一种提高乳杆菌胆盐耐受能力的方法与应用与流程

1.本发明涉及食品科学技术领域，尤其涉及一种提高乳杆菌胆盐耐受能力的方法与应用。


背景技术：

2.世界卫生组织(who)和粮农组织(fao)联合将益生菌定义为“当其被摄入充足数量时，能够赋予机体某种健康益处的活的微生物”。一些乳杆菌，如嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和干酪乳杆菌是被公认的益生菌。益生菌具有多种益生功能，可以通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成，调节宿主黏膜与系统免疫功能、参与宿主碳水化合物和脂肪代谢、降低胃肠道疾病和代谢性疾病等慢性疾病的发生等功能。而益生菌充分发挥其益生效果的前提是必须有足够数量的益生菌定植于肠道中，通常认为每克(g)或毫升(ml)产品不低于106cfu。
3.胆盐是人体胆汁的主要成分，参与肠道内膳食脂质和脂溶性维生素的溶解、运输和吸收。然而由于其去垢剂的物化性质，对肠道微生物具有极高的毒性，能够破坏细菌的通透性和流动性，改变细胞表面疏水性和电势，甚至引发dna损伤，诱使蛋白质错误折叠并变性等。益生菌被人体摄入后，若能在胃肠道中存活并短暂地定植，这些细菌必须能够抵抗胆盐的有害作用。因此，益生菌抵抗胆盐胁迫的能力是其在肠道中发挥益生功效的前提。
4.随着对益生菌资源的深入开发利用，目前在市场中涌现了多种具有商业化应用价值的益生菌，而如何保持足够数量的益生菌定植于肠道，从而保证其存活率及良好的益生效果是益生菌菌种资源开发利用持续关注的问题之一。


技术实现要素：

5.本发明提供一种提高乳杆菌胆盐耐受能力的方法，利用该方法可以显著提高乳杆菌的胆盐耐受能力，有利于增加益生菌在肠道中的活菌数。同时该方法具有操作简单，成本低，实用性强、易于工业化生产等特点。
6.具体地，本发明提供如下技术方案：
7.一种提高乳杆菌胆盐耐受能力的方法，在乳酸菌的生长培养基中添加l
‑
苹果酸。
8.本发明通过在乳酸菌的生长培养基中添加苹果酸可以增强胆盐敏感乳杆菌的胆盐耐受能力，进而为提高其在肠道中的活菌数提供一种行之有效的方法。
9.优选地，所述l
‑
苹果酸的添加量为0.25
‑
5g/l。
10.优选地，所述l
‑
苹果酸用滤膜除菌后，再添加到所述乳酸菌的生长培养基中，并调ph至6.5
‑
7.0；优选地，所述滤膜孔径为0.22μm。
11.优选地，所述乳酸菌包括但不限于副干酪乳杆菌l9、植物乳杆菌wq0815、植物乳杆菌wcfs1、植物乳杆菌st
‑
iii、植物乳杆菌lb
‑
b1、干酪乳杆菌atcc393、副干酪乳杆菌atcc334、嗜酸乳杆菌la1、嗜酸乳杆菌la3、嗜酸乳杆菌la2、鼠李糖乳杆菌lgg、德氏乳杆菌保加利亚亚种dr。
12.本发明的另一目的是提供一种用于提高乳杆菌胆盐耐受能力的培养基，包括：乳酸菌的生长培养基和l
‑
苹果酸。
13.优选地，所述l
‑
苹果酸的添加量为所述生长培养基的0.25
‑
5g/l。
14.其中，所述生长培养基可以为化学限定培养基(cdm)，包括：
15.190
‑
210ml 100mm磷酸钾缓冲液，乙酸钠0.8
‑
1.2g，柠檬酸三铵0.5
‑
0.8g，抗坏血酸0.4
‑
0.6g，葡萄糖8
‑
12g，mgso
4 0.4
‑
0.6g，mnso
4 0.2
‑
0.4g，10000
×
znso4贮存液80
‑
120μl，100
×
维生素贮存液8
‑
12ml，100
×
核酸贮存液8
‑
12ml，胰蛋白胨8
‑
12g，吐温
‑
800.8
‑
1.2ml，甘油0.8
‑
1.2ml，加入800ml蒸馏水，调ph到6.5
‑
7.0，定容至1l。其中：
16.(1)100
×
维生素贮存液(1l)：泛酸钙0.1g，生物素0.25g，叶酸0.1g，烟酸0.1g，对氨基苯甲酸1.0g，盐酸吡多醇0.2g，核黄素0.1g，盐酸硫胺素0.1g；
17.(2)100
×
核酸贮存液(100ml)：腺嘌呤0.1g，鸟嘌呤0.1g，尿嘧啶0.1g，黄嘌呤0.1g，将上述四种核酸溶于100ml 0.1mnaoh溶液中；
18.(3)100mm磷酸钾缓冲液(100ml)：k2hpo
4 1.44g，kh2po40.524g溶于100ml蒸馏水；
19.(4)10000
×
znso4贮存液：0.15g znso4˙
7h2o溶于100ml水。
20.作为优选，所述培养基的制备方法包括：
21.向每升的所述的生长培养基中加入l
‑
苹果酸0.25
‑
5g，并调ph到6.5
‑
7.0。
22.优选地，所述的乳酸菌包括但不限于副干酪乳杆菌l9、植物乳杆菌wq0815、植物乳杆菌wcfs1、植物乳杆菌st
‑
iii、植物乳杆菌lb
‑
b1、干酪乳杆菌atcc393、副干酪乳杆菌atcc334、嗜酸乳杆菌la1、嗜酸乳杆菌la3、嗜酸乳杆菌la2、鼠李糖乳杆菌lgg、德氏乳杆菌保加利亚亚种dr。
23.本发明的又一目的是提供l
‑
苹果酸在提高乳杆菌胆盐耐受能力中的应用。
24.本发明的又一目的是提供上述的方法以及上述的培养基在食品工业中的应用。
25.本发明的有益效果：
26.其一：l
‑
苹果酸作为一种天然存在的二羧酸，可用作食品酸味剂、保鲜保色剂、动物饲料添加剂，用l
‑
苹果酸处理过的乳酸菌产品摄入人体是有安全性保障的；
27.其二：本发明通过利用l
‑
苹果酸提高乳杆菌胆盐耐受具有显著性，且不会对菌体本身的生长性能造成影响，能有效解决胆盐胁迫对肠道活菌数的负面影响，有利于益生菌更好的发挥其益生功效；
28.其三：本发明操作简单，成本低实用性强，对多种市售的微生态制剂和潜在功能性益生菌具有普遍适应性，在食品工业领域具有良好的应用前景。
附图说明
29.图1是本发明实例1中副干酪乳杆菌l9在混合型胆盐胁迫生长曲线；
30.图2是本发明实例1中副干酪乳杆菌l9在含有不同浓度l
‑
苹果酸的cdm培养基中对0.1％的混合型胆盐的耐受；
31.图3是本发明实例2中副干酪乳杆菌l9在不同浓度的甘氨酸脱氧胆酸钠(gdca)中的生长曲线；
32.图4是本发明实例2中副干酪乳杆菌l9在含有不同浓度l
‑
苹果酸的cdm培养基对单一胆盐甘氨酸脱氧胆酸钠(gdca)的耐受；
33.图5是本发明实例3中l
‑
苹果酸对提高多种乳杆菌的胆盐耐受性的测定。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.以下实例中：(1)100
×
维生素贮存液(1l)：泛酸钙0.1g，生物素0.25g，叶酸0.1g，烟酸0.1g，对氨基苯甲酸1.0g，盐酸吡多醇0.2g，核黄素0.1g，盐酸硫胺素0.1g；(2)100
×
核酸贮存液(100ml)：腺嘌呤0.1g，鸟嘌呤0.1g，尿嘧啶0.1g，黄嘌呤0.1g，将上述四种核酸溶于100ml 0.1m naoh溶液中；(3)100mm磷酸钾缓冲液(100ml)：k2hpo
4 1.44g，kh2po
4 0.524g溶于100ml蒸馏水；(4)10000
×
znso4贮存液：0.15g znso4˙
7h2o溶于100ml水。
36.实例1：不同浓度的l
‑
苹果酸提高副干酪乳杆菌l9对混合型胆盐抗性影响
37.本实例使用的生长培养基(cdm)包括：200ml 100mm磷酸钾缓冲液，乙酸钠1g，柠檬酸三铵0.6g，抗坏血酸0.5g，葡萄糖10g，mgso
4 0.5g，mnso
4 0.25g，10000
×
znso4贮存液100μl，100
×
维生素贮存液10ml，100
×
核酸贮存液10ml，胰蛋白胨10g，吐温
‑
80 1ml，甘油1ml，加入800ml蒸馏水，调ph到6.8，定容至1l。
38.将副干酪乳杆菌l9按2％接种于cdm培养基中，同时在培养基中添加0％
‑
0.2％浓度(w/v，g/ml，下同)的混合型胆盐，37℃静置培养，每隔两小时测定od
600
的值，通过测定生长曲线比较不同浓度的混合型胆盐对l9生长的抑制作用。结果如图1所示，随着胆盐浓度的提升，副干酪乳杆菌l9的生长速率明显变缓。而在含有0.1％混合型胆盐的培养基中生长速率约被抑制50％，可视为亚抑制浓度，因此选择0.1％浓度作为后续胆盐胁迫处理条件。
39.以0.1％混合型胆盐作为胁迫处理条件，将副干酪乳杆菌按2％接种于含0.1％混合型胆盐的cdm培养基中，同时在培养基中添加0
‑
5g/l浓度的l
‑
苹果酸，调节ph到6.8，37℃静置培养，通过测定生长曲线比较不同浓度l
‑
苹果酸对提高l9的混合型胆盐耐受能力的影响。结果如图2所示，不同浓度l
‑
苹果酸均表现出了提高l9在混合型胆盐胁迫条件下的耐受能力的作用。其中，经5g/l l
‑
苹果酸处理的副干酪乳杆菌l9在含有0.1％混合胆盐中生长速率可以由57％恢复至约80％。
40.实例2：不同浓度的l
‑
苹果酸提高副干酪乳杆菌l9对单一胆盐甘氨酸脱氧胆酸钠(gdca)抗性的影响
41.本实例使用的生长培养基同实例1。将副干酪乳杆菌l9按2％接种于cdm培养基中，同时在培养基中添加0％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％和0.12％浓度的单一胆盐gdca胆盐，37℃静置培养，每隔两小时测定od
600nm
的值。结果如图3所示，选定0.08％的gdca浓度评估不同浓度的l
‑
苹果酸对提高l9对单一胆盐gdca抗性的影响。
42.随后将副干酪乳杆菌l9按2％接种于含有0.08％gdca的cdm培养基中同时添加不同浓度的l
‑
苹果酸，调节ph到6.8。由生长曲线的测定结果可以发现，如图4所示随着l
‑
苹果酸浓度的提高，l9的胆盐耐受能力逐步增强，在第14h时5g/l的l
‑
苹果酸浓度下l9的生长速率可以由43％恢复至未加胆盐条件下的近98％。
43.实例3：l
‑
苹果酸对提高多种乳酸菌的胆盐耐受性的测定结果
44.本实例使用的cdm培养基同实例1。用cdm培养基连续活化11株不同的乳杆菌2
‑
3代，将活化好的菌株以2％接种量分别接种至l
‑
苹果酸含量为0g/l和5g/l的0.2％混合型胆盐的cdm培养基中，调节ph到6.8，37℃静置培养，测定14小时的od
600nm
的吸光度，并以生长在不添加胆盐的cdm的吸光度为对照，用胆盐处理和未处理的吸光度比值作为评估不同乳杆菌耐盐耐受能力的指标。
45.如图5所示，与添加0.2％的混合型胆盐组相比较，在胆盐中同时添加l
‑
苹果酸均可显著提高11株乳酸菌的胆盐耐受能力，包括副干酪乳杆菌l9、植物乳杆菌wq0815、植物乳杆菌wcfs1、植物乳杆菌st
‑
iii、植物乳杆菌lb
‑
b1、干酪乳杆菌atcc393、副干酪乳杆菌atcc334、嗜酸乳杆菌la1、嗜酸乳杆菌la3、嗜酸乳杆菌la2、鼠李糖乳杆菌lgg、德氏乳杆菌保加利亚亚种dr。该结果表明l
‑
苹果酸提高胆盐耐受存在普适性。
46.实例4：本实例提供一种用于提高乳杆菌胆盐耐受能力的培养基
47.将200ml 100mm磷酸钾缓冲液，乙酸钠0.8g，柠檬酸三铵0.6g，抗坏血酸0.6g，葡萄糖10g，mgso
4 0.4g，mnso
4 0.35g，10000
×
znso4贮存液110μl，100
×
维生素贮存液8.2ml，100
×
核酸贮存液12ml，胰蛋白胨10g，吐温
‑
80 1.2ml，甘油1.2ml，加入800ml蒸馏水，调ph到6.8，定容至1l。向每升上述生长培养基中加入4g l
‑
苹果酸，调节ph到6.8。
48.实例5：本实例提供一种用于提高乳杆菌胆盐耐受能力的培养基
49.将190ml 100mm磷酸钾缓冲液，乙酸钠0.8g，柠檬酸三铵0.8g，抗坏血酸0.5g，葡萄糖8g，mgso
4 0.5g，mnso
4 0.3g，10000
×
znso4贮存液80μl，100
×
维生素贮存液10ml，100
×
核酸贮存液8ml，胰蛋白胨11g，吐温
‑
80 1ml，甘油0.8ml，加入800ml蒸馏水，调ph到6.8，定容至1l。向每升上述生长培养基中加入0.3g l
‑
苹果酸，调节ph到6.8。
50.实例6：本实例提供一种用于提高乳杆菌胆盐耐受能力的培养基
51.将210ml 100mm磷酸钾缓冲液，乙酸钠1.2g，柠檬酸三铵0.5g，抗坏血酸0.4g，葡萄糖8g，mgso
4 0.6g，mnso
4 0.3g，10000
×
znso4贮存液90μl，100
×
维生素贮存液10ml，100
×
核酸贮存液10ml，胰蛋白胨8g，吐温
‑
80 1.0ml，甘油1.0ml，加入800ml蒸馏水，调ph到6.8，定容至1l。向每升上述生长培养基中加入5g l
‑
苹果酸，调节ph到6.8。
52.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。