑
d7p
(seq id no:3)和arog
d6p
‑
d7i
(seq id no:4)，已经使
用如下文所述的新的筛选方法进行了鉴定，使用生物传感器的生长速率和信号强度作为标准。与野生型酶相比，本发明的酶不受苯丙氨酸反馈抑制或受苯丙氨酸反馈抑制显著降低，并且在40mm苯丙氨酸(phe)存在的情况下，表现出比现有技术中已知的参考突变体arog
s180f
更高的特异性酶活性。在简单的补料分批发酵中，用产生色氨酸(trp)的菌株中表现最佳的新鉴定的arog
d6g
‑
d7a
替换arog
s180f
，trp的产量提高了38.5％(36h时为24.03
±
1.02g/l)。
27.本发明还涉及经基因工程改造以表达本发明的dahp合成酶的细菌细胞。优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
28.在另一方面，本发明涉及所述细菌细胞生产芳香族氨基酸，特别是色氨酸的用途。为此，细菌细胞优选为大肠杆菌细胞，优选在生物反应器中的合适培养基中生长。
29.本发明还涉及一种芳香族氨基酸的生物合成方法，包括在适合细菌细胞生长的培养基和条件下培养本发明细菌细胞的步骤。
30.在一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括从培养基中分离细菌细胞产生的芳香族氨基酸的步骤。
31.在所述方法的一个优选实施方案中，所述生长的细菌细胞为大肠杆菌细胞。所述产生的芳香族氨基酸优选为色氨酸。
32.本发明还涉及一种体内筛选工程酶突变体的方法，包括
33.a.补充细胞，所述细胞
34.(i)由于缺乏编码合成有机化合物所必需的酶的功能基因，从而导致对有机化合物的营养缺陷，
35.(ii)经基因工程改造以包含编码cas9蛋白的可表达基因，
36.(iii)经基因工程改造以包括可表达的crispr向导rna，所述rna被配置为与细胞染色体上目标位点的靶序列碱基配对，并将cas9蛋白导向靶序列，
37.(iv)经基因工程改造以在有机化合物存在的情况下合成报告分子，以及
38.(v)经基因工程改造以在染色体上的目标位点包含dna序列，所述dna序列包含crispr向导rna的靶序列、pam序列和可表达的靶基因，
39.通过生物技术将供体dna导入细胞，所述供体dna包含编码有机化合物合成所需酶突变体的供体基因，
40.b.在不存在有机化合物的情况下，在适合细胞生长的生长培养基中培养细胞，所述生长培养基不含有机化合物，
41.c.测定细胞的生长情况，以及
42.d.测定报告分子的合成。
43.本发明的方法将crispr/cas促进的直接在染色体上的靶基因工程与生长偶联和生物传感器引导的体内筛选和蛋白质突变体的表征相结合。通过测定细胞生长情况，例如生长速率，和生物传感器，例如报告分子的信号强度，结合所述方法能够可靠地鉴定出表现最佳的改良酶突变体。因此，所述方法特别适用于蛋白质工程改造和途径优化。
44.本发明的方法在本文中可缩写为术语“cgssc”，用于crispr/cas9促进的靶基因工程与生长偶联和传感器引导的体内筛选和表征。
45.使用上述筛选方法，并以生物传感器的生长速率和信号强度作为标准，已经鉴定了本发明上述例举的dahp合成酶。
46.在本发明的方法中，通过测定细胞的生长情况和报告分子的合成，可以在改进的酶突变体中鉴定出表现更好或最佳的酶突变体。使用关于不同酶突变体的细胞生长和报告分子合成的结果来鉴定表现最佳的酶突变体。例如，与表达第二种酶突变体的第二种细胞相比，表达第一种酶突变体的第一细胞生长更好，例如具有更高的生长速率或更高的生长产量，并且产生更多的指示有机化合物生成的报告分子。例如，如果所述报告分子为荧光分子，生成的报告分子的量可以通过荧光来检测。特别优选地，采用报告分子的生长速率、生长产量或生长效率以及生产率、产量或生产效率。表达一种酶突变体的细胞，与表达另一种酶突变体的细胞相比，在可比生理阶段，例如在对数生长期结束时具有相对更好的生长产量和更高的特定荧光强度，可以被确定为表现更好或最佳的细胞。例如可以通过在对数生长期结束时测量od600来测定生长产量，即在分光光度计中测定其在600nm处的光密度。
47.本发明的方法利用了以特定方式进行基因工程改造的细胞，以对酶突变体进行有效的体内筛选和表征。所述细胞对于细胞生长所必需的有机化合物，例如必需氨基酸，为营养缺陷型。所述细胞对于有机化合物可以为天然营养缺陷型，但优选为被基因工程改造以使其对于有机化合物具有营养缺陷型的细胞。
48.所述细胞经过基因工程改造，包含一种cas蛋白的基因。使用cas蛋白，例如cas9蛋白，以使编码酶突变体的核酸有效插入细胞基因组。尽管也可以将cas蛋白并入细胞基因组中，但优选将编码cas蛋白的基因包含在质粒中。所述cas蛋白可以受组成型启动子或诱导型启动子的控制。优选的，所述cas蛋白受组成型启动子的控制。
49.所述crispr向导rna优选导入与携带cas蛋白的质粒分离的质粒(参见jiang等人，2015年)，即所述cas蛋白在第一质粒上导入，所述crispr向导rna在第二质粒上导入。进一步优选为，将所述crispr向导rna与所述供体dna一起导入细胞。为此，所述grna和所述供体dna可以包含在同一质粒中。所述grna可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，并且所述grna优选在组成型启动子的控制下。所述grna能够与所述染色体上所述目标位点的靶序列碱基配对，所述供体dna(即包含编码酶突变体的基因的dna)将被插入所述目标位点，并将所述cas蛋白导向所述目标位点。尽管所述向导rna可以是两个单独的rna分子的双链体，即crrna和tracrrna，但是在本发明的方法中，优选使用由crrna和tracrrna组成的单链rna分子，即单向导rna(sgrna)。无论是否融合成单链分子，所述由crrna和tracrrna组成的grna可以为合成rna，例如，比天然存在的grna短的合成的rna。所述合成的grna可以经化学修饰，例如为了稳定grna，通过将天然存在于grna的核苷酸替换为非天然存在于grna的核苷酸(例如参见wo 2016/100951 a2)。
50.所述细胞还包括位于所述染色体上目标位点的靶基因，所述靶基因为酶突变体dna插入基因组的占位符。例如所述靶基因可以为抗生素抗性基因。例如所述靶基因可以插入到野生型酶基因的位点，使得野生型酶基因被靶基因破坏或替换。所述目标位点还包含dna序列，所述dna序列包含crispr向导rna的靶序列，即crispr向导rna可以与之杂交的序列(碱基对)，以及pam序列，以使cas蛋白切割所述靶序列。
51.此外，根据编码有机化合物合成所需酶的功能基因的存在，对所述细胞进行基因工程改造来合成报告分子。例如，所述细胞可以被工程化改造，使得在基因上优选地包括报告基因，所述报告基因的表达取决于有机化合物的存在与否。所述报道基因的一个实例为tnac，所述tnac编码tnacab操纵子的前导序列，所述tnac的上游融合了egfp。所述egfp可在
色氨酸存在的情况下表达。所述egfp的产生可以通过测定荧光定性或定量测定，所述荧光优选为荧光强度。所述报告分子的产生优选与有机化合物的产生相关，例如线性相关。本领域技术人员可以很容易地设计适用于检测细胞中是否存在另一种有机化合物的报告系统(xu等人，2014年，fang等人，2016年)。
52.在本发明的方法中，通过生物技术手段，例如通过电穿孔，将供体dna导入所述细胞。所述供体dna包含编码插入细胞的所述酶突变体的供体基因。将所述供体基因导入所述细胞，使得所述供体基因可以组成性地表达或诱导表达。在本发明的方法中，由此制备表达合成有机化合物所必需的酶突变体的重组细胞。所述供体dna优选为双链线性或环状dna(dsdna)。优选地，所述供体dna被插入质粒中。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述质粒还携带grna，所述grna用于将所述cas蛋白导向所述目标位点。所述供体dna包含所述供体基因，所述供体dna可以通过例如电穿孔等方法导入所述细胞，并且所述供体基因可以通过crispr/cas促进的重组插入细胞基因组的目标位点。所述供体基因的两侧可以为“同源臂”，即与所述染色体上用于同源重组的目标位点同源的序列。
53.在本发明方法的优选实施方案中，所述cas蛋白为ii类cas蛋白，优选为cas9蛋白。所述cas蛋白可以为重组cas蛋白，优选为重组ii型cas蛋白，例如重组cas9蛋白。所述cas蛋白的基因优选包含在质粒中，并且优选受组成型启动子的控制。
54.所述细胞可以进一步进行基因工程改造，以包括重组工程系统的基因。在本发明方法的某些实施方案中，将所述细胞进行基因工程改造以包含重组工程系统和cas蛋白的基因可能是有利的。所述cas蛋白和重组工程系统的基因可以包含在相同或不同的质粒中。然而，所述重组工程系统，特别是在λ
‑
red重组工程系统的情况下，也有可能插入基因组中。优选将所述编码cas蛋白的基因和所述编码重组工程系统的基因包含在同一质粒中。也可以将所述cas蛋白基因整合到细胞基因组中。所述重组工程系统优选受诱导型启动子控制，例如温度敏感型启动子。在本发明方法的一个实施方案中，使用经基因工程改造的也包含重组工程系统基因的细胞，所述供体基因优选侧接“同源臂”，即与染色体上目标位点同源的序列，以便能够通过重组工程系统介导同源重组。因此，通过生物技术导入细胞的供体dna包含编码有机化合物合成所必需的酶突变体的供体基因，以及与染色体上的靶基因同源的侧翼序列。
55.在本发明方法的一个优选实施方案中，如果所述方法所用的细胞中包含的重组工程系统为λ
‑
red(lambda
‑
red)重组工程系统，包括组分exo、beta和gam。所述λ
‑
red重组工程系统用于介导同源重组，以便将所述供体基因插入所述细胞基因组。所述λ
‑
red重组工程系统优选整合在所述基因组中。不过，也可以将所述重组工程系统安排在质粒中，例如携带cas蛋白基因的质粒。优选的，所述λ
‑
red重组工程系统在诱导型启动子的控制下表达，例如温度敏感型启动子。
56.本发明方法中使用的细胞优选为微生物细胞，进一步优选为细菌细胞，更进一步优选为肠杆菌细胞，特别优选为大肠杆菌细胞。
57.本发明的方法可用于酶突变体文库的体内筛选和表征。为此，用不同的酶突变体来补充如上定义的多个细胞。所述补充的不同的酶突变体的细胞在没有有机化合物的情况下生长，并且测定细胞的生长情况和报告分子的合成，以鉴定与野生型酶相比具有优异特性的酶突变体。所述表现最佳的酶突变体可以例如以报告分子的生长速率和信号强度(例
如荧光强度)作为参数来鉴定。
附图说明
58.在下文中，仅出于说明的目的，通过附图和实施例来描述本发明。
59.图1为本发明方法的实施例的简化示意图。a：有机化合物营养缺陷型细胞与供体dna的互补，所述供体dna包含合成有机化合物所必需的功能基因。b：通过crispr/cas9辅助重组工程将供体基因导入细胞基因组的补充细胞。
60.图2显示了理性蛋白质工程中的常规筛选和表征方法(b，虚线)与crispr/cas9促进的工程及生长偶联和传感器引导的体内筛选和表征(cgssc)方法(a，实线)的比较。在理性蛋白质工程的循序渐进的过程中，首先利用基于蛋白质结构和功能的知识或生物信息学和建模的结果，对感兴趣的基因进行理性或半理性设计改变。高通量筛选和先体外再体内表征以鉴定最佳突变体是一个艰苦的过程。在cgssc中，生长偶联的体内筛选和传感器引导的体内表征的酶突变体的crispr/cas9促进的工程的综合步骤使蛋白质工程更加高效和精确。
61.图3显示了本发明方法在筛选和表征抗反馈arog(arogfbr)酶突变体中的设计和实施。在大肠杆菌中，dahp合成酶(arog、arof和aroh)是芳香族氨基酸(aaa)生物合成途径中的关键限速酶。通过破坏dahp合成酶构建了一个aaa营养缺陷型菌株(菌株ws002)，并将其用作筛选arog基因突变体的平台，使用crispr/cas9系统将这些突变体单独整合到大肠杆菌的染色体中。在高浓度的phe下，只有表达对phe具有良好抗性的arog
fbr
的菌株才能产生足够的aaa并维持细胞生长。用代表色氨酸生产率的色氨酸生物传感器(p
tac
‑
tnac
‑
egfp)的荧光信号强度(中等荧光单位，mfu)对这些菌株进行了进一步表征。
62.图4显示了将arog
wt
和arog
s180f
分别导入ws002菌株的染色体后产生的ws003和ws004两个菌株在不同生长条件下的生长情况和荧光的比较。左图为复合培养基(lb
‑
琼脂)；中间图为m9
‑
琼脂培养基(不含任何氨基酸)；右图为含25mm phe的m9
‑
琼脂培养基。
63.图5中(a)大肠杆菌arog phe结合位点的关键残基。(b)arog
d6x
‑
d7x
突变体在加入25mm phe和0.1mm iptg的还原m9琼脂(不含tyr和trp)上的荧光诱导。
64.图6显示了phe对arog
wt
酶及其突变体arog
s180f
、arog
d6l
‑
d7p
、arog
d6p
‑
d7i
和arog
d6g
‑
d7a
活性的影响。(a)具体活性；(b)相关活性。结果来自三个独立的实验。
65.图7显示了菌株s028(圆形)和s028gm1(方形)的补料分批发酵结果。(a)细胞生长；(b)葡萄糖浓度；(c)色氨酸生产；(d)总生产率，(e)色氨酸(qtrp)的形成率和(f)中间体莽草酸(sa，空心圆或空心正方形)和脱氢莽草酸(dsa，实心圆或实心正方形)的积累。所有结果都基于两次独立的发酵。
66.图8为质粒pcm
‑
arog的图谱。所述质粒中包含的供体dna由一部分cmr基因、整个野生型arog基因和一部分血清(sera)基因组成。
67.图9显示了本发明dahp合成酶(图9a)及其优选实施方案(图9b
‑
c)的氨基酸序列(单字母编码)。x＝任何氨基酸，但两者不同时为天冬氨酸(d)。
具体实施方式
68.图1以简化和示意的方式示出了本发明方法的实施例。在本发明的方法中，一种细
胞，优选为如大肠杆菌的细菌细胞，所述细胞由于缺乏编码有机化合物合成所需酶的功能基因而对有机化合物而言为营养缺陷型，通过生物技术将供体dna导入所述细胞进行补充，所述供体dna包含所述编码有机化合物合成所需酶的供体基因(图1a)。所述供体基因通过crispr/cas辅助重组工程导入所述细胞基因组。为此，在本实施方案中，对细胞进行基因工程改造，以包括(a)可表达的重组工程系统；(b)编码cas蛋白的可表达基因，本文为cas9；(c)可表达的crispr向导rna(单向导rna，sgrna)，其被配置为与细胞染色体上目标位点的靶序列(“原间隔区”)碱基配对，并将cas蛋白导向靶序列；和(d)在染色体上的目标位点，包含crispr向导rna的靶序列(“原间隔区”)、pam序列和可表达靶基因(例如对抗生素产生抗性的基因)的dna序列。所述细胞被进一步通过基因工程化改造以在有机化合物存在的情况下合成报告分子。导入所述细胞的所述供体基因的两侧为与染色体上的靶基因同源的序列。所述重组工程系统(本文中为λ
‑
red重组工程系统)和cas蛋白的基因被置于同一质粒上。然而，也可以将编码重组工程系统和cas蛋白的基因放在单个质粒上或基因组中。在本发明的方法中，所述重组工程系统并不是必需存在的。
69.表达导入细胞染色体的所述供体基因，从而产生功能性酶，这是从前体a合成有机化合物b所必需的，对于有机化合物b，细胞是营养缺陷型的。有机化合物合成并在其存在下形成报告分子(图1b)。测定细胞生长和报告分子的合成。
70.通过用编码不同酶突变体的不同供体基因进行上述程序，可以测试酶突变体文库，以鉴定表现最佳的酶突变体(见图2)。
71.实施例
72.1.介绍
[0073]3‑
脱氧
‑
d
‑
阿拉伯庚酮糖
‑7‑
磷酸(dahp)合成酶为工程微生物高效生物合成芳香族氨基酸(aaa)的关键酶：色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)和酪氨酸(tyr)(chen和zeng，2017年；kim等人，2015年；wu等人，2018年)。它受到最终产物的强烈反馈抑制(ogino等人，1982年；sprenger，2006年)。例如，在大肠杆菌中，由基因arog、arof和aroh编码的所有野生型dahp合成酶分别受到phe、tyr和trp的反馈抑制(mccandliss等人，1978年；schoner和herrmann，1976年)。因此，抗反馈dahp合成酶工程改造对于构建生产aaa及其衍生物的有效途径是不可或缺的(sprenger，2006年)。本发明的方法，也称为“cgssc”，用于工程化改造和筛选抗反馈dahp合成酶突变体，以改善大肠杆菌中色氨酸产生的分支途径。
[0074]
2.材料和方法
[0075]
2.1菌株和质粒
[0076]
表1列出了本研究中使用的菌株和质粒。以trp生产菌株s028λ为出发菌株，其中s028的亲本菌株染色体上去除了温度敏感的λ
‑
red重组工程系统(chen和zeng，2017年)。在菌株s028λ中，dahp合成酶活性仅由抗苯丙氨酸的arogs180f提供。为了应用crispr/cas9技术介导基因组编辑，将质粒pcas(jiang等人，2015年)插入s028λ，产生菌株s028λc(表1)。
[0077]
表1本文中使用的主要菌株和质粒
[0078]
[0079][0080][0081]
a
trpr
‑
sgrna,具有n20序列的sgrna，用于靶向trpr位点。
[0082]
为了构建用于蛋白质表达和纯化的质粒，使用arog
‑
his
‑
hindiii和xbai
‑
sera引
物从大肠杆菌dy330菌株(yu等人，2000年)中分离arog
wt
的编码基因(表2)。然后在hindiii和xbai位点将其插入载体pet22b( )以生成质粒pet
‑
arog
wt
。通过使用诱变引物(表2)扩增整个质粒pet
‑
arog
wt
，生成质粒pet
‑
arog
s180f
、pet
‑
arog
d6g
‑
d7a
、pet
‑
arog
d6l
‑
d7p
和pet
‑
arog
d6p
‑
d7i
。
[0083]
2.2分子生物学工作
[0084]
2.2.1sgrna质粒和供体dna的构建
[0085]
为了构建表达单向导rna(sgrna)的质粒，本发明使用了一组引物(表2)通过pcr扩增ptagampr主链(图8)。借助基于网络的工具cas
‑
designer(bae等人，2014年；park等人，2015年)，选择目标基因特异的20bp间隔序列，并在引物内合成(表2，大写字母显示)。然后将pcr产物直接转化到大肠杆菌top10感受态细胞中，获得所需的sgrna质粒。为了构建含有供体dna的sgrna质粒，分别扩增两条300
‑
500bp的同源臂和用于替换的dna片段，然后通过pcr将其融合在一起。凝胶纯化后，将目标pcr产物插入所需的sgrna质粒中。
[0086]
表2本文中使用的引物
[0087]
grna序列以大写字母表示；n＝a、c、g或t；k＝g或t
[0088]
[0089]
[0090][0091]
质粒和菌株的构建
[0092]
ws001和ws002菌株的构建
[0093]
为了避免使用过多的质粒导致不稳定，trp
‑
生物传感器被整合到trpr基因位点的染色体中，从而得到ws001菌株。为此，质粒pn20
‑
trpr由质粒ptagampr(图8)构建，ptagampr质粒来源于质粒ptargetf(jiang等人，2015年)，将大观霉素抗性转变为氨苄青霉素抗性，引物ptargr和trpr
‑
n20(表2)用于表达靶向trpr基因的grna。用引物tsen
‑
trpr
‑
if和tsen
‑
trpr
‑
ir从质粒psentrp(方等，2016)中扩增供体dna片段trp
‑
sensor。
[0094]
为了构建芳香族氨基酸(aaa)
‑
营养缺陷型菌株(ws002)，本发明通过用抗生素抗性基因cm
r
替换arog
s180f
基因来去除菌株ws001的唯一dahp合成酶。在这方面，首先用引物ptargr和arog
‑
n20(表2)由质粒ptagampr质粒构建质粒pn20
‑
arog，用于表达靶向arog基因的grna。用引物up
‑
aroh
‑
out和cm
‑
delg
‑
r从质粒pjlc中扩增所述供体dna片段p
j23119
‑
rpsl
‑
cm
r
。
[0095]
pcm
‑
arog
fbr
质粒文库的构建
[0096]
为了构建pcm
‑
arog(图8)，本发明应用构建质粒pn20
‑
arog相同的方式，用引物ptargr和cm
‑
n20(表2)构建质粒pn20
‑
cm
r
。使用引物pn20vrcm和pn20vfsera从质粒pn20
‑
cm
r
中扩增出dna片段v
‑
n20cmr(表2)。同时，分别由质粒pjlc(表1)、大肠杆菌w3110的基因组dna和质粒strp015a(chen和zeng，2017年)生成dna片段f
‑
cm
r
、f
‑
arog和f
‑
sera。引物对分别为cm
‑
c1/cm
‑
c2、warog
‑
ff/arog
‑
fus
‑
r和sera
‑
fus
‑
f/sera
‑
fus
‑
r。然后将四个片段(v
‑
n20cmr、f
‑
cm
r
、f
‑
arog和f
‑
sera)融合在一起，通过使用融合hd克隆试剂盒(in
‑
fusion hd cloning kits)(laboratories,inc.)构建最终质粒pcm
‑
arog
wt
。使用相应的诱变引物对(表2)构建pcm
‑
arog
s180f
和pcm
‑
arog
fbr
的质粒，以扩增整个质粒pcm
‑
arog
wt
。
[0097]
菌株s028gm1的构建
[0098]
为了将p
j23119
‑
rpsl
‑
cmr
‑
arog
d6g
‑
d7a
的启动子替换为与s028相同的启动子(p
j23119
‑
rpsl
‑
tac
‑
arog
s180f
)，首先构建了与其他sgrna质粒相同的质粒pn202
‑
cm
r
，但使用了引物ptargr和cmr
‑
n202。通过两轮pcr获得供体dna片段p
j23119
‑
rpsl
‑
tac
‑
arog
d6g
‑
d7a
。第一轮是通过用引物noti
‑
ptac
‑
arog和arog
‑
spei扩增质粒pet
‑
arog
d6g
‑
da7
，将tac启动子添加到arog
d6g
‑
da7
基因中。第二轮是通过使用引物u
‑
rpslp
‑
tac和arog
‑
fus
‑
r，并以第一轮的pcr产物作为模板，对上游同源臂进行侧翼修饰。将质粒pn202
‑
cm
r
和片段p
j23119
‑
rpsl
‑
tac
‑
arog
d6g
‑
d7a
与质粒pcas共转化到菌株ws005中，以产生菌株s028gm1。
[0099]
2.2.1利用crispr/cas9技术进行基因组编辑
[0100]
为了将靶供体dna片段整合到基因组中，本发明使用了携带pcas表达载体的宿主菌株。按照chen和zeng(2017年)报告的方案，用电穿孔方法进行转化，并稍作修改。具体而言，为了制备电穿孔感受态细胞，将携带pcas的菌株的过夜培养物(在30℃下生长)接种(2％，体积/体积)到含有30μg/ml卡那霉素的10ml新鲜sob培养基中。在生长到od600约为0.4后，将细胞转移并于42℃振荡培养15分钟，然后立即置于冰上10分钟。之后，在4℃下通过离心收集细胞，并用预冷的10％甘油或蒸馏水洗涤三次。将感受态细胞重新悬浮在400μl预冷的10％甘油中，每次反应取200μl。将在水中洗脱的相应sgrna质粒(如果需要，加上供体dsdna)与感受态细胞混合进行转化。在0.2cm比色皿中进行电穿孔，电压为2.5kv，细胞悬浮在1ml sob培养基中，并在30℃回收2小时，然后进行平板培养。平板在30℃孵育24小时以上。通过菌落pcr和dna测序鉴定转化子。
[0101]
2.4arog突变体文库的构建和筛选
[0102]
为了证明本发明方法的有效性，将本发明的方法应用于工程化抗phe arog。本研究选择了arog(pdb id:1kfl)的phe结合位点的两个残基(asp6和asp7)进行饱和诱变(nnk)。通过扩增整个质粒pcm
‑
arog
wt
(表1)，用引物(表2)引入饱和诱变。用dpni消化模板dna后，将pcr产物转化到具有化学活性的大肠杆菌top10细胞中，将反应产物悬浮在sob培养基中。在37℃孵育1小时后，将所有细胞转移到含有100μg/ml氨苄青霉素的10ml新鲜lb培养基中，并在37℃培养8
‑
10小时。从这些培养物中提取质粒，并在水中洗脱为arog突变体文库：pcm
‑
arog
d6x
‑
d7x
(图8，见上文)。
[0103]
将arog突变体文库转移到ws002菌株(含有pcas)中，然后在sob培养基中于30℃下孵育2h后，用m9培养基(不含任何氨基酸)洗涤细胞三次。将细胞分散在含有25mm phe和0.1mm iptg的m9琼脂培养基上进行筛选。在30℃下孵育超过24小时后，挑选出具有更大尺寸和更强荧光信号的转化体，并通过在相同培养基上划线进行再次检查。最后，在5ml发酵培养基ii(fm
‑
ii)中30℃下培养24小时来测试候选突变菌株。fm
‑
ii与先前报道的几乎相同(gu等人，2012年)，但是包含0.5g/l而不是5g/l的mgso4·
7h2o，并且初始葡萄糖浓度为30g/l。此外，加入12g/l k2hpo4(用于缓冲ph)、25mm phe和0.1mm iptg。选择产生较强的中等荧光(mfu)的突变体进行测序。
[0104]
2.5荧光强度的测定方法
[0105]
通过离心收集在lb培养基中培养的含有报道的egfp蛋白的染色体trp传感器的突变体，并用m9培养基分别洗涤三次以除去lb培养基。然后，将将每个突变体以相同量的细胞接种到50ml锥形管中含有25mm phe的10ml的新鲜m9培养基中，培养10小时后，用流式细胞仪对细胞进行荧光分析。为此，首先使用pbs缓冲液将每种培养物洗涤三次，并稀释100倍，
然后使用流式细胞仪(cytoflex，贝克曼库尔特)在488nm的激发波长下监测egfp荧光(mfi≥10000个事件)。所有数据均用贝克曼流式(beckman flow)软件处理，并使用电子门控从仪器和水样背景中分离阳性信号。对于荧光强度，计算每个培养物的中等荧光单位(mfu)。
[0106]
2.6蛋白质表达和纯化
[0107]
对于蛋白质的表达，将相应的质粒(见第2.1节)分别转化到大肠杆菌bl21中作为宿主细胞。蛋白质表达和纯化程序与之前报道的略有不同(chen等人，2018年)。根据考马斯亮蓝法，使用牛血清白蛋白作为标准品，并通过bio
‑
rad实验室(美国加州赫拉克勒斯)的预制分析，对纯化的蛋白质进行定量。
[0108]
2.7酶测定
[0109]
arog
fbr
突变体的体外酶动力学如文献中所述方法进行，仅稍作修改(schoner和herrmann，1976年)。通过在232nm处的吸光度监测pep的消失来测量酶活性，根据pep的标准曲线在比色皿中测量232nm处的吸光度(未示出)计算比活性。为了研究phe对arog突变体活性的影响，在不同浓度(从0
‑
40mm)的phe存在的情况下测量活性。反应混合物包含10mm双三丙烷(bis
‑
tris丙烷)(btp，ph 7.0)、50μm mnso4、600μm pep、500μm e4p和25μg纯化酶，总体积为0.2ml，置于25℃的试管中，有或没有抑制剂。将混合物(不含pep和e4p)和底物(pep和e4p)分别平衡至反应温度，通过加入底物(pep和e4p)开始反应。
[0110]
2.8发酵条件
[0111]
对于生物反应器中的补料分批发酵，预培养和种子培养在与先前报道相同的条件下进行(gu等人，2012年)。由于整合在大肠杆菌dy330菌株中的λ重组系统可以在42℃下使温度敏感的细胞生长，所以在用于发酵之前，将其从每株源自dy330的菌株中移除。为此，根据chen和zeng(2017)报道的方法进行λ重组系统的去除程序。发酵在高度仪表化和自动化的4平行池1.5l生物反应器系统(德国尤利希的dasgip平行生物反应器系统)中进行，初始工作体积为500ml。除非另有说明，否则生物反应器中的发酵培养基、补料液和发酵条件与之前报道的相同(chen和zeng，2017年)。
[0112]
2.9分析方法
[0113]
如前所述，使用高效液相色谱法定量测定葡萄糖、3
‑
脱氢莽草酸(dsa)和莽草酸(sa)(bommareddy等人，2014年；luz等人，2014年)。色氨酸采用灵敏的分光光度法进行测定(nagaraja等人，2003年)。
[0114]
3.结果和讨论
[0115]
3.1本发明方法的概念验证(cgssc方法)
[0116]
为了验证概念，本发明首先构建了一个筛选菌株，所述菌株包含一个色氨酸生物传感器，并且缺乏用于筛选dahp合成酶突变体的dahp合成酶活性。为此，首先敲除了先前开发的产生色氨酸的大肠杆菌菌株s028λ(chen和zeng，2017年)中的aroh和arof基因(表1)。从这个突变体中删除arog
s180f
基因使该菌株对芳香族氨基酸(aaa)产生营养缺陷。因此，突变体的生长与其重新引入时的dahp合成酶活性有关(图3)。原则上，具有更高活性的工程化合成酶应导致trp的积累更快，这反过来刺激trp生物传感器调节的报告基因的表达(fang等人，2016)。
[0117]
trp生物传感器由tnac组成，tnac编码tnacab操纵子的前导序列(bischoff等人，2014年；gong等人，2001年)；egfp蛋白融合到tnac的上游(fang等，2016年)。具体地，在使用
crisp/cas9系统用trp生物传感器替换trpr基因之后，首先基于trp生成菌s028λc(chen和zeng，2017年)构建菌株ws001(表1)。然后，我们通过用抗生素抗性基因cmr替换arogs180f基因来去除菌株ws001的唯一dahp合成酶，所述基因在进一步的基因组编辑中为crispr/cas9系统提供sgrna靶点，产生菌株ws002(表1，图3)。正如预期的那样，如果不添加任何芳香族氨基酸phe、tyr和trp，菌株ws002不能在m9培养基中生长(数据未显示)。然后，测试了在含有高浓度酶抑制剂的特定培养基中，在细胞生长和报告基因表达方面，具有抗反馈dahp合成酶的菌株是否与具有野生型dahp合成酶的菌株表现不同。为此，本发明使用crispr/cas9技术，分别用质粒pcm
‑
arog
wt
和pcm
‑
arog
s180f
，将野生型arog基因和抗反馈基因arog
s180f
(ger等人，1994年)导入到菌株ws002染色体上的cm
r
基因位点。将重组体涂布在含有25mm phe且不含tyr和trp的m9琼脂培养基上。培养基中还添加了0.1mm iptg，一个原因是释放trp生物合成途径，因为它由laci调节剂调节，另一个原因是诱导sgrna的表达，从而引导cas9切割供体质粒，目的基因也可以从供体质粒中表达。
[0118]
结果表明，在将arogs180f基因导入宿主后，许多具有强荧光信号的重组体在上述条件下生长(图4)。本发明中选择了几个菌落进行进一步鉴定。事实证明这些菌落都有相同的突变s180f。这些重组体被命名为ws004。在相同条件下，没有观察到整合有质粒pcm
‑
arog
wt
的宿主的菌落(图4)。据推测，野生型arog的活性受到phe的严重抑制，不能支持细胞的生长。然而，也有可能重组工程的效率太低。为了排除后一种可能性，带有arog
wt
基因的重组体也在含有iptg的lb琼脂培养基上生长。从复合培养基中，获得了多个菌落(图4)，这些菌落经菌落pcr确认为阳性，命名为ws003。菌株ws003和ws004在含有和不含有25mm phe的m9琼脂培养基上重新检验(图4)。发现菌株ws003在不含phe的培养基上生长，但是在含有phe的培养基上未观察到生长(图4)。正如所料，在含有和不含有phe的培养基上，菌株ws004的生长没有表现出显著的差异。这些结果表明，cgssc是一种有助于改造具有所需性能(例如更高的活性和更高的抑制剂耐受性)的酶的方法。在下文中应用cgssc来获得对phe的耐受性更高的arog突变体。
[0119]
3.2cgssc用于筛选phe抗性arog
[0120]
为了证明上述建立的cgssc方法在获得更具抗性的arog酶突变体的有效性，首先生成了arog的突变文库。
[0121]
为此，采用了一种半理性策略，所述策略利用了来自与抑制剂phe(pdb:1kfl)复合的arog的晶体结构的信息(图5a)。选择参与phe结合的残基d6和d7作为目标进行饱和诱变。然后，用cgssc筛选。如图5b所示，对于arog
d6x
‑
d7x
突变体，在生长约30小时后，在前述筛选培养基上获得约100个大小不同和荧光信号强度不同的菌落。
[0122]
在第一轮筛选后，筛选出30个体积相对较大且荧光信号强度较高的arog
d6x
‑
d7x
突变体菌落，并在筛选培养基上重新鉴定。在确认表型后，从20个候选基因中分离出突变的arog基因用于测序。测序结果显示，在20个候选基因中只有6个不同的arog突变体(表3)，为arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7p
、arog
d6p
‑
d7i
、arog
d6f
‑
d7v
、arog
d6v
‑
d7c
和arog
d6f
‑
d7l
，出现次数分别为7、6、4、1、1和1(表3)。然后，在含fm
‑
ii培养基的50ml锥形管中，用携带这6个重组体的菌株进行发酵，并将它们与野生型菌株ws003和具有arog
s180f
突变体的菌株ws004进行比较。发现携带突变体arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7p
或arog
d6p
‑
d7i
的菌株(其在20个候选菌株中出现的频率较高)(表3)也具有较高的trp生产率(图3，序列另请参见图9)。特别是前两个突变体的产量比参
照菌株(arog
s180f
)高得多。此外，还研究了色氨酸生产率和荧光信号强度之间的关系。具有较强荧光信号的菌株也具有较高的色氨酸生产率(图3)。这些结果表明，在测试条件下，突变体arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7v
和arog
d6p
‑
d7i
比突变体arog
s180f
具有更高的抑制剂耐受性。为了提供更直接的证据，用这些突变体的纯化蛋白进行了酶分析。
[0123]
表3含有arog
wt
、arog
s180f
和arog
fbr
突变体的大肠杆菌菌株在含有25mm phe的fm
‑
ii上培养的发酵结果的比较dcw:细胞干重
[0124][0125]
a
突变体数指所有经过检验的20个候选基因；n.d.表示未检测到。平均值
±
标准差基于三个独立的实验。
[0126]
3.3选定arogfbr突变体的体外表征
[0127]
为了检验在菌株中观察到的更高的trp生产率和更强的荧光信号是否是由于相应arog突变体的phe耐受性的提高，我们研究了突变体arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7p
和arog
d6p
‑
d7i
的抑制行为。
[0128]
如图6所示，所有突变体对抑制剂phe的敏感性均显著降低，而野生型arog对其极为敏感。在0.5mm phe存在的情况下，野生型arog几乎完全失去活性，而所有突变体在相同条件下仍保持80％以上的活性。与arog
s180f
相比，当phe浓度高于10mm时，所有三种突变体arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7p
和arog
d6p
‑
d7i
对phe的敏感性均较弱(图6b)。在大于20mm phe存在的情况下，它们也具有更高的比活性(图6a)。这些结果解释了当在含有非常高phe浓度的培养基中培养时，具有这三种突变体的菌株在trp产量方面的表现优于阳性对照的原因(表3)。如图6a所示，由相同残基d6和d7替换产生的这三个突变体之间的特异性活性显著不同。其中，arog
d6g
‑
d7a
突变体具有最高的比活性，无论phe浓度如何，其比活性几乎为突变体arog
d6p
‑
d7i
的两倍。也明显高于阳性对照arog
s180f
。
[0129]
3.4分支酸途径和色氨酸生物合成的改进
[0130]
为了探索最佳突变体arog
d6g
‑
d7a
对芳香氨基酸生物合成的菌株发育的影响，用突变体arog
d6g
‑
d7a
替换先前构建的产生trp的菌株s028中的突变体arog
s180f
，得到菌株s028gm1(见上文)。通过在生物反应器中进行简单的补料分批发酵，比较s028gm1菌株和参照菌株s028的色氨酸生产能力。
[0131]
如图7a和7c所示，菌株s028gm1在延迟期(约10h)至发酵结束产生的trp明显高于参照菌株。在发酵结束时(37h)，菌株s028gm1生产trp 24.03
±
1.02g/l，比菌株s028(17.35
±
1.16g/l)高38.50％(图7c)。在整个发酵过程中，两种菌株的葡萄糖浓度控制在几乎相同的水平。发现在指数生长阶段开始时，菌株s028gm1的生长速率(0.211h1)略快于菌株s028(0.184h
‑
1，图7a)。dahp合成酶活性的增强显然在一定程度上促进了生长速率的提高。较高的生物量形成速率可以合理地使得菌株s028gm1获得较高生产率(图7d)。然而，其trp产量的提高主要因素为dahp合成酶活性的直接增强，因为在整个发酵过程中，菌株s028gm1的trp形成速率显著高于菌株s028(图7e)。此外，在发酵过程中，菌株s028gm1积累的分支酸途径的中间体sa和dsa的量高于参照菌株s028(图7f)。发酵结束时，菌株s028gm1积累的两种中间体都比菌株s028产生的中间体高约36％。这表明由于突变体arog
d6g
‑
d7a
和arog
s180f
之间的差异，在菌株s028gm1中比在参照菌株中有更多的代谢通量被重定向到分支途径。这些结果清楚地表明，突变体arog
d6g
‑
d7a
对于生物生产芳香族氨基酸及其衍生物的分支途径更有效。
[0132]
4.结论
[0133]
已经表明，本发明的方法将crispr/cas9促进的工程与生长偶联和传感器引导的体内筛选和表征(cgssc)相结合，特别适用于酶突变体的工程化改造和筛选。利用工程化改造和筛选3
‑
脱氧
‑
d
‑
阿拉伯庚酮糖
‑7‑
磷酸合成酶(arog)的方法，可以鉴定出arog突变体，其对phe更具抗性，因此更适合于trp等芳香族氨基酸的生物合成。根据结构信息选择的两个突变点，发现新的突变体(arog
d6g
‑
d7a
、arog
d6l
‑
d7p
和arog
d6p
‑
d7i
)对phe的抗性高于文献报道的phe抗性突变体arog
s180f
。在先前工程化的生产色氨酸的大肠杆菌菌株(s028)中，用arog
d6g
‑
d7a
替换arog
s180f
，在简单的补料分批发酵中色氨酸产量显著提高了38.05％。由于本发明的方法是基于将酶突变体的基因整合到染色体中，例如上述的编码arog的基因突变体，因此，它也可以用于优化菌株中工程酶的表达水平，即通过使用不同的启动子和/或核糖体结合位点构建相应的基因。值得一提的是，crispr/cas9技术具有高效率，可以多重基因组编辑。因此，本发明的方法可用于解决需要同时调节多个基因的多种靶标，例如用于合成需要多种前体的代谢物，如色氨酸。
[0134]
参考
[0135]
alper,h.,fischer,c.,nevoigt,e.,stephanopoulos,g.,2005.tuning genetic control through promoter engineering.proc.natl.acad.sci.usa 102,12678
‑
12683.
[0136]
bae,s.,park,j.,kim,j.
‑
s.,2014.cas
‑
offinder:a fast and versatile algorithm that searches for potential off
‑
target sites of cas9 rna
‑
guided endonucleases.bioinformatics.30,1473
‑
1475.
[0137]
becker,j.,lange,a.,fabarius,j.,wittmann,c.,2015.top value platform chemicals:bio
‑
based production of organic acids.curr.opin.biotechnol.36,168
‑
175.
[0138]
binder,s.,siedler,s.,marienhagen,j.,bott,m.,eggeling,l.,2013.recombineering in corynebacterium glutamicum combined with optical nanosensors:a general strategy for fastproducer strain generation.nucleic acids res.41,6360
‑
6369.
heterologous deoxyviolaceinproduction in escherichia coli.met.eng.33,41
‑
51.
[0152]
ger,y.
‑
m.,chen,s.
‑
l.,chiang,h.
‑
j.,shiuan,d.,1994.a single ser
‑
180 mutation desensitizes feedback inhibition of the phenylalanine
‑
sensitive 3
‑
deoxy
‑
d
‑
arabino
‑
heptulosonate 7
‑
phosphate(dahp)synthetase in escherichia coli.j.biochem.116,986
‑
990.
[0153]
gong,f.,ito,k.,nakamura,y.,yanofsky,c.,2001.the mechanism of tryptophan induction of tryptophanase operon expression:tryptophan inhibits release factor
‑
mediated cleavage of tnac
‑
peptidyl
‑
trnapro.proc.natl.acad.sci.usa 98,8997
‑
9001.
[0154]
gu,p.,yang,f.,kang,j.,wang,q.,qi,q.,2012.one
‑
step of tryptophan attenuator inactivation and promoter swapping to improve the production of l
‑
tryptophan in escherichia coli.microb.cell fact.11,30.
[0155]
guo,x.,chavez,a.,tung,a.,chan,y.,kaas,c.,yin,y.,cecchi,r.,garnier,s.l.,kelsic,e.d.,schubert,m.,2018.high
‑
throughput creation and functional profiling of dna sequence variant libraries using crispr
–
cas9 in yeast.nat.biotechnol.36,540
‑
546.
[0156]
huccetogullari,d.,luo,z.w.,lee,s.y.,2019.metabolic engineering of microorganisms for production of aromatic compounds.microbial cell factories.18,41.
[0157]
hwang,h.j.,lee,s.y.,lee,p.c.,2018.engineering and application of synthetic nar promoter for fine
‑
tuning the expression of metabolic pathway genes in escherichia coli.biotechnol.biofuels.11,103.
[0158]
t.,bonde,i.,m.,harrison,s.j.,kristensen,m.,pedersen,l.e.,jensen,m.k.,keasling,j.d.,2015.multiplex metabolic pathway engineering using crispr/cas9 in saccharomyces cerevisiae.meta.eng.28,213
‑
222.
[0159]
jiang,y.,chen,b.,duan,c.,sun,b.,yang,j.,yang,s.,2015.multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr
‑
cas9 system.appl.environ.microbiol.81,2506
‑
2514.
[0160]
kim,s.c.,min,b.e.,hwang,h.g.,seo,s.w.,jung,g.y.,2015.pathway optimization by re
‑
design of untranslated regions for l
‑
tyrosine production in escherichia coli.sci.rep.5,13853.
[0161]
lee,s.y.,kim,h.u.,2015.systems strategies for developing industrial microbial strains.nat.biotechnol.33,1061
‑
1072.
[0162]
liao,j.c.,mi,l.,pontrelli,s.,luo,s.,2016.fuelling the future:microbial engineering for the production of sustainable biofuels.nat.rev.microbiol.14,288
‑
304.
[0163]
lin,s.,meng,x.,jiang,j.,pang,d.,jones,g.,ouyang,h.,ren,l.,2012.site
‑
directed mutagenesis and over expression of arog gene of escherichia coli k
‑
12.int.j.biol.macromol.51,915
‑
919.
[0164]
lu,j.,tang,j.,liu,y.,zhu,x.,zhang,t.,zhang,x.,2012.combinatorial modulation of galp and glk gene expression for improved alternative glucose utilization.appl.microbiol.biotechnol.93,2455
‑
2462.
[0165]
luz,j.a.,hans,e.,zeng,a.p.,2014.automated fast filtration and on
‑
filter quenching improve the intracellular metabolite analysis of microorganisms.eng.life sci.14,135
‑
142.
[0166]
mccandliss,r.j.,poling,m.,herrmann,k.,1978.3
‑
deoxy
‑
d
‑
arabino
‑
heptulosonate 7
‑
phosphate synthase.purification and molecular characterization of the phenylalanine
‑
sensitive isoenzyme from escherichia coli.j.biol.chem.253,4259
‑
4265.
[0167]
mora
‑
villalobos,j.a.,zeng,a.p.,2017.protein and pathway engineering for the biosynthesis of 5
‑
hydroxytryptophan in escherichia coli.eng.life sci.17,892
‑
899.
[0168]
nagaraja,p.,yathirajan,h.s.,vasantha,r.a.,2003.highly sensitive reaction of tryptophan with p
‑
phenylenediamine.anal.biochem.312,157
‑
161.
[0169]
noda,s.,kondo,a.,2017.recent advances in microbial production of aromatic chemicals and derivatives.trends in biotechnology.35,785
‑
796.
[0170]
ogino,t.,garner,c.,markley,j.l.,herrmann,k.m.,1982.biosynthesis of aromatic compounds:13c nmr spectroscopy of whole escherichia coli cells.proc.natl.acad.sci.usa 79,5828
‑
5832.
[0171]
park,j.,bae,s.,kim,j.
‑
s.,2015.cas
‑
designer:a web
‑
based tool for choice of crispr
‑
cas9 target sites.bioinformatics.31,4014
‑
4016.
[0172]
rees,h.a.,komor,a.c.,yeh,w.
‑
h.,caetano
‑
lopes,j.,warman,m.,edge,a.s.,liu,d.r.,2017.improving the dna specificity and applicability of base editing through protein engineering andprotein delivery；nat.commun.8,15790.
[0173]
ren,kun xu,david jay segal,zhang,z.,2018.strategies for the enrichment and selection of genetically modified cells.trends biotechnol.doi:10.1016/j.tibtech.2018.07.017.
[0174]
ren,c.,xu,k.,liu,z.,shen,j.,han,f.,chen,z.,zhang,z.,2015.dual
‑
reporter surrogate systems for efficient enrichment of genetically modified cells.cell mol.life sci.72,2763
‑
2772.
[0175]
schoner,r.,herrmann,k.m.,1976.3
‑
deoxy
‑
d
‑
arabino
‑
heptulosonate 7
‑
phosphate synthase.purification,properties,and kinetics of the tyrosine
‑
sensitive isoenzyme from escherichia coli.j.biol.chem.251,5440
‑
5447.
[0176]
schuster,a.,erasimus,h.,fritah,s.,nazarov,p.v.,van dyck,e.,niclou,s.p.,golebiewska,a.,2018.rnai/crispr screens:from a pool to a valid hit.trends biotechnol.doi:10.1016/j.tibtech.2018.08.002.
[0177]
sprenger,g.a.,2006.aromatic amino acids.amino acid biosynthesis～
pathways,regulation and metabolic engineering.springer,pp.93
‑
127.
[0178]
vargas
‑
tah,a.,mart
í
nez,l.m.,hern
á
ndez
‑
ch
á
vez,g.,rocha,m.,mart
í
nez,a.,bol
í
var,f.,gosset,g.,2015.production of cinnamic and p
‑
hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered escherichia coli.microbial cell factories.14,6.
[0179]
sun,m.g.,seo,m.
‑
h.,nim,s.,corbi
‑
verge,c.,kim,p.m.,2016.protein engineering by highly parallel screening of computationally designed variants.sci.adv.2,e1600692.
[0180]
wu,w.b.,guo,x.l.,zhang,m.l.,huang,q.g.,qi,f.,huang,j.z.,2018.enhancement of l
‑
phenylalanine production in escherichia coli by heterologous expression of vitreoscilla hemoglobin.biotechnol.appl.biochem.65,476
‑
483.
[0181]
xu,t.,close d,smartt a,ripp s,sayler g.,2014,detection of organic compounds with whole
‑
cell bioluminescent bioassays.bioluminescence:fundamentals and applications in biotechnology
‑
volume 1,springer:111
‑
151.
[0182]
yu,d.,ellis,h.m.,lee,e.
‑
c.,jenkins,n.a.,copeland,n.g.,2000.an efficient recombination system for chromosome engineering in escherichia coli.proc.natl.acad.sci.usa 97,5978
‑
5983.
[0183]
zhang,j.,zong,w.,hong,w.,zhang,z.
‑
t.,wang,y.,2018.exploiting endogenous crispr
‑
cas system for multiplex genome editing in clostridium tyrobutyricum and engineer the strain for high
‑
level butanol production.met.eng.47,49
‑
59.
[0184]
zhou,l.
‑
b.,zeng,a.
‑
p.,2015.exploring lysine riboswitch for metabolic flux control and improvement of l
‑
lysine synthesis in corynebacterium glutamicum.acs synth.biol.4,729
‑
734.
[0185]
zhu,x.,zhao,d.,qiu,h.,fan,f.,man,s.,bi,c.,zhang,x.,2017.the crispr/cas9
‑
facilitated multiplex pathway optimization(cfpo)technique and its application to improve the escherichia coli xylose utilization pathway.met.eng.43,37
‑
45.
[0186]
zurawski,g.,gunsalus,r.,brown,k.,yanofsky,c.,1981.structure and regulation of aroh,the structural gene for the tryptophan
‑
repressible 3
‑
deoxy
‑
d
‑
arabino
‑
heptulosonic acid
‑7‑
phosphate synthetase of escherichia coli.j.mol.biol.145,47
‑
73.