一种分析细胞群能量代谢的方法与流程

1.本发明涉及一种分析细胞群能量代谢的方法。


背景技术：

2.能量代谢谱(em)描述了细胞产生atp(依赖性)所依赖的能量的主要来源和生化途径，以及它们利用其他替代品的潜力(能力)。em谱还决定了细胞在不同解剖部位以及暴露于内在和外在信号线索后存活的能力。该信息对于了解不同细胞类型的生理功能和细胞状态至关重要。其中，癌症干细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、神经细胞的em谱会影响其增殖、分化和执行其生理功能的能力。此外，em谱在肿瘤中也很关键，因为它可以确定转化细胞对特定代谢途径抑制剂的敏感性(wallace et al.,2010)(connolly et al.,2014；ganeshan and chawla,2014；maciver et al.,2013)。最近，对免疫代谢的研究表明免疫细胞具有严格控制和细胞类型特异性的代谢特征。这种代谢特征是通过调节em的特定基因细胞的表达获得的，这些基因是其分化程序的一部分。免疫或癌细胞特异性em谱反映了激活或分化的状态，并决定了这些细胞迁移、存活或应对不同免疫挑战的能力。
3.目前，由于免疫疗法后的临床试验的最新结果，癌症治疗正在发生一场革命。这些疗法利用适应性免疫反应的细胞毒性潜力来控制癌症的发展(assmann and finlay,2016；dougan and dranoff,2009)。这些疗法旨在恢复或产生免疫细胞的激活状态，通常直接或间接靶向细胞毒性cd8 t细胞，包括检查点抑制剂、嵌合抗原受体(car)t细胞、双特异性t细胞接合器(bites)和过继细胞转移(newick et al.,2017；page et al.,2014)。这些治疗的热情依赖于它们在某些患者身上表现出的治愈癌症的能力，即使用作三线治疗也是如此。然而，这种完全缓解反应仅在少数患者中观察到。这种异质反应产生了对标记物的需求，以更好地表征肿瘤和肿瘤浸润细胞从而识别可以从治疗中获益的患者。由于em用于确定免疫状态和肿瘤特征、并更好地表征患者的潜在用途，免疫代谢领域引起了临床肿瘤学家的注意。总之，免疫疗法靶细胞代谢状态的变化代表了一种治疗效果有效的早期预后标志物。
4.当前确定细胞能量代谢特征的方法可分为三组，均使用大量细胞培养物。第一组，使用代谢抑制剂(即2
‑
脱氧葡萄糖/2
‑
dg和寡霉素a/寡核苷酸)并监测细胞外酸化率的变化，以及不同em途径活动的其他间接但精确的结果(zhang et al.,2012)。第二组通过质谱法测量不同细胞内代谢物的水平。第三组，包括在固定细胞或裂解物中监测与特定代谢途径有关的酶活性的方法(miller et al.,2017)。除了miller等人的方法，这些技术都需要大量纯化的细胞，需要大量的操作和设备，还需要获得足够大的组织样本，因此通常不能用于表征从人类患者或活组织检查中获得的活细胞。
5.因此，考虑到生物学和医学中的多种潜在应用和目前技术的不足，仍然需要开发一种简单快速的方法来确定具有单细胞分辨率的能量代谢谱。


技术实现要素：

6.如权利要求所定义的，本发明涉及一种分析细胞群体能量代谢的方法。
7.发明详述：
8.发明人设计了一种方法，在此称为zenith，该方法在抑制不同的能量产生途径时快速且有效地测量细胞群中的蛋白质合成水平。事实上，发明人将嘌呤霉素与新型抗嘌呤霉素单克隆抗体相结合，开发了一种可靠的方法，以基于蛋白质合成强度作为读数的单细胞水平分辨率进行em分析。发明人开发的方法允许在离体非丰富细胞中以单细胞分辨率获得能量代谢谱，并允许将样品制备的操作时间、孵育和成本降低到最小。zenith是一种监测单个细胞能量代谢(em)活动的新方法，可应用于含有复杂和异质细胞群的离体样本。zenith可在数小时内完成，无需大量纯化程序、专用设备或特定技术专长。zenith的多功能性尤其扩大了人类临床样本中细胞代谢研究的范围，并且发明人在此提供了zenith能够分析来自血液或从肿瘤床分离的人类t细胞和dc亚群的em变异能力的例子，包括新发现的罕见axl cd22 dc群体。此外，通过使用免疫细胞的这种功能代谢谱，发明人能够利用单细胞rna
‑
seq数据来识别表达模式与不同功能性em谱高度相关的基因。基于该em基因列表，发明人分析了从450个人类肿瘤(即肺癌、头颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌和肝癌)中分离的分选抗原呈递细胞(apcs)的rna
‑
seq数据。他们观察到患者的apcs分为两个明显的集群，一个显示呼吸apc基因表达谱，另一个显示糖酵解apc基因表达谱。
9.因此，本发明的第一个目的涉及一种分析细胞群能量代谢谱的方法，该方法包括：
10.(1)提供所述细胞群的四个样品[s1]、[s2]、[s3]和[s4]；
[0011]
(2)在不存在任何抑制剂的情况下检测样品[s1]中的蛋白质合成水平[lco]；
[0012]
(3)将样品[s2]与抑制剂[a]接触，并测定所述样品中的蛋白质合成水平[la]；所述抑制剂[a]为糖酵解和葡萄糖衍生的丙酮酸氧化磷酸化的能量产生抑制剂；
[0013]
(4)将样品[s3]与抑制剂[b]接触，并测定所述样品中的蛋白质合成水平[lb]；所述抑制剂[b]为包括丙酮酸氧化、脂肪酸氧化和氨基酸氧化的tca循环和氧化磷酸化的能量产生抑制剂；
[0014]
(5)将样品[s4]细胞与抑制剂[a]和[b]接触，并测定所述样品中的蛋白质合成水平[l(a b)]；
[0015]
(6)评估所述细胞群的葡萄糖依赖性；
[0016]
(7)评估所述细胞群的线粒体依赖性；
[0017]
(8)评估所述细胞群的糖酵解能力；
[0018]
(9)评估所述细胞群中脂肪酸氧化和氨基酸氧化的能力，以及，
[0019]
(10)最终确定所述细胞群的能量代谢谱。
[0020]
如本文所用，术语“细胞”是指任何真核细胞。真核细胞包括但不限于卵巢细胞、上皮细胞、免疫细胞、造血细胞、骨髓细胞、循环血管祖细胞、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞、β细胞、肝细胞和神经元。此外，该术语包括多能干细胞。如本文所指，表述“多能干细胞”涉及具有分裂能力的细胞，其易于分化为一种或多种细胞类型。优选地，多能干细胞未分化。多能干细胞包括干细胞，特别是成体干细胞(例如间充质干细胞(msc))和胚胎干细胞。该术语还包括诱导多能干细胞(ips)。因此，该术语包括纯化的原代细胞和永生化细胞系。该术语还指悬浮细胞(例如循环白细胞(pbmc))或贴壁细胞(例如内皮细胞)。
[0021]
在一些实施方案中，细胞群由同质细胞群组成。如本文所用，术语“同质细胞群”是指包含一种细胞类型和/或一种细胞状态的细胞群。通常，所述细胞群预先通过任何常规方法分选或分离。
[0022]
在一些实施方案中，细胞群由异质细胞群组成。如本文所用，术语“异质细胞群”是指包含两种或更多种不同细胞类型或细胞状态的细胞群。
[0023]
例如，所述细胞群可以由从受试者(例如患者)获得的任何生物样品产生。如本文所用，术语“生物样品”是指可能含有细胞群的生物来源的任何样品。生物样品的例子包括组织、器官或体液，例如全血、血浆、血清、组织、灌洗液或任何其他样本。在一些实施方案中，生物样品是通常由活组织检查产生的组织样品。在一些实施方案中，样品是肿瘤组织样品。术语“肿瘤组织样品”是指来自患者的任何组织肿瘤样品。在一些实施方案中，肿瘤样品可以源自从患者切除的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤样品可以源自在患者的原发性肿瘤中进行的活检或在远离患者的原发性肿瘤的转移性样品中进行的活检。在一些实施方案中，肿瘤组织样品包括：(1)整体原发肿瘤(作为一个整体)，(2)来自肿瘤中心的组织样本，(3)靠近肿瘤的淋巴胰岛，(4)最靠近肿瘤的淋巴结，(5)手术前收集的肿瘤组织样本(例如用于治疗后患者的随访)和(6)远处转移。在一些实施方案中，肿瘤组织样品包括已经从肿瘤中移除的组织片或切片，包括在手术肿瘤切除之后或在收集组织样品用于活检之后。当然，肿瘤组织样本可以进行各种众所周知的收集后制备和储存技术。通常，将细胞与组织分离以制备细胞悬浮液。从初级组织中获得悬浮液的常用方法是酶解。
[0024]
在一些实施方案中，细胞群包含免疫细胞。如本文所用，术语“免疫细胞”包括源自造血并且在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞，例如b细胞和t细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如单核细胞，中性粒细胞，巨噬细胞，树突细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施方案中，细胞群包含t细胞。如本文所用，术语“t细胞”是指在细胞介导的免疫中起重要作用的一类淋巴细胞，并且通过细胞表面存在的t细胞受体区别于其他淋巴细胞，例如b细胞。已经描述了几个t细胞亚群，通常包括辅助t细胞(例如th1、th2、th9和th17细胞)、细胞毒性t细胞、记忆性t细胞、调节/抑制性t细胞(treg细胞)、自然杀伤t细胞、γ/δt细胞、和/或自体攻击性t细胞(例如th40细胞)，除非上下文另有说明。在一些实施方案中，术语“t细胞”特指辅助t细胞。在一些实施方案中，术语“t细胞”更具体地指th17细胞(即分泌il
‑
17的t细胞)。在一些实施方案中，术语“t细胞”是指调节性t细胞或“treg”细胞。
[0025]
如本文所用，本发明上下文中的术语“谱”是指定义细胞群的能量代谢谱。
[0026]
如本文所用，术语“能量代谢”表示有助于在细胞中产生或储存能量产品或代谢物的所有生物途径和反应。
[0027]
如本文所用，术语“蛋白质”在本领域具有其一般含义是指氨基酸链。术语“蛋白质合成”(或翻译)是指细胞质或内质网中的核糖体将蛋白质合成到细胞中的过程。
[0028]
如本文所用，术语“能量的产生”是指导致能量分子如三磷酸腺苷(atp)和三磷酸鸟苷(gtp)合成的进入细胞的任何过程。
[0029]
如本文所用，术语“糖酵解”在本领域具有其一般含义并且指细胞对葡萄糖的代谢氧化。在糖酵解过程中，葡萄糖被氧化成丙酮酸。通常，在有氧条件下，丙酮酸主要转化为乙酰辅酶a。当氧气耗尽时，丙酮酸转化为乳酸并作为糖酵解的主要产物排出体外。
[0030]
如本文所用，术语“丙酮酸的氧化磷酸化”在本领域中具有其一般含义，是指进入线粒体的过程，该过程包括通过氧化从克雷布斯循环产生的nadh建立穿过内膜边界的质子梯度的电子传递链。当化学渗透梯度用于驱动adp的磷酸化时，atp由atp合酶合成。电子最终转移到外源氧上，加上两个质子，形成水。
[0031]
如本文所用，术语“由丙酮酸的糖酵解和氧化磷酸化产生的能量而产生的抑制剂”是指阻断、抑制、部分或完全抑制糖酵解和丙酮酸的氧化磷酸化产生能量的任何天然或合成的化合物。根据本发明，所述抑制剂被命名为抑制剂[a]。
[0032]
在一些实施方案中，抑制剂[a]选自由2
‑
脱氧
‑
葡萄糖、2
‑
[n
‑
(7
‑
硝基苯并
‑2‑
氧杂
‑
1,3
‑
二恶醇
‑4‑
基)氨基]
‑2‑
脱氧葡萄糖/2
‑
nbdg(2
‑
[n
‑
(7
‑
nitrobenz
‑2‑
oxa
‑
1,3
‑
diaxol
‑4‑
yl)amino]
‑2‑
deoxyglucose/2
‑
nbdg)、根皮素、3
‑
溴叶酸、碘乙酸盐、氟化物和6
‑
氨基烟酰胺组成的组。
[0033]
在一些实施方案中，步骤(3)在一定量的丙酮酸存在下进行。如本文所用，术语“丙酮酸”在本领域具有其一般含义并且指丙酮酸的共轭碱基ch3cocoo
‑
。根据所述实施方案，丙酮酸的存在允许测量糖酵解依赖性(pdh依赖性)。术语“糖酵解依赖性(pdh依赖性)”是指在丙酮酸存在下糖酵解被抑制(即2
‑
脱氧葡萄糖)时细胞维持能量产生的能力。在这种情况下，丙酮酸通过pdh转化为乙酰辅酶a。
[0034]
在一些实施方案中，步骤(3)在一定量的乙酸盐存在下进行。如本文所用，术语“乙酸根”或“乙酸”在本领域中具有其一般含义，并且意指式ch3coo
‑
的离子。根据所述实施方案，丙酮酸的存在允许测量糖酵解依赖性(不依赖pdh)。术语“糖酵解依赖性(不依赖pdh)”是指在乙酸存在下糖酵解被抑制(即2
‑
脱氧葡萄糖)时细胞维持能量产生的能力。在这种情况下，乙酸可以转化为乙酰辅酶a，这取决于pdh活性。
[0035]
如本文所用，术语“pdh”在本领域具有其一般含义并且意指丙酮酸脱氢酶，一种将丙酮酸转化为乙酰辅酶a的关键调节酶；将糖酵解产物与克雷布斯循环联系起来。
[0036]
如本文所用，术语“脂肪酸氧化”或“β
‑
氧化”在本领域具有其一般含义并且指脂肪酸分子在真核生物的线粒体中分解以产生进入柠檬酸循环的乙酰辅酶a、nadh和fadh2的分解代谢过程，它们是电子传递链中使用的辅酶。
[0037]
如本文所用，术语“氨基酸氧化”在本领域具有其一般含义并且意指氨基酸氧化产生乙酰辅酶a、乙酸、丙酮酸、α
‑
酮戊二酸或其他可进入tca循环的代谢物并导致atp和/或gtp合成。
[0038]
如本文所用，术语“氧化磷酸化的能量产生的抑制剂，包括脂肪酸的氧化和氨基酸的氧化”是指阻断、抑制、部分或全部抑制氧化磷酸化能量产生的任何天然或合成化合物，包括脂肪酸的氧化和氨基酸的氧化。根据本发明，所述抑制剂被命名为抑制剂[b]。
[0039]
在一些实施方案中，所述抑制剂[b]选自由寡霉素(a/b/c/d/e/f和衍生物)、鱼藤酮、羰基氰
‑
对三氟甲氧基苯腙/fccp、曲美他嗪/tmz、2[6(4
‑
氯苯氧基)己基]环氧乙烷
‑2‑
羧酸酯/etaoxir、双
‑2‑
(5
‑
苯基乙酰胺
‑
1,3,4
‑
噻二唑
‑2‑
基)乙基硫醚/bptes和恩西地平组成的组。也可以使用其他野生型或线粒体代谢途径的突变酶抑制剂。如本文所用，术语“突变”在本领域具有其一般含义并且指dna或蛋白质序列中偏离野生型线粒体酶的任何变化。这包括单碱基dna变化、单氨基酸变化、dna多碱基变化和多氨基酸变化。这还包括基因及其相应蛋白质的插入、缺失和截断。例如，可以使用以下酶的抑制剂：柠檬酸合酶、nad 苹
果酸脱氢酶、nad 谷氨酸脱氢酶、琥珀酸细胞色素c还原酶、鱼藤酮敏感的nadh细胞色素c还原酶、腺苷酸激酶、鱼藤酮不敏感的nadh细胞色素c还原酶、单胺氧化酶和犬尿氨酸羟化酶。特别地，可以使用异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂。如本文所用，术语“idh”在本领域具有其一般含义并且指异柠檬酸脱氢酶。idh是参与柠檬酸循环的酶。它催化循环的第三步：异柠檬酸的氧化脱羧，产生α
‑
酮戊二酸(α
‑
酮戊二酸或a
‑
kg)和co2，同时将nad(p) 转化为nad(p)h。这是一个两步的过程，包括将异柠檬酸(一种仲醇)氧化成草酰琥珀酸(一种酮)，然后将β羧基脱羧成酮，形成α
‑
酮戊二酸。该酶的另一种同工型催化相同的反应；然而，该反应与柠檬酸循环无关，在细胞质以及线粒体和过氧化物酶体中进行，并使用nadp 作为辅助因子而不是nad 。idh1和idh2中的突变是本领域众所周知的并且通常存在于酶的活性位点并参与异柠檬酸结合。在许多情况下，它们是影响idh2蛋白中精氨酸140(r140)残基的错义突变。idh1突变体缺乏野生型酶将异柠檬酸转化为α
‑
酮戊二酸的能力，但获得了一种新的活性，导致a
‑
kg转化为癌代谢物
‑
羟基戊二酸(2hg)。
[0040]
如本文所用，术语“葡萄糖依赖性”是指细胞在没有葡萄糖的情况下无法产生能量。在一些实施方案中，通过计算公式(i)来评估细胞的葡萄糖依赖性：
[0041]
葡萄糖依赖性＝([lco]
‑
[la])/([lco]
‑
[l(a b)])
×
100
ꢀꢀꢀ
(i)
[0042]
如本文所用，术语“线粒体依赖性”是指细胞在没有能量线粒体途径的情况下无法产生能量。在一些实施方案中，通过计算公式(ii)来评估细胞的线粒体依赖性：
[0043]
线粒体依赖性＝([lco]
‑
[lb])/([lco]
‑
[l(a b)])
×
100
ꢀꢀꢀ
(ii)
[0044]
如本文所用，术语“糖酵解能力”是指当所有其他途径(但不包括糖酵解)被抑制时细胞产生能量的能力。在一些实施方案中，通过计算公式(iii)来评估细胞的糖酵解能力：
[0045]
糖酵解能力＝(1
‑
([lco]
‑
[lb])/([lco]
‑
[l(a b)]))
×
100
ꢀꢀꢀ
(iii)。
[0046]
如本文所用，术语“脂肪酸氧化和氨基酸氧化能力”是指当所有其他途径(但不包括脂肪酸氧化和氨基酸氧化)被抑制时细胞产生能量的能力。在一些实施方案中，通过计算公式(iv)来评估脂肪酸氧化和氨基酸氧化的能力：
[0047]
脂肪酸氧化和氨基酸氧化的能力＝(1
‑
([lco]
‑
[la])/([lco]
‑
[l(a b)]))
×
100
ꢀꢀ
(iv)
[0048]
在一些实施方案中，根据细胞类型，细胞在20至40分钟之间的短时间内与抑制剂接触。例如，在成纤维细胞中抑制20分钟就足够了，而在人血t细胞中抑制40分钟是最佳的。与抑制剂孵育更长的时间(即2小时以上)会导致不良影响，例如诱导与补偿机制有关的基因、诱导细胞死亡或激活阻断细胞代谢活动的细胞应激途径。
[0049]
在一些实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤：
[0050]
‑
提供所述细胞群的进一步样本[s5]；
[0051]
‑
将所述样品与抑制剂[c]接触，并测定所述样品中的蛋白质合成水平[lc]；所述抑制剂[c]为脂肪酸氧化的能量产生抑制剂，以及；
[0052]
‑
评估所述细胞群的脂肪酸氧化依赖性。
[0053]
如本文所用，术语“脂肪酸氧化的能量产生抑制剂”是指阻断、抑制、部分或完全抑制脂肪酸氧化的能量产生任何天然或合成化合物。根据本发明，所述抑制剂被命名为抑制剂[c]。
[0054]
在一些实施方案中，所述抑制剂[c]选自由曲美他嗪/tmz和2[6(4
‑
氯苯氧基)己基]环氧乙烷
‑2‑
羧酸酯/etamoxir组成的组。
[0055]
如本文所用，术语“脂肪酸氧化依赖性”是指当脂肪酸氧化被抑制时细胞不能产生能量并维持代谢活动。在一些实施方案中，通过计算公式(v)来评估脂肪酸氧化依赖性：
[0056]
脂肪酸氧化依赖性＝([lco]
‑
[lc])/([lco]
‑
[l(a b)])
×
100
ꢀꢀꢀ
(v)
[0057]
在一些实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤
[0058]
‑
提供所述细胞群的进一步样本[s6]；
[0059]
‑
将样品与抑制剂[d]接触，并测定所述样品中的蛋白质合成水平[ld]；所述抑制剂[d]为氨基酸氧化的能量产生抑制剂，以及；
[0060]
‑
评估所述细胞群的氨基酸氧化依赖性。
[0061]
如本文所用，术语“氨基酸氧化的能量产生抑制剂”是指阻断、抑制、部分或全部抑制由氨基酸氧化的能量产生任何天然或合成化合物。根据本发明，所述抑制剂被命名为抑制剂[d]。
[0062]
在一些实施方案中，所述抑制剂[d]选自由双
‑2‑
(5
‑
苯基乙酰胺
‑
1,3,4
‑
噻二唑
‑2‑
基)乙基硫醚/bptes、氨基氧乙酸/aoa和表没食子儿茶素没食子酸酯/egcg组成的组。
[0063]
如本文所用，术语“氨基酸氧化依赖性”是指当氨基酸氧化被抑制时细胞不能产生能量并维持代谢活动。在一些实施例中，通过计算公式(vi)来评估氨基酸氧化依赖性：
[0064]
氨基酸氧化依赖性＝([lco]
‑
[ld])/([lco]
‑
[l(a b)])
×
100(vi)
[0065]
在一些实施方案中，蛋白质合成水平的测定由本领域公知的任何方法确定。例如，蛋白质合成水平的测定如schmidt,e.k.,clavarino,g.,ceppi,m.,and pierre,p.(2009).sunset,a nonradioactive method to monitor protein synthesis.nat methods 6,275
‑
277.所描述的。简而言之，该方法是一种基于非放射性荧光激活细胞分选的测定，它允许监测和量化单个哺乳动物细胞和异质细胞群中的全蛋白质合成。更具体地，该方法涉及使用针对嘌呤霉素的单克隆抗体以使用标准免疫化学方法直接监测翻译。嘌呤霉素(puro)是一种抗生素，由于其trna
‑
aa模拟分子结构，在核糖体翻译mrna的过程中非常有效地结合到新生的多肽链中。
[0066]
因此，在一些实施方案中，使样品与一定量的嘌呤霉素接触，然后与一定量的对嘌呤霉素特异的单克隆抗体接触，所述单克隆抗体通常与可检测标记缀合。
[0067]
合适的可检测标记包括例如重金属、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测此类可检测标记的免疫缀合物的方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且在下面更详细地描述。
[0068]
在一些实施方案中，抗体用荧光化合物标记。通过将免疫偶联物暴露于适当波长的光并检测产生的荧光来确定荧光标记抗体的存在。可检测标记的具体例子包括荧光分子(或荧光染料)。许多荧光染料是本领域技术人员已知的，并且是可以选择的，例如选自life technologies(原名invitrogen)、例如参见the handbook
‑
荧光探针和标记技术指南。美国专利第5866366号授予nazarenko等人提供的可以连接(例如化学偶联)至核酸分子(例如独特的特异性结合区)上的特定荧光团的例子，如4
‑
乙酰氨基
‑
4'
‑
异硫氰基芪
‑
2,2'二磺酸，吖啶及其衍生物，如吖啶和吖啶异硫氰酸酯，5
‑
(2'
‑
氨基乙基)氨基萘
‑1‑
磺酸(edans)，4
‑
氨基
‑
n
‑
[3乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺
‑
3,5二磺酸盐(荧光黄vs)，n
‑
(4
‑
苯胺基
‑1‑
萘基)马来酰亚胺，氨基苯甲酰胺，亮黄，香豆素和衍生物如香豆素、7
‑
氨基
‑4‑
甲基香豆素(amc，香豆素120)、7
‑
氨基
‑4‑
三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青素；4',6
‑
二氨基
‑2‑
苯基吲哚
(dapi)；5',5"二溴邻苯三酚
‑
砜酞(溴邻苯三酚红)；7
‑
二乙氨基
‑3‑
(4'
‑
异硫氰酸根合苯基)
‑4‑
甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'
‑
二异硫氰酸根合二氢
‑
芪
‑
2,2'
‑
二磺酸；4,4'
‑
二异硫氰基芪
‑
2,2'
‑
二磺酸；5
‑
[二甲氨基]萘
‑1‑
磺酰氯(dns，丹磺酰氯)；4
‑
(4'
‑
二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(dabcyl)；4
‑
二甲氨基苯基偶氮苯基
‑
4'
‑
异硫氰酸酯(dabitc)；曙红及衍生物如曙红和异硫氰酸曙红；赤藓红及其衍生物如赤藓红b和赤藓红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素及其衍生物如5
‑
羧基荧光素(fam)、5
‑
4,6二氯三嗪
‑2‑
二氨基荧光素(dtaf)、2'7'二甲氧基
‑
4'5'
‑
二氯
‑6‑
羧基荧光素(joe)、荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)和qfitc q(ritc)，2',7'
‑
二氟荧光素(oregon)；荧光胺；ir144；ir1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4
‑
甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；b
‑
藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及其衍生物如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺1
‑
芘丁酸酯；活性红4(活性染料亮红3b
‑
a)；罗丹明及其衍生物如6
‑
羧基
‑
x
‑
罗丹明(rox)、6
‑
羧基罗丹明(r6g)、丽丝胺罗丹明b磺酰氯、罗丹明(rhod)、罗丹明b、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺胺罗丹明b、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；n,n,n',n'
‑
四甲基
‑6‑
羧罗丹明(tamra)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)；核黄素；迷迭香酸和铽螯合物衍生物。其他合适的荧光团包括硫醇反应性铕螯合物，其发射光强约为6.17亿(heyduk and heyduk,analyt.biochem.248:216
‑
27,1997；j.biol.chem.274:3315
‑
22,1999)，以及gfp，lissamine tm，二乙基氨基香豆素，荧光素氯三嗪，萘基荧光素，4,7
‑
二氯罗丹明和氧杂蒽(如lee等人在美国专利第5800996号所述)及其衍生物。也可以使用本领域技术人员已知的其它荧光团，例如那些可从life technologies中获得(invitrogen；molecular probes(eugene,oreg.))并包括alexa系列染料(例如美国专利第56961576130101和6716979号所述)、bodipy系列染料(二吡咯甲硼二氟化物染料，例如美国专利第4774339，5187288，5248782，5274113，5338854，5451663和5433896号所述)、级联蓝(磺化芘的胺活性衍生物如美国专利第5132432号所述)和滨海蓝(美国专利第5830912号)。标记与单克隆抗体的缀合可以使用本领域已知的标准技术来完成。这方面的典型方法由kennedy et al.,clin.chim.acta 70:1,1976；schurs et al.,clin.chim.acta 81:1,1977；shih et al.,int'l j.cancer 46:1101,1990；stein et al.,cancer res.50:1330,1990；and coligan,supra描述。
[0069]
在一些实施方案中，流式细胞术的方法是检测和测量标记的抗嘌呤霉素抗体水平的合适方法。流式细胞术是研究中被广为接受的工具，允许用户快速分析和分类样本流体中的成分。流式细胞仪使用载液(例如鞘液)使样品成分基本上一次一个通过照明区域。每个样品组分由光源例如激光照射，并且由每个样品组分散射的光被检测和分析。当样品成分离开照明区域时，可以根据它们的光学和其他特性进行分离。所述方法是本领域公知的。例如，可以使用荧光激活细胞分选(facs)，并且通常涉及使用能够同时激发和检测多个荧光团的流式细胞仪。如下所述，细胞计数系统可以包括细胞计数样本流体子系统。此外，细胞计量系统包括与细胞计量样品流体子系统流体耦合的细胞计量器。本公开的系统可以包括多个附加组件，例如数据输出设备，例如监视器、打印机和/或扬声器，数据输入设备，例如接口端口、鼠标、键盘等，流体处理组件，电源等。优选的方法通常涉及在流式细胞术前对细胞进行透化。在实施这些方法时可以使用任何方便的透化细胞的方法。
[0070]
在一些实施方案中，抗体用金属化学元素如镧系元素标记。镧系元素与其他标记
物相比具有几个优势，因为它们是稳定的同位素，有大量可用的，多达100个或更多不同的标记物，它们相对稳定，并且当使用质谱法检测时，它们具有高度可检测性且易于在检测通道之间分离。镧系元素标记还提供广泛的动态检测范围。镧系元素表现出高灵敏度，对光和时间不敏感，因此非常灵活和坚固，可用于多种不同的环境。元素周期表的镧系元素包括15种元素，其中14种具有稳定同位素(la，ce，pr，nd，sm，eu，gd，tb，dy，ho，er，tm，yb，lu)。它们也被称为稀土元素。可以使用cytof技术检测镧系元素。cytof是电感耦合等离子体飞行时间质谱(icp
‑
ms)(参见,cheung et al.,“screening:cytof—the next generation of cell detection,”nature reviews rheumatology,7:502
‑
503,2011,and bendall et al.,“single
‑
cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum,”science,332(6030):687
‑
696,2011,通过引用并入本文)。市售的cytof仪(例如fluidigm,california,usa)能够每秒分析多达1000个细胞，其参数与可用的稳定同位素标记一样多。
[0071]
在一些实施方案中，抗体与dna条形码结合用作标记感兴趣抗体的指纹。这种带有dna条形码的抗体适用于将蛋白质检测转化为定量的、可测序的读数。dna条形码是预定义序列的寡核苷酸。根据本发明，dna条形码包含至少4个核苷酸。dna条形码提供了可创建无限数量的组合的优势，这将导致抗原的特异性检测非常高，并最终可在多重分析中使用多个dna条形码抗体。例如，dna条形码抗体作为合成转录本，在大多数大规模基于寡核苷酸的scrna
‑
seq文库制备方案中被捕获(例如10x基因组学、drop
‑
seq、ddseq)。stoeckius,marlon,等人在"simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells."nature methods 14.9(2017):865.中描述了命名为cite
‑
seq方法的原理。
[0072]
在一些实施方案中，本发明的方法还包括鉴定所述细胞群中的特定细胞类型，特别是通过使用一组对某些感兴趣的细胞表面标志物特异性结合的配体(例如b细胞的bcr、cd19或cd20和t细胞的tcr、cd4、cd8、cd25)。因此，结合配体与如上所述的标记缀合。
[0073]
在一些实施例中，根据本发明方法的步骤(10)确定细胞的能量代谢特征，包括得出所述细胞呈现呼吸特征或糖酵解特征的结论。如本文所用，术语“呼吸曲线”是指细胞主要使用线粒体呼吸来产生能量。如本文所用，术语“糖酵解曲线”是指细胞主要使用糖酵解来产生能量。
[0074]
因此，本发明的方法适用于细胞群的代谢表征。tca循环(也称为krebs循环)被认为是休眠细胞的一种主要代谢途径。tca循环和氧化磷酸化在主要需要能量和寿命的细胞中有效地产生atp。tca循环是多种营养输入的纽带。最显著的，葡萄糖衍生的丙酮酸、脂肪酸或氨基酸转化为乙酰辅酶a(acetyl
‑
coa)，加入tca循环以形成柠檬酸盐。tca循环的三个主要终产物是gtp、还原型尼古丁
‑
腺嘌呤二核苷酸(nadh/h)和还原型黄素
‑
腺嘌呤二核苷酸(fadh2)。烟酰胺和黄素二核苷酸将电子转移到线粒体电子传递链并支持氧化磷酸化，最终导致atp生成。糖酵解代谢途径(也称为糖酵解)始于从环境中摄取葡萄糖，随后在胞质溶胶中进行细胞内加工以产生atp、丙酮酸和其它代谢物。糖酵解是一种相对低效的生成细胞atp的途径，每个降解的葡萄糖分子仅产生两个atp分子。然而，糖酵解允许将nad 还原为nadh，nadh被许多酶用作辅助因子并支持合成代谢的生长。糖酵解通量通过将丙酮酸还原为乳酸来维持，以回收nadh并维持nad 水平，导致细胞外介质酸化。因此，糖酵解在响应不同环境线索快速增殖细胞的代谢中起到重要的作用。
[0075]
在一些实施方案中，本发明的方法结合了至少一种另外的分析技术。在一些实施方案中，进行测序。如本文所用，术语“测序”通常是指确定核酸中核苷酸顺序的过程。用于测序核酸的多种方法是本领域公知的并且可以使用。在一些实施方案中，进行下一代测序。如本文所用，术语“下一代测序”在本领域具有一般含义，指与传统的基于sanger
‑
和毛细管电泳的方法相比具有更高通量的测序技术，例如，能够一次生成数十万或数百万个相对较短的序列读数。下一代测序技术的一些例子包括但不限于合成测序、连接测序和杂交测序。下一代测序方法的例子包括gs junior和gs flx系统(454life sciences)使用的焦磷酸测序，iilumina's的miseq和solexa系统、solid
tm
(通过寡核苷酸连接和检测进行测序)系统(life technologies inc)和离子激流测序系统例如个人基因组机器或质子测序仪(life technologies inc)和纳米孔测序系统(oxford nanopore)使用的边合成边测序。在使用iilumina的测序技术边合成边测序的情况下，源分子可以在递送到流动池之前进行pcr扩增。
[0076]
本发明的方法可以找到各种应用。
[0077]
例如，本发明的方法特别适用于确定细胞的激活状态。实际上，如实施例中所证明的，细胞的激活状态与其代谢特征直接相关。通常，急性免疫激活状态与糖酵解特征相关。如本文所用，术语“免疫激活状态”基于例如不同先天性和适应性免疫细胞(即t细胞、car t、b细胞、nk、dc等)被特定分子(即抗原、pamps、damps)的识别所刺激的证明能力。活化的细胞会改变他们的代谢特征，因此代谢特征可以是其活化状态的功能测量。
[0078]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于诊断目的。
[0079]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于诊断炎性疾病。术语“炎性疾病”在本领域具有其一般含义，指与炎症相关的任何疾病和病症。该术语可能包括但不限于(1)炎症或过敏性疾病，如全身性过敏反应或超敏反应、药物过敏、昆虫叮咬过敏；炎症性肠病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；阴道炎；牛皮癣和炎性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹；血管炎；脊柱关节病；硬皮病；呼吸道过敏性疾病，如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性肺病等；(2)自身免疫性疾病，例如关节炎(类风湿和银屑病)、骨关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、糖尿病、肾小球肾炎等；(3)移植排斥(包括同种异体移植排斥和移植物
‑
v
‑
宿主病)和(4)其他需要抑制不良炎症反应的疾病(例如动脉粥样硬化、肌炎、炎症性中枢神经系统疾病如中风和闭合性脑损伤、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、脑炎、脑膜炎、骨质疏松症、痛风、肝炎、肾炎、败血症、结节病、结膜炎、耳炎、慢性阻塞性肺病、鼻窦炎和bechet's综合征)。
[0080]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测患有癌症的患者的存活时间。本发明的方法特别适用于预测癌症患者的总生存期(os)、无进展生存期(pfs)和/或无病生存期(dfs)的持续时间。本领域的技术人员将认识到，os存活时间通常基于并表示为在特定时间内从某种类型的癌症中存活下来的人的百分比。癌症统计数据通常使用总体五年生存率。一般来说，os率并没有说明癌症幸存者是否在五年后仍在接受治疗，或者他们是否已经无癌(达到缓解)。dsf提供了更具体的信息，它是指特定癌症患者达到缓解的人数。此外，无进展生存(pfs)率(仍然患有癌症但他们的疾病没有进展的人数)包括那些可能在治疗上取得了一些成功，但癌症尚未完全消失的人。如本文所用，“短存活时间”的表述表示患者的存活时间将低于在患有所述癌症的患者的一般人群中观察到的中值(或平均值)。当患者的生
存时间短时，意味着患者将“预后不良”。相反，“长存活时间”的表述表示患者的存活时间将高于在患有所述癌症的患者的一般人群中观察到的中值(或平均值)。当患者的生存时间长时，就意味着患者“预后良好”。
[0081]
如本文所用，术语“癌症”在本领域具有一般含义，是指涉及可能侵入或扩散到身体其它部位的异常生长细胞的一组疾病。术语“癌症”还包括原发性和转移性癌症。可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于循环肿瘤细胞、来自膀胱的癌细胞、血液、骨骼、骨髓、大脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、精巢、舌头或子宫。此外，癌症可能具体具有以下组织学类型，但不限于这些：恶性肿瘤、癌、未分化的癌、巨细胞和梭形细胞癌、小细胞癌、乳突癌、鳞状细胞癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、毛基质癌、移行细胞癌、乳状移行细胞癌、腺癌、恶性胃泌素瘤、胆管癌、肝细胞癌、合并肝细胞癌和胆管癌、小梁腺癌、腺样囊性癌、腺瘤性息肉中的腺癌、家族性结肠息肉病腺癌、实体癌、恶性类瘤癌、细支气管肺泡腺癌、乳状腺癌、不染色细胞癌、嗜酸细胞癌、嗜酸性腺癌、嗜碱性粒细胞癌、透明细胞腺癌、颗粒细胞癌、滤泡性腺癌、乳状和滤泡状腺癌、非包膜硬化性癌、肾上腺皮质癌、子宫内膜样癌、皮肤附加物癌、大汗腺癌、皮脂腺癌、耵聍、腺癌、粘液表皮样癌、囊腺癌、乳状囊腺癌、乳状浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌、浸润性导管癌、髓样癌、小叶癌、炎性癌、乳腺佩吉特氏病、腺泡细胞癌、腺鳞癌、腺癌伴鳞状上皮化生、恶性胸腺瘤、恶性卵巢间质瘤、恶性泡膜细胞瘤、恶性颗粒细胞瘤和恶性肉母细胞瘤、sertoli细胞癌、恶性莱氏细胞瘤、恶性脂质细胞瘤、恶性副神经节瘤、恶性乳腺外副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、肾血管肉瘤、恶性黑色素瘤、无色素黑色素瘤、浅表扩散黑色素瘤、巨大色素痣中的恶性黑色素瘤、上皮样细胞黑色素瘤、恶性蓝痣、肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胚胎横纹肌肉瘤、肺泡横纹肌肉瘤、间质肉瘤、恶性混合瘤、苗勒管混合瘤、肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、癌肉瘤、恶性间充质瘤、恶性卵巢布伦纳氏瘤、恶性叶状肿瘤、滑膜肉瘤、恶性间皮瘤、无性细胞瘤、胚胎癌、恶性畸胎瘤、恶性卵巢癌、绒膜癌、恶性中肾瘤、血管肉瘤、恶性血管内皮瘤、卡波西肉瘤、恶性血管外皮细胞瘤、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、近皮质骨肉瘤、软骨肉瘤、恶性软骨母细胞瘤、间充质软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、尤因氏肉瘤、恶性牙源性肿瘤、成釉细胞牙髓肉瘤、恶性成釉细胞瘤、成釉细胞纤维肉瘤、恶性松果体瘤、脊索瘤、恶性胶质瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤、原生质星形细胞瘤、纤维状星形细胞瘤、星形母细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突胶质母细胞瘤、原始神经外胚层、小脑肉瘤、节细胞神经母细胞瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、嗅神经源性肿瘤、恶性脑膜瘤、神经纤维肉瘤、恶性神经鞘瘤、恶性颗粒细胞瘤、恶性淋巴瘤、霍奇金病、霍奇金淋巴瘤、副肉芽肿、小淋巴细胞恶性淋巴瘤、弥漫性大细胞恶性淋巴瘤、滤泡性恶性淋巴瘤、真菌病、其它特定的非霍奇金淋巴瘤、恶性组织细胞增生症、多发性骨髓瘤、肥大细胞肉瘤、免疫增殖性小肠疾病、白血病、淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、红白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、髓系白血病、嗜碱性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、单核细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、髓系肉瘤和毛细胞白血病。
[0082]
最近的研究表明，循环肿瘤细胞的代谢状态决定了它们产生转移或保持潜伏状态的能力。
[0083]
因此，在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测患有癌症的受试者是否
会发生转移。
[0084]
如本文所用，术语“转移”或“转移性癌症”在本领域中是众所周知的并且是指癌症在另一个器官中的扩散。作为原发肿瘤转移的结果，在远离原发病变的位置形成转移性肿瘤。这是癌症治疗中最重要的问题之一。具体而言，即使治疗了原发病变，患者也可能会因为已转移到另一个器官的肿瘤生长而死亡。
[0085]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测患有癌症的受试者是否有资格接受治疗。
[0086]
换言之，本发明的方法特别适用于预测患有癌症的受试者的治疗反应。
[0087]
例如，该疗法是化学疗法。如本文所用，术语“化学疗法”在本领域具有其一般含义并且指包括向患者施用化疗剂的治疗。化疗剂包括但不限于烷化剂如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安、苯丙硫丹和哌硫丹；氮丙啶如苯并多巴、碳醌、麦曲多巴和乌多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番茄枝内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀；cc
‑
1065(包括阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；多霉素(包括合成类似物、kw
‑
2189和cb1
‑
tm1)；五加素；胰腺抑素；一种嗜血素；海绵抑素；氮芥如苯丁酸氮芥、氯氮芥、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙铵、氧化氮芥盐酸盐、左旋溶肉瘤素、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶芥子；硝基脲类如卡莫司汀、氮脲霉素、福替司汀、环己亚硝脲、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素gammall和加利车霉素omegall；动力霉素，包括动力霉素a；二膦酸盐，如氯膦酸盐；一种拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡拉比星、洋红霉素、亲癌蛋白、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托霉素6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉
‑
阿霉素，2
‑
吡咯啉
‑
阿霉素和脱氧阿霉素)、表阿霉素、去氧阿霉素、去甲氧基柔红霉素、粘多糖霉素、丝裂霉素如丝裂霉素c、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、奎拉霉素、罗多比星、链霉黑素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌菌素、佐柔比星、抗代谢物如氨蝶呤和5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fu)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物如氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫胺嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖孢苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如弗洛林酸；乙酰丙酮；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；烯尿嘧啶；安吖啶；阿莫斯汀；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；二嗪酮；乙二胺；依利醋胺；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯奈宁；美登木素生物碱如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹丹酚；硝胺；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2
‑
乙基酰肼；甲基苄肼；psk多糖复合物)；雷佐生；根霉素；四唑呋喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"
‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是t
‑
2毒素、藜芦素a、漆斑菌素a和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；氮烯唑胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；米糖醇；哌泊溴烷；胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“ara
‑
c”)；环磷酰胺；噻替哌；紫衫烷醇，例如紫杉醇和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6
‑
硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位配合
物如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(vp
‑
16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡酮；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如cpt
‑
1 1)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇类如视黄酸；卡培他滨；和药学上可接受的盐、酸或者上述任何一种衍生物。
[0088]
在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于治疗效果的预测和预后。
[0089]
在一些实施方案中，该疗法是免疫疗法。如本文所用，术语“免疫疗法”是指对依赖于免疫反应的疾病的疗法。在一些实施方案中，免疫疗法选自由检查点抑制剂、嵌合抗原受体(car)t细胞、双特异性t细胞接合器(bite)和过继细胞疗法组成的组。术语“car t细胞疗法”是指使用表达嵌合抗原受体的t淋巴细胞的疗法。在一些实施方案中，免疫疗法涉及使用免疫检查点抑制剂。如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指阻断参与减弱免疫反应的分子的活性的物质。免疫检查点抑制剂的例子包括pd
‑
1拮抗剂、pd
‑
l1拮抗剂、pd
‑
l2拮抗剂、ctla
‑
4拮抗剂、vista拮抗剂、tim
‑
3拮抗剂、lag
‑
3拮抗剂、ido拮抗剂、kir2d拮抗剂、a2ar拮抗剂、b7
‑
h3拮抗剂、b7
‑
h4拮抗剂和btla拮抗剂。术语“双特异性t细胞接合器”(bites)是指一种由人工双特异性单克隆抗体组成的疗法，这些抗体被用作抗癌药物研究。bites靶向宿主的免疫系统，更具体地说是t细胞的细胞毒活性，以对抗癌细胞。bites在t细胞和肿瘤细胞之间形成联系，并正在临床试验中进行测试。
[0090]
如本文所用，术语“预测”是指患者对免疫疗法或化学治疗剂的治疗有反应的概率或可能性。如本文所用，术语“反应性”是指评估治疗在临床上有效或无效的可能性的能力。
[0091]
本发明的另一个目的涉及用于实施本发明方法的试剂盒或试剂。主题试剂及其试剂盒可能有很大差异。然而，本发明的试剂盒包含抑制剂[a]和[b]以及嘌呤霉素和嘌呤霉素特异性单克隆抗体。本发明的试剂盒可以进一步包含抑制剂[c]和[d]。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包含一定量的丙酮酸和/或乙酸。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含在各种方法中使用的试剂，例如用于细胞分选的抗体组。该试剂盒还可包含各种缓冲介质。试剂盒还可包括用于计算适合评估代谢特征(即不同的依赖性)的不同公式(i
‑
vi)的软件包。除了上述组件之外，主题试剂盒将进一步包括用于实施主题方法的说明。这些说明可以多种形式存在于主题试剂盒中，以其中的一种或多种形式可以存在于试剂盒中。这些说明可能存在的一种形式是在合适的介质或基材上印刷信息，例如，在试剂盒的包装中、在包装说明书中等的一张或多张纸上印有信息。另一种方式是计算机可读介质，该介质上已经记录了信息。可能存在的另一种方式是网站地址，该地址可以通过互联网用于访问被移除站点上的信息。试剂盒中可以存在任何方便的方法。上述分析方法可以体现为可由计算机执行以执行本发明的不同方面的指令程序。上面描述的任何技术都可以通过加载到计算机或其他信息设备或数字设备中的软件组件来执行。当启动时，计算机、器具或设备可以执行上述技术以帮助以上述方式分析与多个基因相关联的值组，或用于比较这些相关联值。软件组件可以从固定媒体加载或通过如互联网或其他类型的计算机网络之类的通信媒体访问。上述特征体现在一个或多个计算机程序中，可由运行此类程序的一个或多个计算机执行。软件产品(或组件)可以有形地体现在机器可读介质中，并且包括可操作以使得一个或多个数据处理装置执行如上所述的不同计算的指令。计算机也可以通过任何相关的演示来显示结果(例如图表、直方图)。本文还提供了有形地体现在机器可读介质中的软件产品(或组件)，并且包括可操作以使得一个或多个数据处理装置执行操作的指令，所述操作
包括：存储用于大量序列读数的序列数据。在有些示例中，软件产品(或组件)包括用于将序列数据分配到v、d、j、c、vj、vdj、vjc、vdjc或vj/vdj谱系使用类的指令，或用于在多维图中显示分析输出的指令。在某些情况下，多维图会枚举以下其中一项的所有可能值：v、d、j或c(例如一个三维图，其中一个轴列举了所有可能的v值，第二个轴列举了所有可能的d值，第三个轴列举了所有可能的j值)。在某些情况下，软件产品(或组件)包括用于从与条件相关的单个样本中识别一个或多个独特模式的指令。软件产品(或组件)还可以包括用于对扩增偏差进行归一化的指令。在一些示例中，软件产品(或组件)可以包括用于使用控制数据对测序错误进行归一化或用于使用聚类过程来减少测序错误的指令。软件产品(或组件)还可以包括使用两个单独的引物组或pcr过滤器来减少测序错误的说明。
[0092]
本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0093]
图1.zenith的合理性与原则。a)不同的细胞使用不同的能量来源来产生atp和gtp。这些来源主要是葡萄糖、氨基酸或脂肪酸。使用这些不同分子的细胞显示出不同的能量代谢曲线。蛋白质合成消耗了大约30％的可用细胞能量(atp/gtp)，因此会迅速受到营养缺乏的影响。b)为了使用zenith确定em谱，细胞样本被细分并在有或没有能量通路抑制剂的情况下孵育(例如无抑制剂、抑制剂a、抑制剂b和抑制剂a b)。细胞通过糖酵解产物的氧化磷酸化(glycoxphos)或通过降解脂肪酸和氨基酸(fao&glnlysis)使用糖酵解产生atp。抑制剂a阻止糖酵解和glycoxphos，而抑制剂b阻止glycoxphos、fao和氨基酸产生能量，抑制剂a和b(和/或c)的组合阻止所有来源的atp产生。处理过的大部分细胞(对照、a、b和a b)使用相同的单克隆抗体组合进行流式细胞术处理，以在短暂的嘌呤霉素脉冲后识别单个细胞和蛋白质合成水平。每种处理(能量通路抑制剂)对蛋白质合成水平的影响通过多参数流式细胞术进行量化，并使用适当的分析软件进行处理。c)从对照细胞(puro co)中的嘌呤霉素掺入水平(mfi puro)中直接推断em谱，减去在用公式中所述的不同抑制剂处理的细胞中发现的水平。
[0094]
图2.atp水平和蛋白质合成。将4x10
4 mef接种在96孔板中，并在不同的时间段用2
‑
dg oligo处理。a)蛋白质合成和rna合成抑制对atp库的影响。不存在(co)或存在翻译抑制剂(chx)、转录抑制剂(actd)或同时存在chx actd(处理5分钟)时的总atp水平。b)在2
‑
dg oligo处理后作为时间函数的atp水平。c)通过facs在单细胞中测量的2
‑
dg oligo处理后作为时间函数的翻译水平(嘌呤霉素mfi)。d)atp水平与翻译水平(puro mfi)之间的相关性。至少3个独立实验的两个尾t检验(a)(*p<0.05；**p<0.001)。n＝3个独立实验(*p<0.05；**p<0.001)。
[0095]
图3.使用mefs中的atp水平或蛋白质合成活性的em谱和人和小鼠t细胞在激活时em谱的变化。a)用代谢抑制剂处理20
‑
30分钟的mefs中的atp水平。b)使用(a)中显示的atp水平建立的em谱。c)添加代谢抑制剂后，在不同时间点用atp水平建立的em谱。d)用代谢抑制剂处理20分钟的mef中的蛋白质合成水平。e)使用(d)中显示的puro掺入水平计算的em谱。g)使用zenith分析小鼠脾脏cd8 t细胞。total puro mfi显示在对照细胞(未激活)或pma/ionomycin处理过的细胞中。h)使用(g)中显示的值建立的em谱。i)使用zenith方法在
对照(未激活)或激活(acd3/acd28珠子)中生成来自两个不同受试者(p1和p3)的人血液中枢记忆cd4 t细胞的em谱。允许识别中枢记忆cd4 t(cd3 cd4 cd45ro ccr7 )细胞的抗体组合用于估计t细胞刺激不存在或存在时的代谢特征。n＝3，至少2个独立实验的方差分析(*p<0.05；**p<0.005；***p<0.0005)。
[0096]
图4.基于flt3l在体外分化的wt和perk ko bmdc中zenith的em谱。a)使用zenith分析来自wt和cd11c
‑
cre perkflox/flox小鼠的flt3l
‑
bmdc培养物，以确定perk和er应激是否与2
‑
dg处理诱导的翻译损失有关。显示关键标记的不同dc子集(参见方法)表示为dc1(xcr1 )、dc2(cd11b )/dc3和dc6(pdc)。b)通过流式细胞术测量来自相同体外培养物的dc亚群中的嘌呤霉素掺入水平。在嘌呤霉素掺入之前，dcs与对照、2
‑
dg、oligo和2
‑
dg oligo一起温育。c)根据b)中的原始值建立的葡萄糖和线粒体依赖性或糖酵解和fao&glnlysis(fao)能力表明，即使在没有perk的情况下，细胞也会受到翻译抑制。数据显示为三只独立小鼠的平均值
±
标准差，代表两个独立实验；*p<0.05，**p<0.001。
[0097]
图5.基于骨髓来源的树突细胞亚群(bmdc)的zenith的em曲线。a)来自三只小鼠(生物复制)响应2dg、对照处理、oligomycin和2
‑
dg oligomycin的bmdc的蛋白质合成谱示例。蛋白质合成水平曲线下的面积代表细胞在每种抑制剂存在下维持代谢功能(即翻译)的能力，从而获得代谢特征(0，1，2，3，4，5)。b)来自三只(i，ii，iii)未用脂多糖刺激(左)或刺激4小时(右)的wt小鼠的flt3l衍生的bmdcs的zenith代谢谱。分析了树突细胞亚群并显示了它们的代谢特征。c)在不同dcs亚群中获得的每只小鼠(n＝3)的每个重复(n＝3)的代谢特征可用于聚类具有相似代谢特征的细胞亚群。d)在不同dc子集中获得的代谢谱的统计分析表明，dc2是对lps执行更强代谢转换的子集，而pdcs不改变它们的新陈代谢。
[0098]
图6.静息和活化t细胞的平行和zenith代谢分析。a)和zenith测量来自三个不同受试者的稳态和活化(acd3/cd28)t细胞糖酵解能力变化之间的相关性(p1、p2、p3、pearson r＝0.92；r2＝0.85；p<0.01)。b)非活化(non
‑
act)和活化t细胞(acd3/cd28)的基础耗氧率(ocr)。每个条形代表p1、p2和p3(一式三份)的平均值。c)非活化(non
‑
act)和活化t细胞(acd3/cd28)中的基础翻译水平(抗puro、几何平均荧光、强度)。每个条形代表p1、p2和p3(一式三份)的平均值。
实施例
[0099]
材料&方法
[0100]
细胞和细胞培养
[0101]
来自wt c57bl/6j(jackson)或perk ko c57bl/6j背景(zhang等人，2002)的小鼠脾细胞在含有5％胎牛血清(fcs)和50μm 2
‑
巯基乙醇(小鼠细胞)的dmem中、37℃下、5％的co2的条件下培养。从6
‑
8周龄雄性小鼠的骨髓中体外分化出gm
‑
csf bm衍生的树突细胞(gm
‑
bmdcs)，该gm
‑
csf由j558l细胞产生。将骨髓祖细胞以0.8
×
106细胞/ml、5ml/孔接种在6孔板中，并用rpmi(gibco)、5％fcs(sigma
‑
aldrich)、20μg/ml庆大霉素(sigma
‑
aldrich)、50μmβ
‑
巯基乙醇(vwr)和gm
‑
csf培养。每2天更换一次培养基；bm衍生的dcs用于第6天的实验。类似地，flt3l bm衍生的树突细胞(flt3l
‑
bmdcs)通过将flt3l添加到rpmi、10％的胎牛血清(fcs)和50μm的2
‑
巯基乙醇(小鼠细胞培养基，mccm)中，在37℃、5％的co2条件下培养6天进行分化。为了获得脾细胞，通过颈椎脱臼处死八周龄的野生型c57bl/6j小鼠并切除脾
signaling technology,catalog no.#5316)、抗
‑
ki67 pe
‑
efluor 610(ebioscience
tm
,catalog no.61
‑
5698
‑
82)cd4
‑
apc
‑
ef780(ebioscience
tm
,catalog no.47
‑
0042
‑
82)，cd8
‑
apc(ebioscience
tm
,catalog no.17
‑
0081
‑
83)，cd80
‑
percpcy5.5(biolegend
tm
,catalog no.104722)，抗
‑
b220
‑
bv421(biolegend
tm
,catalog no.103251)，抗
‑
mhc
‑
ii
‑
af700(ebioscience
tm
,catalog no.56
‑
5321
‑
82)，live/dead
tm
fixable aqua dead cell stain(invitrogen
tm
,catalog no.l34957)。根据zenith方案应用，以下抗人类抗原抗体用于对全血和pbmc进行染色。alexa fluor
‑
488小鼠抗人axl(clone 108724,r&d biosystems,cat.no.fab154g)、alexa fluor
‑
647小鼠抗嘌呤霉素(clone 12d10,millipore,cat.no.mabe343
‑
af647)、buv395小鼠抗人cd11c(clone b
‑
ly6,bd bioscience,cat.no.563787)、buv737小鼠抗人cd86(clone fun
‑
1,bd bioscience,cat.no.564428)、bv510小鼠抗人cd19(clone hib19,bd bioscience,cat.no.740164)、bv510小鼠抗人cd3(clone hit3a,bd bioscience,cat.no.564713)、bv510小鼠抗人cd56(clone b159,bd bioscience,cat.no.740171)、bv605抗人hla
‑
dr(clone l243,biolegend,cat.no.ble307640)、bv650小鼠抗人cd16(clone 3g8,bd bioscience,cat.no.563692)、bv711小鼠抗人cd14(clone m5e2,bd bioscience,cat.no.740773)、bv785小鼠抗人cd45ra(clone hi100,biolegend,cat.no.ble304140)、live dead fixable aqua dead cell stain kit死细胞染色试剂盒(life technologies,cat.no.l34957)、pe兔抗磷
‑
s6核糖体蛋白(ser235/236)单克隆(clone d57.2.2e,cell signaling,cat.no.5316s)抗体、pe大鼠抗人clec9a/cd370(clone 3a4,bd bioscience,cat.no.563488)、pe
‑
cy7小鼠抗人cd22(clone hib22,bd bioscience,cat.no.563941)、af488小鼠抗人cd38(clone hit
‑
2,biolegend,cat.no.ble303512)。
[0110]
动物研究
[0111]
购买自charles river的野生型c57bl/6小鼠在无特定病原体的条件下被饲养在ciml的动物设施中。c57bl/6胚胎在妊娠胚胎第12.5天(e12.5)耗尽所有器官和大脑，并在37℃下在pbs中的liberase tm(0.5mg/ml,roche)、dnasei(0.2mg/ml,roche)中解离15分钟，同时不断搅拌。在免疫染色和流式细胞术分析之前，用rpmi(thermo scientific)洗涤细胞悬浮液，并补充有2％热灭活fcs、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素。本研究严格按照法国农业部和欧盟《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。动物被安置在法国农业部认可的ciml动物设施中，对活老鼠进行实验。所有的动物实验都得到了d
é
partementale des services v
é
t
é
rinaires des bouches du(批准号a13
‑
543)的批准。所有的努力都是为了尽量减少动物的痛苦。
[0112]
统计分析
[0113]
使用graphpad prism软件进行统计分析。当要比较多个条件时，我们先进行单向方差分析，随后进行tukey范围检验以评估条件对之间的显着性。当仅测试两个条件时，我们根据同方差性假设的有效性(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005)进行了student的t检验或welch的t检验。
[0114]
实验结果
[0115]
鉴于在其他代谢分析技术中发现的障碍，我们的目标是开发一种方法来应对三个主要要求：a)在离体的非丰富细胞中分析em；b)将样品制备的操作时间、孵化和成本降至最
低；c)以单细胞分辨率获取em谱。em谱的变化需要激活不同的信号通路和基因重编程，使细胞能够改变它们的分解代谢。zenith正是基于这一概念并整合了细胞从降解葡萄糖、氨基酸或脂质中获得的大部分能量被蛋白质合成机制不断消耗(buttgereit and brand,1995；lindqvist et al.,2017；schimmel,1993)。设想蛋白质合成强度直接反映atp消耗，我们设计了一种方法，在抑制不同的能量产生途径后，通过流式细胞术快速有效地测量单个细胞中的蛋白质合成活性(图1)。在插图中显示并在实验中使用的两种抑制剂是2
‑
脱氧
‑
d
‑
葡萄糖(2
‑
dg，抑制剂a)和olygomycin a(oligo，抑制剂b)。葡萄糖可以通过两种方式产生atp，单独糖酵解(图1b)或糖酵解后氧化磷酸化(glycoxphos)。如图1b所示，抑制剂a的存在会阻止葡萄糖降解产生atp/gtp，并且只允许细胞从脂肪酸氧化(fao)或氨基酸氧化(即glnlysis)产生的乙酰辅酶a产生atp/gtp。与此相反，抑制剂b会损害线粒体呼吸(oxphos)产生的atp，同样导致tca循环受到抑制，从而抑制乙酰辅酶a、fao和glnlysis的能量产生，因此细胞只能通过进行糖酵解产生atp来维持蛋白质合成。具有糖酵解em谱的细胞表达一组具有核苷二磷酸激酶活性(ndpk/nme)的酶，这些酶可快速将atp交换为gtp，并且在线粒体呼吸受到抑制时能够维持翻译。与此相反，具有呼吸em谱的细胞被迫转换为糖酵解(即通过阻断线粒体呼吸)可能会产生atp以生存，但它们不适应产生gtp并且不能有效地维持蛋白质合成。
[0116]
传统上，蛋白质合成速率的测量需要使用放射性氨基酸。嘌呤霉素(puro)是一种抗生素，由于其trna
‑
aa模拟分子结构，在核糖体翻译mrna的过程中非常有效地结合到新生的多肽链中。我们之前已经开发并获得了专利的荧光单克隆抗体抗嘌呤霉素，并证明抗嘌呤霉素染色水平是蛋白质合成水平的非常精确的衡量标准。(schmidt et al.,2009,patent fr08 56499)。为了进一步优化zenith期间嘌呤霉素细胞内检测的信噪比，我们筛选并开发了一种新型单克隆抗嘌呤霉素抗体，专门适用于细胞内流式细胞术(数据未显示)。每个细胞的代谢特征是通过一组单克隆抗体的组合获得的，使我们能够识别来自不同类型的单个细胞和直接偶联荧光染料抗puro单克隆抗体以通过使用多参数流式细胞术监测蛋白质合成水平。考虑到每种抑制剂的作用机制、em途径和总蛋白质合成强度之间的直接相互作用，我们应用数学公式将从不同测量中获得的结果整合到一个简单的图表中，该图表说明了每个细胞亚群的代谢特征(图1c)。某些细胞在用抑制剂处理后补偿和改变其代谢的能力可能被误解为我们方法的缺陷。zenith测量线粒体呼吸受到抑制时细胞的糖酵解能力，以及存在2
‑
dg时的葡萄糖依赖性。在tmz(fao抑制剂)和bptes(谷氨酰胺分解抑制剂)存在的情况下，也可以计算fao和glnlysis依赖性。此外，任何来源的低依赖性可用于识别具有高度em可塑性的细胞。换句话说，与单独使用抑制剂得效果总和相比，我们量化了几种途径的抑制剂的协同程度。这种方法使我们能够识别具有更可塑性和快速适应的em代谢的细胞，这是一种信息丰富的方法，并且仅在某些细胞中观察到。
[0117]
atp水平的变化与蛋白质合成活性密切相关。
[0118]
我们的方法通过将总atp水平与流式细胞术测量的蛋白质合成相关联来验证。使用未转化的小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)，我们测试了当不同的能量途径受到抑制(oligo 2
‑
dg)时，翻译或转录抑制(分别与放线菌酮/chx、或放线菌素d/actd)是否会影响atp水平。如图2a所示，只有当添加chx时，发现atp库与oligo 2
‑
dg处理(co)相比显著更高(图2a)。这一结果表明与转录相比翻译具有更高的能量成本，与之前的结果一致，因此是细胞代谢状
态的更敏感标记。之后，为了确定它们是否显示出相似的模式，我们测试了atp合成受阻后atp水平和蛋白质合成水平如何随时间变化。我们在不同时间用oligo 2
‑
dg孵育mefs，使用(图2b)通过发光量化atp水平，并通过流式细胞术在嘌呤霉素掺入后进行蛋白质合成(图2c)。我们观察到atp水平与总蛋白质合成水平之间存在统计学上的显著相关性(图2d，pearson r＝0,985，r squared＝0,9703，p<0.0001)。这些结果表明，细胞内atp水平的变化和蛋白质合成活性的变化可能直接相关，并且翻译强度可以用作读数来监测atp可用性和合成的变化并进行em分析。
[0119]
响应代谢抑制剂的蛋白质合成水平比大量atp水平更好地描述了em活性。
[0120]
人类和小鼠胚胎成纤维细胞已显示出高耗氧率(ocr)和低细胞外酸化率(ecar)(suganya et al.,2015；zhang et al.,2012)。ocr/ecar的这一重要比率是非转化细胞的特征，这些细胞具有高线粒体活性，而糖酵解活性较低(suganya et al.,2015；zhang et al.,2012)。因此，即使在高密度培养时，mefs也不会酸化其培养基。这种表型也在静息t细胞中观察到，但当t细胞被apc激活并迅速转换为糖酵解时会迅速消失(maciver et al.,2013)。
[0121]
基于这些观察结果以及成纤维细胞和t细胞的高度线粒体依赖性，我们比较了从量化atp水平(大量atp水平)获得的em曲线与通过流动量化蛋白质合成获得的曲线。被开发用于计算atp的em谱的公式如下：
[0122][0123][0124][0125][0126]
在mefs中，使用atp水平计算的最大糖酵解能力(图3a)几乎为100％，并且明显高于最大fao&glnlysis能力(图3b，p<0.001图例)。通过进行动力学研究，尽管在用抑制剂处理后的不同时间进行计算，我们可以观察到总em曲线保持不变(图3c)，例如在寡霉素存在下atp的水平保持不变(图3a和图3b)。这些结果表明，在高度呼吸细胞中，如mefs，用代谢抑制剂处理后的整体atp水平不能反映能量线粒体依赖性。仅当2
‑
dg oligo也加入细胞时才能观察到寡霉素对呼吸的抑制。这些结果证明，由于可能的补偿机制的诱导，在抑制不同的能量产生途径时测量atp水平不能获得细胞的准确em谱。与此相反，当zenith用于描绘相同的mefs时，出现了完全不同但连贯的图片(图3d、3e和3f)。zenith揭示mefs的线粒体依赖性高于葡萄糖依赖性，fao&glnlysis能力也高于糖酵解能力(图3e，p<0.05图例)，证实了之前发表的对这些细胞em的观察结果(suganya et al.,2015；zhang et al.,2012)。为了进一步证明zenith的有效性，我们分析了用pma/离子霉素激活或未激活6小时的小鼠脾细胞(n＝51)和cd8 t细胞。cd8 t细胞激活导致em谱巨大的转变，增加代谢活动并从呼吸转变为有氧糖酵解(maciver et al.,2013)。静息的脾cd8 t细胞显示出显著低于其活化对应物的
代谢活性(图3g，p<0.0001)。确定未激活到激活的cd8 t细胞的em转换曲线，表明线粒体能量依赖性显著降低(从55％到小于15％，图3h，p<0.0001)，糖酵解能力增加，几乎达到90％(图3h，p<0.0001)。这些结果在从血液中分离的人类中枢记忆cd4 t细胞中和在用涂有激动性抗cd3和抗cd28抗体的珠子激活后得到证实(图3i)。总之，这些结果表明，通过分析暴露于代谢抑制剂的单个细胞中的蛋白质合成，zenith提供了对存在于异质群体中的单个细胞中em途径活性的各自贡献的准确测量。
[0127]
短时间暴露于2
‑
dg时的蛋白质合成抑制不是由于er应激诱导。
[0128]
先前已经表明，由于最近翻译的蛋白质的糖基化和折叠缺陷，用2
‑
dg处理细胞数小时可诱导内质网(er)应激(liu et al.,2016；marquez et al.,2017；zhang et al.,2015)。er应激诱导perk的激活，perk是一种磷酸化真核翻译起始因子2α(eif2α)的亚基的激酶，作为翻译起始的显性负抑制剂。为了解决内质网应激是否会干扰2
‑
dg处理后的蛋白质合成，我们利用了cd11c
‑
cre perkflox/flox小鼠，这些小鼠在所有dc亚群(cd11c 细胞，数据未显示)中删除了perk。在wt perkflox/flox(对照)和cd11c
‑
cre perkflox/flox dc(perk ko)中比较了2
‑
dg效应，该dcs来自骨髓前体与flt3l。不论它们的遗传背景如何，不同的dc亚群具有相同的能力来减少响应2
‑
dg的蛋白质合成，并显示出相同的em特征，这表明perk与在执行zenith所需的短2
‑
dg处理时观察到的翻译损失无关。
[0129]
体外产生和离体小鼠树突状细胞的代谢特征
[0130]
大多数关于小鼠dcs代谢的研究都是使用骨髓的体外分化培养物进行的，这些培养物能够获得大量的这种细胞。响应flt3l和gm
‑
csf的dc分化，需要在完全补充的培养基和fcs中体外培养造血前体至少一周，事先进行基于潜在流的分选或磁性纯化。这两个过程都可能导致代谢改变和与其离体对应物的重大差异。尽管gm
‑
csf bmdc作为真正相关的dc模型的有效性存在争议(guilliams and malissen,2015；helft et al.,2015；helft et al.,2016；lutz et al.,2016)，但大多数代谢研究都是使用该系统进行的(everts et al.,2012；kelly and o'neill,2015；wolf et al.,2016)。gm
‑
csf衍生的骨髓培养物产生巨噬细胞(gm
‑
macs)、树突状细胞(gm bmdcs)和未成熟dcs(helft et al.,2015；lutz et al.,2017)的异质群体。zenith的单细胞分辨率允许描述样品中低比例存在的细胞群的代谢特征，无需进一步操作和分离。如前所述(everts et al.,2012)，我们证实大部分未成熟的gm
‑
csf
‑
bmdc表现出对葡萄糖的高度依赖，并在用lps激活后转向增加糖酵解能力和减少呼吸(数据未显示)。在lps处理后，并非所有细胞都完全遵循相同的激活动力学，一些可以通过其成熟标志物的异质水平来揭示。虽然有些已经开始表现出成熟的表型，他们也开始表现出对线粒体呼吸的更高依赖性(数据未显示，lps未成熟dc 5％vs成熟dc
‑
a 45％，p<0.001)。有趣的是，该数据与之前的研究一致，表明未成熟的gm
‑
bmdcs具有与高度糖酵解人类血液单核细胞相同的em特征(数据未显示)(cheng et al.,2014；oren et al.,1963)。
[0131]
此外，我们可以在培养物中鉴定出以高水平表面mhc
‑
ii和cd86(成熟dc
‑
b，数据未显示)为特征的稳态“成熟”dcs亚群，它们显示出不同的代谢特征并在lps刺激后进行不同的代谢变化(数据未显示)。尽管该群体的起源和功能仍有待确定，使用现有技术无法对其进行识别，这进一步强调了zenith以无偏见的方式并同时在不同细胞亚群上建立em谱的能力。因此，zenith允许基于单个细胞代谢谱的聚类进行功能细胞群分类，而与其在研究样本中的丰度无关。
[0132]
还建立了衍生的flt3l和离体的脾dc的em谱。与gm
‑
csf衍生的相比，flt3l
‑
bmdc包含几个dc子集，包括dc1(xcr1 cdc)、dc2(sirpa cd11b cdc)和dc6(cd123 siglech pdcs)(merad et al.,2013)。将flt3l衍生的bmdc与新鲜分离的脾dcs进行比较，并对不同dc子集及其激活状态的em谱进行相关分析。flt3l bmdcs和脾dcs高度依赖于线粒体呼吸，在稳态条件下糖酵解能力较低，其中dc6/pdc的依赖程度最高(数据未显示)。在脾脏dc中，仅在dc1中观察到lps依赖的糖酵解转换，而在dc2和dc6中均未观察到。这种情况在flt3l
‑
bmdc中被逆转，dc2几乎完全执行糖酵解，而dc6保持不受影响。这些结果也可能取决于不同dc子集被lps直接激活的能力，其中tlr4主要在dc2上表达。总之，我们的结果表明，gm
‑
csf和flt3l
‑
bmdcs的代谢特征，并不能完全概括外植脾dcs的em特征。尽管根据所检查的dc的起源在不同的个体子集中，在lps激活后，可以观察到糖酵解的转换。然而，小鼠dcs的em谱与免疫激活水平密切相关，但与成熟无关，并且可能代表炎症状态的替代标志物。
[0133]
概括了em对稳态和活化t细胞的分析。
[0134]
t细胞在激活后代谢转变为有氧糖酵解最初是在1970年代记录的，最近使用方法得到证实。为了对我们的方法进行基准测试，我们监测了在稳定状态下或通过和并行激活时在分离的大量人类血t细胞中观察到的em变化。激活后，和均观察到t细胞的糖酵解能力增加(数据未显示)。两种方法得到的测量结果非常吻合(相关性spearman r的平方，p<0.01)(图6a)。我们观察到seahorse激活后大部分t细胞的备用呼吸能力显着降低(数据未显示)。有趣的是，seahorse ocr的增加与测量的总ps水平的并行强劲增长，尽管幅度更大(分别为图6b和6c)。总的来说，通过和获得的t细胞激活后的em谱非常一致，在此期间，翻译水平(图6c)与细胞的整体代谢活动相关，对抑制剂的反应变化证实了代谢转向t细胞活化时发生的有氧糖酵解。然而，与测量相比，显示出两个主要优势。首先，的信号幅度和测量偏差都非常出众(图6b与6c)。其次，分析是用少10倍的t细胞进行的(分别为1,2.105一式三份vs.1,2.106细胞)。此外，可以在分析中纳入完整的t细胞标记物的fcs谱，允许平行研究存在于大量样品中的不同cd3 t细胞亚群(图6)，包括初始、记忆和效应cd4 或cd8 t细胞亚群。
[0135]
对血液t细胞亚群的代谢去卷积确定了一个组成性显示高糖酵解能力的记忆cd8 t细胞亚群。
[0136]
为了扩展去卷积t细胞亚群的能力，我们接下来将应用于以前无法进行单细胞分析的混合群体。为此，我们利用了cd45ra、il7ra(cd127)、ccr7、cd45ro、cd57、pd1和穿孔素的染色，所有这些都允许对人类全血制剂中的初始和记忆cd4 和cd8 细胞进行子集分析。对这九个标记物应用抗体产生了具有不同丰度的六个表型不同的簇/亚群(数据未显示)。与之前报道的代谢活动一致，未激活的初始t细胞(cd8或cd4)以及记忆(em和cm)cd4和高度分化的cd8(hde)的代谢谱显示出中高度的线粒体依赖性(数据未显示)。与此相反，cd8早期效应记忆(eem)和自然杀伤(nk)细胞(与t细胞共同纯化，仅占细胞的5％)等较不丰富的细胞亚群显示出更高的糖酵解能力。为了确定是否在其他物种和制剂中观察到类似的代谢趋势，我们对静息和激活的小鼠脾脏t细胞和人类血液中枢记忆cd4 t细胞亚群
进行了(数据未显示)。因此，我们还可以确定小鼠和人类t细胞在激活后向高糖酵解能力和高葡萄糖依赖性的高度一致转换(数据未显示)。
[0137]
我们注意到在大量t细胞分析期间，初始细胞占42％(78％中的大部分)，因此可能会推动对未分离群体进行的em监测(图6b)。因此，测量表明“平均”糖酵解率/容量相当低，而“平均”耗氧率很高(数据未显示)。静息t细胞的seahorse分析与确定的初始t细胞代谢一致(数据未显示)。然而，seahorse分析结果完全掩盖了cd8 eem的存在，cd8 eem代表不超过5％的细胞(在每次处理中代表500个细胞，产生2000个细胞)并以稳态高糖酵解能力呈现。
[0138]
多参数分辨率的另一个重要特征是可以根据其对代谢抑制剂的敏感性独立于其表型来表征单细胞行为。这允许首先识别功能代谢异质性，然后确定不同细胞的表型或分类。作为概念证明，静息纯化的t细胞用寡霉素处理以抑制线粒体呼吸，然后再进行翻译监测。结果，绘制翻译水平的直方图显示了两种t细胞亚群，一种具有高水平的翻译，一种具有低水平的翻译(数据未显示)。在线粒体抑制时表现出高水平翻译的群体被标记为“糖酵解”，而阻止翻译的细胞被标记为“线粒体依赖”(数据未显示)。如t
‑
sne所示，糖酵解和呼吸t细胞的表型概括了我们之前的结果(数据未显示)，并表明cd45ra的表达，主要存在于初始t和nk细胞中，与“线粒体依赖性”密切相关(数据未显示)。总之，我们发现既可以测量已知的非丰度目标细胞亚群的em特征，也可以对异质样品中存在的具有有趣代谢特征的“未知”细胞进行分类和鉴定。
[0139]
分析人类肿瘤相关骨髓细胞的代谢状态。
[0140]
免疫疗法改变了肿瘤学的游戏规则，但只有一小部分患者表现出完全免疫介导的肿瘤排斥。在患者对治疗的反应中观察到的变化产生了对了解肿瘤相关免疫细胞功能状态(免疫分析)6的强烈需求。因此，我们测试了是否可用于人类肿瘤样本的平行表型和代谢分析，这将揭示比较不同来源的肿瘤免疫细胞亚群的异质性，特别是将肿瘤与无肿瘤的邻近组织进行比较。因此，我们使用来自健康供体的pmbcs、使用来自同一组织的两种癌症(外植脑膜瘤、脑转移(源自乳腺癌))进行并比较肾癌肿瘤和肾癌旁组织。在肾癌和肿瘤旁组织的情况下，和单细胞rna seq分析在同一样本上平行进行。虽然我们专注于组织设置，但在我们的结果热图中，我们包括了在健康捐赠者的血液中识别出相同免疫细胞时的em谱。我们在脑膜瘤中观察到8个不同的髓细胞群，在肾癌中观察到6个不同的亚群(数据未显示)，所有这些都由进行了分析(数据未显示)。基于em分析对不同细胞亚群进行聚类后，出现了两组，“糖酵解簇”和“呼吸簇”(数据未显示)。mono1和中性粒细胞在所有测试的血液样本和肿瘤中显示糖酵解代谢谱(数据未显示)。与此相反，mono2、dc1和dc2从肾脏肿瘤和肿瘤旁组织中分离时显示出相对较高的糖酵解能力，而这些亚群在两种脑肿瘤中显示出较高的呼吸代谢特征。相反地，肿瘤相关巨噬细胞(tam)表现出高度的线粒体依赖性，而近肿瘤巨噬细胞表现出高糖酵解能力(数据未显示)，表明肿瘤微环境改变了tam em。与近肿瘤巨噬细胞相比，tam中糖酵解能力的降低预先与肿瘤环境中免疫抑制的增加、通过营养和免疫学线索的肿瘤进展以及患者存活率低有关
32
。这些结果再次证明了的分析能力和判别能力，并表明除了肿瘤类型外，它
的解剖起源可能会影响免疫亚群的代谢，并在肿瘤环境中引入额外的异质性层。使用当前可用的批量测量，这种敏感性是未知的。
[0141]
将scrna
‑
seq和肿瘤相关骨髓细胞中的功能性能量代谢谱联系起来。
[0142]
由于之前没有观察到这些结果，而且方法是新的，我们还试图通过使用单细胞rna
‑
seq并行处理相同的样本来扩展和验证这些发现。因此，我们旨在比较每个群体中通过获得的功能性em谱和通过mrna测序获得的代谢基因表达谱。为此，我们首先确定了与血液中不同骨髓细胞的功能代谢相关的特定糖酵解和呼吸基因特征(数据未显示)。然后我们旨在测试这些糖酵解和呼吸代谢基因特征在肿瘤的不同骨髓细胞群中的表达(mrna水平)。为此，从肾癌及其邻近组织中分选骨髓细胞(cd45 lin
‑
hla
‑
dr )，并使用10x genomics chromium平台与深度测序配对进行单细胞rna
‑
seq(数据未显示)。对12801个肿瘤细胞和2080个邻近肿瘤组织的分析分别产生了6个和5个高质量的群体簇。为了严格识别骨髓细胞群，我们检查了这些群
33
的特征的表达，以在tsne表示中建立细胞身份。这个过程使我们能够识别mono1、mono2和dc集群(数据未显示)。我们专注于通过流式细胞术监测的5个单核细胞和巨噬细胞(表达mafb和/或csf1r的细胞群)，它们存在于肿瘤和贴近肿瘤组织中(数据未显示)。通过检查经典标记物(即fcgr3a/cd16 cd14(数据未显示))的表达，我们确认簇0和1代表cd14 cd16
‑
经典单核细胞。簇2代表cd14
‑
cd16 非经典单核细胞(mono2)，而簇3和4代表的cd14和cd16的共表达表明巨噬细胞样表型。总之，这些结果表明肿瘤微环境在功能上和转录水平上特异性地改变了巨噬细胞的代谢谱。因此，单细胞rna测序分析证实了通过对鉴定的所有不同骨髓细胞亚群进行获得的结果(数据未显示)。此外，与facs的数据非常一致，单核细胞簇(0,1,2)在肿瘤和贴近肿瘤组织中都表现出丰富的糖酵解特征。然而，仍然与功能数据一致，巨噬细胞(集群3)在肿瘤中显示出呼吸特征的高表达，而这在邻近肿瘤组织中检测不到(数据未显示)。正如对单核细胞所观察到的那样，树突状细胞在肿瘤和贴近肿瘤组织中都表现出丰富的糖酵解特征(数据未显示)。此外，执行使我们能够鉴定在从pbmc(数据未显示)分选的骨髓细胞上鉴定的功能基因特征，该特征可以扩展到从组织和肿瘤分选的骨髓细胞。因此，结合分析和单细胞rna测序可用于分析各种细胞类型和组织的能量代谢。
[0143]
讨论
[0144]
zenith代表了一种新颖且快速的技术，可通过流式细胞术以单细胞分辨率评估细胞的能量代谢特征。我们展示这种简单的分析方法允许将能量代谢测量与转录组数据直接整合，进而允许免疫细胞群聚类、免疫刺激活性分析和癌症患者的免疫监测。我们可以证明，虽然人类血液单核细胞和中性粒细胞在稳态下表现出非常强的葡萄糖依赖性和糖酵解能力，但树突状细胞的糖酵解能力较低，线粒体呼吸活性较高。lps激活后，dcs亚群会发生强烈的糖酵解转换，随着树突状细胞的成熟，观察到它们的线粒体依赖性增加并降低它们的糖酵解能力。
[0145]
总而言之，与血流相比，在血细胞中观察到的不同糖酵解em特征可能反映了功能要求，例如迁移中性粒细胞、单核细胞(mono1)和需要进入氧含量低的外周组织的modcs。em活动显然依赖于基因表达程序，该程序也决定功能性细胞分化，并在到达组织之前在细胞
中实施，在那里它们显示其效应器功能。因此，em分析可用于预测患者或器官的免疫状态。稳态人类血液和扁桃体dcs或脾脏衍生的dcs迁移到高度冲洗的次级淋巴组织，这种情况与其高度的线粒体依赖性相关。一旦进入次级淋巴器官，成熟的dcs可以激活初始和中枢记忆t细胞，这些t细胞在血液和淋巴流之间循环并保持其大部分生命。我们已经在这里证实，虽然初始和中枢记忆t细胞在稳定状态下表现出高线粒体依赖性(超过50％)和低糖酵解能力(低于45％)，但它们的em谱在激活后会发生显著变化，显示线粒体依赖性的降低(低于20％)和糖酵解能力的增加(高于80％)。当淋巴结中的t细胞被激活时，它们会增殖、分化为高度糖酵解的效应t细胞并重新进入血液循环，从而能够找到发炎的毛细血管后小静脉和外渗液。然而，第一次代谢转换甚至在激活后6小时发生，因此表明即使在次级淋巴器官中，如脾脏也存在需要高糖酵解潜力或与有效免疫反应相关的区域或情况。
[0146]
zenith将使研究人员能够利用多参数流式细胞术的高通量能力，该技术用于人类医学的许多领域(肿瘤学、免疫学、感染学等)的诊断，而无需实施额外的专门仪器和训练有素的人员。zenith的单细胞分辨率允许设计基于基因失活或沉默的筛选策略，以识别影响能量代谢的基因或细胞。例如，基于cas9的敲除筛选可用于鉴定参与树突细胞代谢谱调节的新基因。对显示特定代谢特征的单细胞进行分类并进行下一代测序的能力将首次允许以细胞类型特定的方式在体外鉴定参与代谢及其调节的新基因。
[0147]
该方法还可用于通过流式细胞术分析样品，也可用于通过荧光显微镜对活组织切片或整个器官进行离体成像。这将使我们能够将我们目前的解剖病理学知识与有关不同区域的新陈代谢和受损组织中的细胞活动的信息结合起来。最终，这种方法有可能成为常规病理学研究，可为需要选择针对癌症和其他疾病的最佳治疗方法的临床医生带来重要信息。这将使我们能够将我们目前的解剖病理学知识与有关不同区域的新陈代谢和受损组织中的细胞活动的信息结合起来。最终，这种方法有可能成为常规病理学研究，可为需要选择针对癌症和其他疾病的最佳治疗方法的临床医生带来重要信息。
[0148]
我们计划进行离体zenith以通过荧光显微镜对活组织切片或整个胚胎、器官和肿瘤进行成像。我们将应用这项技术来研究在免疫细胞亚群中表达报告荧光蛋白的转基因小鼠，目前可用的技术无法研究这些免疫细胞亚群，因为它们与组织和膜成分的附着使得难以将其分离为完整的单细胞悬浮液。
[0149]
肿瘤学中的免疫代谢领域具有非常有前景的应用。该技术将能够确定肿瘤细胞和浸润肿瘤的免疫细胞的代谢特征是否有助于预测肿瘤进展。从多个肿瘤组获得的转录组数据表明，与浸润肿瘤的免疫细胞的水平或种类相比，参与肿瘤代谢的基因的表达模式是肿瘤进展的更好的预测指标。因此，zenith有可能成为一种用于人类肿瘤学诊断和免疫监测的方法，人类肿瘤学是人类医学中最迫切需要新疗法和标志物的领域。
[0150]
zenith具有应用于许多基础和转化研究的潜力，尤其是在肿瘤学、免疫学和免疫代谢之间的中间阶段。它可用于分析血细胞、次级淋巴器官和肿瘤和肿瘤浸润细胞以及神经生物学。该方法不仅可用于通过流式细胞术分析样品，还可用于通过荧光显微镜对活组织切片或整个器官进行离体成像。最终，它有可能成为常规病理学研究，可为需要选择针对癌症和其他疾病的最佳治疗方法的临床医生带来重要信息。事实上，大多数研究机构和医院都可以使用流式细胞仪，zenith代表了功能代谢分析的最容易获得的方法与其他方法相比，它在灵敏度、可访问性、单细胞分辨率、读数稳定性、所需时间、与固定和分选的兼容性
方面具有多项优势。重要的是，zenith可以建立非常罕见细胞的代谢特征，例如对占从血液中分离出的总t细胞(500个细胞)的5％左右的早期效应t细胞的分析，因此，与测量(一式三份400.000)相比，灵敏度提高了大约800倍。
[0151]
鉴于em与淋巴样效应细胞和骨髓细胞的功能之间存在直接关系，zenith分析可用于定义“免疫em环境”并补充建立免疫评分，该评分定义肿瘤的免疫适应性并预测和分层患者以进行定制疗法。
[0152]
参考文献
[0153]
在本技术中，各种参考文献描述了与本发明相关的现有技术。这些参考文献的公开内容在此通过引用并入本公开内容。
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