长期稳定的活粪便微生物群组合物的制作方法

长期稳定的活粪便微生物群组合物
1.本技术要求于2019年4月15日提交的欧洲专利申请ep19382287.1的权益。
2.本发明涉及含有稳定的活粪便微生物群的组合物。


背景技术：

3.粪便微生物群移植(fecal microbiota transplantation，fmt)是含有微生物的粪便物料从健康个体转移到患病接受者。
4.传统上，移植到上胃肠(gastrointestinal，gi)道是通过鼻胃插管、鼻十二指肠插管、鼻空肠插管或通过食管胃十二指肠镜检查或推进式小肠镜检查法来实现的。通常通过结肠镜检查、乙状结肠镜检查或灌肠剂递送至下胃肠道。所有这些技术都有缺点。例如，上胃肠道施用具有吸入相关并发症的风险(特别是鼻胃递送)，并且对接受者来说是侵入性的且不舒服的。诸如结肠镜检查和乙状结肠镜检查等下胃肠道递送技术也是侵入性的和不舒服的，并且与大量成本和风险相关。
5.因此，仍然需要一种安全有效且侵入性较小的方式将微生物群落递送至接受者(例如，粪便物移植或粪便微生物群移植)。
6.已经采用两种方法来开发微生物群落的封装口服制剂：(a)将粪便水溶液快速冷冻；和(b)冻干。
7.第一种方法涉及使粪便水溶液在甘油和盐水缓冲液中急速冷冻。水溶液保持微生物菌株的活力，但产生高度不稳定的胶囊，因为粪便的含水特性会迅速降解水溶性胶囊。这些胶囊的物理不稳定性使批量生产变得复杂并产生临床危害，因为胶囊在施用过程中会破裂。这种不稳定性要求胶囊在其使用(即其必须解冻的时刻)前必须储存在
‑
70℃/
‑
80℃下。这种不稳定性以及对“复杂的”设备的需求将粪便微生物群疗法(fecal microbiota therapy，fmt)限制在医院环境在特殊医疗监督下应用。因此，要治疗的对象必须去具有所有合适的手段来冷冻和解冻胶囊的医院。然而，这会导致缺乏治疗依从性，从而导致患者不能坚持。
8.已经进行了若干尝试以减少粪便的含水成分。通过诸如冻干等技术对微生物群落进行脱水是主要途径之一。然而，脱水过程对物理要求很高，并且显著降低了微生物的活力。此外，有时微生物群落的脱水不足以达到适当的稳定性，因此必须为此开发特殊容器。例如，kr20080059605公开了将冻干细菌包装在具有特定设计的容器中以降低与胶囊接触的环境湿度。其中该韩国专利文件提供了含有(实施例6)或不含有(实施例5)赋形剂的冻干细菌的稳定性数据。实施例6提供了包含冻干细菌以及微晶纤维素和硬脂酸镁的胶囊的数据。值得注意的是，不含有赋形剂的胶囊在特定容器内比当胶囊与赋形剂一起配制时更稳定。
9.尽管迄今为止做出了努力，但仍然需要基于活细菌细胞的稳定的家用型的fmt。


技术实现要素：

10.本发明人已开发出足够稳定以在约4℃而非
‑
65℃或
‑
80℃下储存的活微生物群胶
囊，这意味着该胶囊可储存在接受者的家中的常规冰箱中。
11.如下所示，本发明人首先制备了粪便微生物群团(从粪便的甘油水溶液中获得)与微晶纤维素(microcrystalline cellulose，以下也称为“mcc”)和润滑剂(硬脂酸镁)的混合物。当用该混合物制备胶囊时，根据欧洲药典9.4第2.5.12.节，发现它们的含湿量占组合物总重量的约30％(参见下表1)。
12.令人惊讶的是，本发明人已经发现，在含水量高达约30％的环境中包含活微生物群的所述胶囊即使在如此高的含湿量下，在4℃(相当于冰箱温度的温度)下的3个月期间也是稳定的。在这方面，表1示出了吸水赋形剂的添加为封装活微生物群赋予了稳定性，这种稳定性与冻干微生物群所达到的稳定性具有相同的数量级。因此，添加吸水赋形剂是冻干技术(冻干技术对细菌活力更具“侵略性”)的有效替代方案。
13.从现有技术来看，这是不可预料的。如上所述，现有技术已经教导了两种实现稳定封装的粪便微生物群的选项：将温度降低至约
‑
80℃，从而获得冷冻的粪便微生物群；或通过冻干粪便微生物群尽可能地减少含水量。甚至最近的出版物也公开了冻干细菌的封装和将所得冻干细菌在进一步降低了容器内的含湿量的特殊容器中包装(例如韩国专利kr20080059605)。因此，从现有技术来看，本文提供的本发明，即在较温和温度下稳定的活粪便微生物群(与冻干相比需要高含湿量)，是令人惊讶的。
14.胶囊的稳定性不仅体现在细菌活力方面，还体现在胶囊的形态上。如下所述，当用粪便微生物群和吸水赋形剂(mcc)配制的胶囊在4℃下储存三个月时，没有发现长度、宽度或气味方面的变化。
15.因此，总而言之，本发明的组合物意味着fmt领域的巨大进步，因为接受者可以在家中进行治疗，而无需前往医疗诊所。此外，本发明的组合物是有利的，因为它可以通过为患者提供改进的便利来提高治疗依从性，从而导致增加的患者坚持性。
16.因此，在第一方面，本发明提供一种固体口服药物组合物，该组合物包含药学有效量的活微生物和一种或多种药学上可接受的吸水赋形剂，其中根据欧洲药典9.4第2.5.12.节所测定的，该混合物的含水量占组合物总重量的0.5％至30％。
17.在第二方面，本发明提供一种制备如本发明第一方面所定义的口服药物组合物的方法，该方法包括将活微生物与一种或多种吸水赋形剂混合。
18.与现有技术相比，本发明的优点在于用于获得本发明的组合物的方法在温和条件(室温和湿度)下需要很少的步骤，这将活细菌损失的风险降至最低。
19.在第三方面，本发明提供了可通过本发明第二方面所定义的方法获得的口服药物组合物。
20.在第四方面，本发明提供了用于治疗用途的如本发明的第一或第三方面所定义的口服药物组合物。
21.这是第一次报道吸水赋形剂在稳定封装的活微生物方面的能力。事实上，基于韩国专利kr20080059605提供的数据，当比较该现有技术的实施例5和实施例6中提供的数据时，本领域技术人员会预期吸水赋形剂会对微生物群的稳定性产生负面影响。
22.不受理论的束缚，本发明人相信这种令人惊讶的效果是由于吸水赋形剂(例如mcc，如下所示)与粪便微生物群团中存在的水相互作用的事实，例如部分水保持“游离”状态，而少量被吸收作为“结构化的水”，后者导致形成分子海绵(sponge)。以这种方式，固体
药物组合物将包含高达约30％的含水量(这将对应于用于制备胶囊的起始粪便微生物群团的含水量)，但大部分水将在一种形成的“海绵”(吸收赋形剂所采取的物理形式)内。这种“海绵”可以充当蓄水池或保护屏障：在特定的环境条件下，胶囊内的活微生物群可以逐渐利用胶囊中可用的水。因此，由于混合物中的含水量，吸水赋形剂能够发挥稳定作用。
23.以上可以解释为什么在韩国专利20080059605中相同的吸水赋形剂(mcc)不能提供这种稳定作用：赋形剂不能稳定微生物，因为它不能吸收足够的水，因为：(a)细菌是冻干的(即，不包含大量水)；和(b)由于容器的特殊设计，所以环境含湿量低。
24.因此，在第五方面，本发明提供了吸水赋形剂用于稳定固体口服药物组合物中的活微生物的用途。
25.最后，本发明还提供了用于治疗生态失调相关疾病中的用途的如本发明第一或第三方面所定义的固体口腔组合物。该方面可替代地表达为如本发明的第一或第三方面所定义的固体口腔组合物在制备用于治疗生态失调相关疾病的药物中的用途。该方面可替代地表达为治疗或预防生态失调相关疾病的方法，该方法包括向有此需要的对象施用治疗有效量的如本发明的第一或第三方面所定义的组合物。
具体实施方式
26.除非另有说明，否则在本技术中本文使用的所有术语应以其在本领域已知的普通含义来理解。除非另外明确列出的定义提供了更广泛的定义，否则如本技术中所使用的某些术语的其他更具体的定义如下所述，并且旨在在整个说明书和权利要求书中统一应用。此外，为了本发明的目的，给出的任何范围包括该范围的下端点和上端点。除非特别说明，否则给定的范围，例如温度、时间、重量等，都应视为近似的。
27.如上所述，在第一方面，本发明涉及包含活微生物和一种或多种吸水赋形剂的口服固体药物组合物。
28.如本文所用，表述“治疗有效量”是指活微生物的量，当施用时，该量足以预防要解决的疾病的一种或多种症状的发展、或在一定程度上缓解要解决的疾病的一种或多种症状。当然，根据本发明施用的活微生物的具体剂量将由与病例有关的具体情况而定，包括施用的化合物、施用途径、所治疗的具体病症以及类似的考虑因素。
29.表述“药物组合物”是指对人类和非人类具有有益作用的那些组合物。
30.在本发明第一方面的一个实施方式中，该实施方式可选地与以下提供的任何实施方式组合，活微生物是益生菌微生物或粪便微生物群。在另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，活微生物是粪便微生物群。
31.在本文的上下文中，术语“微生物群”是指在通常是诸如人的哺乳动物的动物对象中和所述动物对象上存在(持续地或短暂地)的微生物群落，包括真核生物、古细菌、细菌、诸如酵母的真菌、和病毒(包括细菌病毒，即噬菌体)。粪便微生物群包括未知但数量众多的微生物类型。
32.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含一种吸水赋形剂。
33.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该吸水赋形剂选自：纤维素基赋形剂或其药学上可接受的盐；高岭石；
滑石；坡缕石；海泡石；胶体二氧化硅；和蒙脱石(smectites)(其中胶岭石(montmorillonite)、皂石和锂蒙脱石是使用最广泛的种类)。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该吸水赋形剂是纤维素基赋形剂。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该吸水赋形剂是纤维素醚衍生物(例如烷基(例如c1‑
10
烷基)醚、羟烷基(例如，ho
‑
(c1‑
10
)烷基)醚，或羧烷基(例如，oh(o)c
‑
(c1‑
10
)烷基)
‑
醚，或其药学上可接受的盐)；纤维素酯(例如醋酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素(cellulose acetate propionate，cap)、乙酸丁酸纤维素(cellulose acetate butyrate，cab)衍生物)或其混合物(即一种或多种醚衍生物与一种或多种醚衍生物的混合物，一种或多种醚衍生物与一种或多种酯衍生物的混合物，或一种或多种酯衍生物与一种或多种酯衍生物的混合物)。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，纤维素基赋形剂选自：甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羧甲基纤维素和微晶纤维素(microcrystalline cellulose，mcc)。在另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该吸水赋形剂是纤维素醚衍生物。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，吸水赋形剂是mcc。在本发明第一方面的组合物的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上提供的任何实施方式组合，该组合物包含粪便微生物群和mcc。
34.如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和更低等的动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应等、并且与合理的利益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域中是众所周知的。药学上可接受的、无毒的酸加成盐的实例为与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如乙酸、三氟乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的氨基盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸酯、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2
‑
羟基
‑
乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2
‑
萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3
‑
苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自合适的碱的盐包括碱金属、碱土金属、和铵。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。在适当时，其他药学上可接受的盐包括使用抗衡离子(例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。
35.本发明的药物组合物的特征在于含水量高达30％。在本发明第一方面的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，含水量占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％。可选择地，本发明第一方面的药物组合物的含水量占组合物总重量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、
29％或30％。
36.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，吸水赋形剂选自：纤维素基赋形剂或其药学上可接受的盐；高岭石；滑石；坡缕石；海泡石；胶体二氧化硅；和蒙脱石(其中胶岭石、皂石和锂蒙脱石是使用最广泛的种类)。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，吸水赋形剂是纤维素基赋形剂。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，吸水赋形剂是纤维素醚衍生物(例如烷基(例如c1‑
10
烷基)醚、羟烷基(例如，ho
‑
(c1‑
10
)烷基)醚，或羧烷基(例如，oh(o)c
‑
(c1‑
10
)烷基)醚，或其药学上可接受的盐)；纤维素酯(例如醋酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丙酸纤维素(cap)、乙酸丁酸纤维素(cab)衍生物)或其混合物(即一种或多种醚衍生物与一种或多种醚衍生物的混合物，一种或多种醚衍生物与一种或多种酯衍生物的混合物，或一种或多种酯衍生物与一种或多种酯衍生物的混合物)。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，纤维素基赋形剂选自：甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羧甲基纤维素和微晶纤维素(mcc)。在一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，吸水赋形剂是纤维素醚衍生物。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，吸水赋形剂是mcc。在本发明第一方面的组合物的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物包含占组合物总重量的1％至30％、5％至30％或9％至30％的含水量，并且还包含粪便微生物群和mcc。
37.含水量是根据“欧洲药典9.4第2.5.12节，第5107页“水：半微量测定”来测定的，该测定是基于水在具有足够缓冲能力的碱存在下与合适的无水介质中的二氧化硫和碘的反应。该测量是使用由带有两个相同铂电极的滴定容器组成的装置进行的。
38.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含一种或多种另外的药学上或兽医学上可接受的赋形剂。
39.表述“药学上或兽医学上可接受的赋形剂或载体”是指药学上可接受的材料、组合物或溶媒。从与药物组合物的其他成分相容的意义上讲，每种组分必须是药学上可接受的。它还必须适合用于与人类和非人类动物的组织或器官接触，而没有过多的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合理的利益/风险比相称的其他问题或并发症。合适的药学上可接受的赋形剂的实例是润滑剂、冷冻保护剂等。任何常规的赋形剂介质，除非与某种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不良的生物效应或以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其使用都被认为是在本发明的范围内。
40.在本发明第一方面的组合物的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下
提供的任何实施方式组合，该组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，该赋形剂选自：冷冻保护剂、润滑剂和其组合。
41.该组合物可以包含至少一种冷冻保护剂。可以使用的冷冻保护剂的实例是甘油、碳水化合物、诸如抗坏血酸钠的水溶性抗氧化剂、谷胱甘肽、核黄素、l
‑
半胱氨酸以及其药学上可接受的盐或其组合。在本发明第一方面的组合物的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含冷冻保护剂。在本发明第一方面的组合物的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含甘油。
42.在本发明第一方面的组合物的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含冷冻保护剂和润滑剂。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物还包含甘油和润滑剂。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物还包含冷冻保护剂和硬脂酸盐。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物还包含甘油和硬脂酸盐。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物还包含甘油和硬脂酸镁。
43.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、纤维素衍生物、硬脂酸盐和冷冻保护剂。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、纤维素醚衍生物、硬脂酸盐和甘油。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、mcc、硬脂酸盐和甘油。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、mcc、硬脂酸盐和甘油。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、纤维素醚衍生物、硬脂酸镁和甘油。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该组合物包含：粪便微生物群、mcc、硬脂酸镁和甘油。
44.在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，口服固体药物组合物是胶囊，即单个胶囊，例如硬胶囊或软胶囊。在本发明中，表述“单个胶囊”是指口服药物组合物仅由一个包含微生物群和吸附剂的胶囊组成。因此，该实施方式(即“单个胶囊”)不包括包含微生物群和吸附剂的胶囊在另一个胶囊内的可能性。在本发明第一方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，固体口服药物组合物由由微生物群和吸附剂制成的单个胶囊组成。
45.如本文所用，术语“胶囊”是指用于对人类或动物口服施用的常规硬胶囊。本发明的胶囊在结构上不脱离硬胶囊的常规定义。当本文提及“胶囊”时，除非上下文另有说明，否则它是指外胶囊或内胶囊或包含内胶囊的外胶囊。通常，术语“胶囊”指的是空的和填充的胶囊，而“壳”具体指的是空的胶囊。
46.如本领域普通技术人员所知，作为普通胶囊或加长型胶囊提供的市售胶囊由编号
命名，并且加长型胶囊具有后缀el。
47.另一个优点是本发明的胶囊的生产不需要会导致活细菌显著损失的干燥：只需将混合物填充到胶囊中(通过本领域技术人员的任何常规技术)。
48.在本发明第一方面的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，组合物是肠溶胶囊。术语“肠溶胶囊”意指具有肠溶特性的此类胶囊。“肠溶特性”意指胶囊可溶于碱性肠分泌物或被碱性肠分泌物分解，但基本上不溶于胃的酸性分泌物溶液或对胃的酸性分泌物溶液有抵抗力。本发明提供的混合物也用来填充市售的肠溶胶囊。
49.本发明第一方面下所提供的所有实施方式也是第二、三、四、五方面的实施方式。
50.本发明在第二方面提供了一种制备本发明第一方面的组合物的方法。
51.在一个实施方式中，该方法在温度和相对湿度房间条件下进行。
52.术语“室温”是指没有加热或冷却的温度，从15℃到25℃。
53.术语“相对湿度房间条件”是指该方法在空气的相对湿度下进行。在可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合的一个实施方式中，相对湿度为50％至80％。在可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合的一个实施方式中，相对湿度为60％
±
5％。
54.在本发明第二方面的一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括混合相对于以体积单位表示的活微生物的量按重量计过量的吸水赋形剂。当本发明的组合物包含多于一种吸水赋形剂时，表述“按重量计过量的吸水赋形剂”是指吸水赋形剂的总量相对于活微生物的体积是过量的。
55.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，以体积单位表示的活微生物的量与以重量单位表示的吸水赋形剂的量之间的比率包括从0.1:1到0.99:1，优选地从0.70:1到0.95:1。当本发明的组合物包含多于一种吸水赋形剂时，表述“吸水赋形剂的量”是指这些赋形剂的总量。
56.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，组合物包含润滑剂并且吸水剂与润滑剂之间的重量比包括从30:1到70:1，优选地从40:1到60:1，更优选为50:1。
57.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，活微生物是粪便微生物群提取物。
58.粪便微生物群提取物可以通过包括以下步骤的方法来制备：(a)提供从合适的捐赠者获得的粪便物料；(b)在一定条件下对粪便物料进行至少一个加工步骤，使得从粪便物料产生成分有细菌、古细菌、真菌和病毒的均质组合物。
59.粪便物料应远离氧气，例如，通过在生产样品后立即用减氧盐水溶液覆盖样品，以及通过在厌氧环境中进行大部分处理(通过使用厌氧室或通过用例如ar、n2或co2冲扫)。
60.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，对粪便和盐水进行均质化、过滤和离心。弃去上清液，将团与作为冷冻保护剂的甘油混合，以提供粪便微生物群提取物。
61.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
62.(a)获得粪便微生物群提取物；
63.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合。
64.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
65.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
66.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合。
67.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
68.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂；以及(a.4)离心；
69.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合。
70.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
71.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水和冷冻保护剂(例如甘油)均质化，其中冷冻保护剂的体积相对于溶液总体积的百分比为5％至15％或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％(v/v)；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂，其体积相对于溶液总体积的百分比为10％至50％，10％至40％、15％至35％或15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％(v/v)；以及(a.4)离心；和(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合。
72.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
73.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水和冷冻保护剂(例如甘油)均质化，其中冷冻保护剂的体积相对于溶液总体积的百分比为10％(v/v)；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂，其体积相对于溶液总体积的百分比为20％(v/v)；以及(a.4)离心；和(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合。
74.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，该方法包括：
75.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团物与甘油混合；
76.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种吸水赋形剂混合。
77.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
78.(a)获得粪便微生物群提取物；
79.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合；
80.(c)添加一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂；以及
81.(d)封装所得混合物。
82.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
83.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
84.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种吸水赋形剂混合；
85.(c)添加一种或多种药学上可接受的赋形剂；以及
86.(d)封装所得混合物。
87.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
88.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
89.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合；
90.(c)添加润滑剂；以及
91.(d)封装所得混合物。
92.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
93.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
94.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的纤维素基赋形剂混合；
95.(c)添加一种或多种另外的药学上或兽医学上可接受的赋形剂；以及
96.(d)封装所得混合物。
97.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
98.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
99.(b)将粪便微生物群提取物与以上定义的纤维素衍生物混合；
100.(c)添加润滑剂；以及
101.(d)封装所得混合物。
102.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
103.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
104.(b)将粪便微生物群提取物与mcc混合；
105.(c)添加硬脂酸盐；以及
106.(d)封装所得混合物。
107.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
108.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)离心；以及(a.4)将团与冷冻保护剂混合；
109.(b)将粪便微生物群提取物与mcc混合，其中添加相对于以体积单位表示的粪便微生物群提取物的量过量的以重量单位表示的mcc的量；
110.(c)添加硬脂酸盐；以及
111.(d)封装所得混合物。
112.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
113.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水均质化；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂；(a.4)离心；以及(a.5)提取；
114.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合；
115.(c)添加一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，例如润滑剂；以及
116.(d)封装所得混合物。
117.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
118.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水和冷冻保护剂(例如甘油)均质化，其中冷冻保护剂的体积相对于溶液总体积的百分比为5％至15％或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％(v/v)；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂，其体积相对于溶液总体积的百分比为10％至50％，10％至40％、15％至35％或15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％(v/v)；(a.4)离心；以及(a.5)分离提取物；
119.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合；
120.(c)添加一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，例如润滑剂；以及
121.(d)封装所得混合物。
122.在本发明的第二方面的另一个实施方式中，该实施方式可选地与以上或以下提供的任何实施方式组合，执行该方法以获得胶囊，该方法包括：
123.(a)获得粪便微生物群提取物，通过：(a.1)使粪便与盐水和冷冻保护剂(例如甘油)均质化，其中冷冻保护剂的体积相对于溶液总体积的百分比为10％(v/v)；(a.2)过滤溶液；(a.3)添加冷冻保护剂，其体积相对于溶液总体积的百分比为20％(v/v)；(a.4)离心；以及(a.5)分离提取物；
124.(b)将粪便微生物群提取物与以上提供的任何实施方式中定义的一种或多种吸水赋形剂混合；
125.(c)添加一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂，例如润滑剂；以及
126.(d)封装所得混合物。
127.通过向对象口服施用有效量的包含微生物的组合物，本发明的固体组合物可用于在任何对象例如人类接受者的胃肠道定植。根据疾病、病症或病状的严重性和现状，接受者可被认为是患者并且术语“有此需要的对象”包括接受者和患者。除非上下文另有说明，否则所有三个术语都旨在表示摄入一种或多种本发明的胶囊的人类或动物。
128.本文使用的术语“对象”是指任何哺乳动物，包括但不限于家畜和其他农场动物(例如牛、山羊、绵羊、马、猪和鸡)、表演动物(例如赛马)、伴侣动物(例如猫和狗)、实验室测试动物和人类。通常，对象是人。
129.包含该组合物的胶囊可以治疗、预防、延迟或减轻与生态失调(身体上或体内的微生物失衡或适应不良)相关的疾病的症状。更具体地，本发明的胶囊可用于预防或治疗由以下引起的感染：艰难梭菌(c.difficile)、沙门氏菌属(salmonella spp.)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic e coli)、多重耐药菌如克雷伯氏菌(klebsiella)和大肠杆菌、耐碳青霉烯肠杆菌科(carbapenem
‑
resistent enterobacteriaceae，cre)、超广谱耐β
‑
内酰胺肠球菌(extended spectrum beta
‑
lactam resistant enterococci，esbl)、和耐万古霉素肠球菌(vancomycin
‑
resistant enterococci，vre)。
130.在一些实施方式中，对象患有炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)，例如克罗恩病(crohn's disease)、结肠炎(例如溃疡性结肠炎或显微镜下结肠炎)或结肠袋炎；或患有肠易激综合征或功能性消化不良。在一些实施方式中，对象患有肝脏疾病，例如非酒精性脂肪性肝炎(non
‑
alcoholic steatohepatitis，nash)、非酒精性脂肪性肝病(non
‑
alcoholic fatty liver disease，nafld)、肝性脑病、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis，psc)、自身免疫性肝炎或药物诱导的肝损伤。在一些实施方式中，对象患有自身免疫性疾病，例如乳糜泻或嗜酸细胞性食管炎。在一些实施方式中，对象患有gi的过度增殖性疾病或恶性肿瘤，例如结肠直肠癌/息肉、食管癌或barrett食管炎。在一些实施方式中，对象患有代谢疾病，例如代谢综合征、1型或2型糖尿病、肥胖症、营养失调或营养不良，或心血管疾病(例如动脉粥样硬化)。在其他实施方式中，对象患有风湿性疾病，例如炎症性关节炎(类风湿性关节炎或ra、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、ibd脊柱关节病)、纤维肌痛、慢性疲劳综合征或自身免疫性和结缔组织疾病(例如系统性红斑狼疮、硬皮病和干燥综合征(sjogren's syndrome))。在一些实施方式中，对象患有血管炎(例如，风湿性多肌痛/巨细胞动脉炎或结节性多动脉炎)。在一些实施方式中，对象患有精神障碍，例如情绪障碍(例如，抑郁症或躁郁症)、焦虑症(例如，一般性焦虑症、创伤后应激障碍)或发育障碍(例如，自闭症谱系障碍、注意力缺陷多动障碍)。在一些实施方式中，对象患有结肠息肉、囊肿、憩室病、便秘、肠梗阻、吸收不良综合征、粘膜溃疡和腹泻中的一种或多种。可以用本发明的胶囊治疗的疾病或病症的其他实例是特应性皮炎、鼻炎和上呼吸道感染(upper respiratory tract infection，urti)。
131.由于患有慢性疾病或病症的对象的微生物组往往会恢复为其自身固有的异常微生物组，因此可能需要重复施用微生物群落以确保临床治愈得以维持。因此，包含微生物的本发明组合物可以作为维持剂量递送。维持给药方案可以变化，包括微生物剂量、施用频率、施用间隔和施用长短，并且取决于对象的疾病和生物特性。
132.例如，慢性医学疾病的治疗可能需要约5粒至约50粒胶囊的剂量用于诱导治疗，例如每次施用约5粒至约40粒胶囊。例如，组合物可以每次施用约10粒、约15粒、约20粒、约25粒、约30粒、约35粒、约40粒、约45粒或约50粒胶囊的剂量施用。对象可以被治疗一次或多次。对于维持治疗，胶囊可以每天施用，或每周施用2次至5次，或每月施用1次至10次。维持治疗可能会持续数周至数月。例如，维持治疗可以持续约两周至约六周(例如，约一个月)，或者可以持续约两个月至约六个月(例如，约两个月至四个月)或甚至更长。一次“施用”是指在一天疗程内摄入的胶囊。
133.在整个说明书和权利要求书中，“包括”一词及该词的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，“包括”一词涵盖“由
……
组成”的情况。本领域技术人员在考查了说明书之后，本发明的另外的目的、优势和特征将变得显而易见，或者可以通过实施本发明而获悉。下面的实施例以说明的方式提供，并且它们不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖了本文描述的特定和优选实施例的所有可能的组合。
134.实施例
135.实施例1
136.将一滩新鲜冷藏粪便(300g)转移到添加有0.9％nacl 1:10的匀质器袋中。将其引入stomacher 400循环器(seward ltd.，英国萨塞克斯)，以230rpm的速度进行1分钟，获得浆液。将混合物转移到50ml容量的标记的塑料管中，并在
‑
80℃冷冻之前添加10％纯甘油(99％)。
137.继续处理，样品在4℃下解冻过夜并添加20％甘油(99％)。然后将混合物在4℃下以400g离心20分钟(heraeus megafuge 16r centrifuge，thermo fisher scientific inc.，ma，usa)以去除样品碎片。将上清液转移到预先用常规筛子过滤以消除可能的碎屑的高抗性管中，并将该量在4℃下以10000g离心30分钟(sorvall evolution rc centrifuge，thermo fisher scientific inc.，ma，usa)以获得微生物团。通过倾析除去上清液，用刮铲回收团，避免任何残留的上清液。
138.将团分成两份用于冻干(对比目的)和吸附实验(本发明)，用3份相同的等分试样一式三份进行实验，每份所含等同于50g粪便。
139.a.制备根据本发明的胶囊
140.将9.3ml等分试样与10g微晶纤维素(
‑
101)混合，从而获得吸附物。吸附物的产生是可以理解的，因为等分试样的外观从液体质地变为“锯屑型”质地。为了帮助封装，将200mg硬脂酸镁进一步添加到吸附物中。
141.获得吸附物后，在封装前，将产品在冰箱中4℃保存过夜。使产品被硅胶板包围，以减少/消除冰箱中混合物周围的湿度。
142.最后，将由此获得的吸附物用半自动封装机fagronlab
tm
fg(fagron iberica，西班牙巴塞罗那)封装到00号耐酸胶囊中。
143.b.制备具有冻干微生物群的胶囊(对比目的)
144.使用telstar liolab 3并按照制造商说明进行冻干程序。
145.将由此获得的冻干物用半自动封装机fagronlab
tm
fg(fagron iberica，西班牙巴塞罗那)封装到00号耐酸胶囊中。
146.c.细菌活力分析
147.在含有5％羊血的哥伦比亚琼脂(becton dickinson gmbh，德国)中，使用用于流式细胞术和定量细菌培养的live/dead
tm
baclight
tm
细菌活力和计数试剂盒(thermo fisher scientific，ma，usa)，在将样品在4℃保存后0个月、1个月和3个月的时间测试来自每个重复的原始滩、团和胶囊的细菌数量和活力。根据制造商的说明，使用的细胞仪是bd facscantoii(bd biosciences，ca，usa)，软件是bd facsdiva 8.0。在最终体积为250μl的样品中使用0.1μl将syto9:碘化丙啶的比例优化为1:1。发现要分析的样品的最佳稀释比为1:10000。
148.对于流式细胞术分析，将胶囊的测试等分试样和未封装的吸附物和冻干物用0.9％nacl溶液按如上所述的1:10000稀释，并剧烈涡旋直至获得均质液体。在0.9％nacl中进行稀释以获得10
‑4(1:10000)的细菌稀释，其中syto9和碘化丙啶的比例为1:1(0.1μl syto9和0.1μl碘化丙啶，最终体积为250微升)，以及试剂盒中包含10μl微球(1/2稀释)。一旦获得结果，活细菌的浓度按照方案的等式来确定：
[0149][0150]
d.稳定性和形态分析
[0151]
根据药典9.4第2.5.12节，使用karl
‑
fischer方法(metrohm 899库仑计)，测定由如上制备的混合物制成的并且在使用或不使用硅胶的情况下保持在4℃下的冻干胶囊和本发明胶囊的可能形态变化以及湿度。使用hydranal
‑
coulomat ag作为反应物，针对每种条件分别在3粒胶囊中测试湿度。从每个胶囊的内容物中，取100mg作为等分试样并以搅拌参数速率＝10进行分析。
[0152]
结果
[0153]
从代表50g粪便的每个等分试样获得3粒冻干胶囊，而在吸附物胶囊中，获得14粒至17粒胶囊。在研究的3个月期间，没有发现任何胶囊的形态变化(就胶囊的长度或宽度而言)或气味。
[0154]
表1.胶囊的细菌培养和流式细胞术分析的结果。结果显示出活力(即活微生物群的量)
[0155][0156]
可以看出，本发明的胶囊在4℃下三个月后是稳定的。当进行含水量的表征时，发现本发明的胶囊包含非常高的含水量(参见下表2)。如此高的含量应该会对细胞的活力产生负面影响(事实上，本领域技术人员会期望细胞呈显著指数增长)。
[0157]
与此相反，由于包含吸水赋形剂，因此细菌种群与测试开始时基本保持不变。
[0158]
本发明人重复了相同的步骤，但省略了硬脂酸镁的添加。还得出结论，吸水赋形剂为微生物群提供了相同的“保护作用”。
[0159]
表2.本发明胶囊的湿度结果
[0160][0161][0162]
实施例2
[0163]
材料/方法
[0164]
为了分析在4℃下长达6个月的活细菌浓度和微生物组成，从2名不同志愿者的50克粪便(命名为m1和m2)中获取了2个样品。
[0165]
按照之前描述的方案分别处理每个样品，并通过如下方式获得吸附物胶囊：
[0166]
(a)仅添加vivapur
‑
101(即微晶纤维素)作为吸附剂(样品m1v和样品m2v)；和
[0167]
(b)如上文所公开地，将vivapur
‑
101与硬脂酸镁组合添加(样品m1vs和样品m2vs)。
[0168]
等分试样的体积(以“ml”表示)与吸附剂和硬脂酸镁的量(以“g”表示)之间的比率与以上实施例1中指出的基本相同。
[0169]
通过流式细胞术对原始样品的细菌浓度进行测试，通过16s测序对原始样品进行基因组分析，经过处理和离心(团)后，获得具有两种赋形剂组合的吸附物(m1v、m2v、m1vs和m2vs)。
[0170]
对于流式细胞术，使用live/dead baclight baclight染色和计数试剂盒(live/dead baclight staining and counting kit)(thermofisher)，对于基因组分析，使用purelinktm microbiome dna纯化试剂盒(invitrogen)提取dna，并使用kapa hifi hotsart聚合酶(roche)用miseq平台(illumina)对来自16s rrna基因的v3区域至v4区域进行测序。根据获得的测序数据，确定分类学组成并且还计算了样品的α多样性，以检查产品在微生物组成方面的稳定性。
[0171]
α多样性是指每个样品中的物种丰富度和多样性。对于该测定，计算为在样品中检测到的不同物种的数量的faith多样性指数(faith diversity index)或系统发育多样性(phylogenetic diversity，pd)包括在使用qiime2平台(www.qiime2)得到的进化分枝图中它们之间的系统发育距离。多样性分析有助于观察在产品的生产和储存过程中是否存在细菌多样性的损失。
[0172]
使用配对t检验进行统计分析，考虑p＜0.05具有统计显著性，以便使用r3.6.2版本测试结果之间的差异，图表是使用graphpad prism 8.02获得的。
[0173]
结果
[0174]
细菌浓度分析
[0175]
表3.流式细胞术的结果。
[0176]
活细菌/50g粪便m1vm2v胶囊，t＝02.02e 111.28e 11
胶囊，t＝6个月1.05e 111.21e 11
[0177]
结果显示，在mv组中，t＝0(p＝0.125)和t＝6(p＝0.029)时的胶囊之间没有显著差异。
[0178]
这些结果证实，与粪便微生物群混合的吸附剂是在4℃下对细菌活力提供长达6个月的惊人稳定作用的主要原因。
[0179]
基因组分析
[0180]
一旦确认本发明的胶囊包含大量活细胞并随时间推移而维持，那么下一步是确认来自捐赠者样品的原始细菌多样性是否也得以维持。这也是相关的，因为细菌多样性保持的时间越长，功效就能越大。
[0181]
表4.使用faith指数(pd)的α多样性结果。
[0182][0183]
从这些结果可以得出结论，当胶囊与吸附剂(mv1)一起配制时，6个月时原始样品和胶囊之间没有显著差异(p＝0.922)。这意味着包含吸附剂提供了一个适当的环境，该环境避免破坏并基本上维持了原始微生物群的完整多样性。
[0184]
表4还显示出，在根据本发明的胶囊中包含另外的赋形剂没有改变由吸附剂提供的行为，并且在6个月时在原始样品和胶囊之间没有检测到显著差异(m1vs和m2vs)。这表明吸附剂提供了强大的有益稳定作用，因为即使掺入其他赋形剂来优化胶囊的制造，这种稳定作用也不会受到负面影响，其基本上保留了起始微生物群样品的原始多样性。
[0185]
引文列表
[0186]
专利文献
[0187]
kr20080059605。
[0188]
非专利文献
[0189]
第2.5.12节：水：半微量测定，“欧洲药典9.4”，2018年，第5107页。