一种对虾抗病性状的选育方法与流程

1.本发明属于水产动物育种技术领域，具体地说，是涉及对虾育种技术，更具体地说，是涉及一种对虾抗病性状的选育方法。


背景技术：

2.对虾是水产种业最具代表性的物种之一，对高质量苗种需求尤为迫切。以凡纳滨对虾为例，每年需亲虾150万对以上，苗种1.5万亿尾以上。以规模化家系为基础的选择育种技术是当前支撑对虾种业发展的核心技术。
3.对虾疾病一直困扰着其养殖业的发展，在对虾抗病良种选育过程中经常需要对养殖对虾进行人工感染实验，以研究对虾对疾病的抵抗能力。对于抗病性状来讲，如果使用感染实验中存活下来的对虾作为留种亲虾，有携带并传播病原的风险。因此，对于抗病性状的育种，通常采用保种群体与测试群体相分离的模式。具体做法是，核心群体中的每个全同胞家系个体分为两部分，一部分个体利用可视嵌入型荧光标记进行标记，混合后在特定的条件下进行性状测试；另外一部分留在单独的保种池，养至亲虾规格。依据性状测试群体的遗传评估结果，从保种群体中选择优秀的家系制定配种方案生产下一代家系。该模式虽然可以确保核心保种群体始终处于高等级的生物安保水平，但对于核心保种群体，选择仅在家系水平实施，只利用了一半的加性遗传变异，降低了育种目标性状的选择准确性和选择反应，严重影响了选育效率。
4.基因组选择育种最早由meuwissen于2001年提出，其利用覆盖全基因组的snp标记对参考群体和候选群体进行分型，根据参考群体的表型和基因型信息，获得每个snp标记的效应，利用snp效应对候选群体进行预测和评估。近年来，基因组选择育种方法在水产动物选育中进行了应用，例如，公开号为cn 110867208a的中国专利申请，公开了一种提高水产动物全基因组选择育种效率的方法，通过低密度标记实现准确的全基因组选择，充分利用了效应snp标记，提高了全基因组选择准确率。但是，其仅是对育种群体进行全基因组关联分析，获得每个snp位点的效应，筛选最优的用于全基因组选择的标记组合，作为效应snp标记，利用效应snp标记进行选择育种分析，达到降低分型成本的目的。在对虾抗病选育技术领域，还未见有基于基因组选择的方法。因此，如何将基因组选择育种技术应用到对虾抗病性状选育中，以提高选育效率，是亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种对虾抗病性状的选育方法，利用基因组选择方法估计保种群体的个体基因组育种值，利用个体基因组育种值进行个体选择，提高对虾抗病性状的选育准确性。
6.为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种对虾抗病性状的选育方法，其特征在于，所述方法包括：对已构建的对虾家系，从每个家系中选择多个个体，分别构成测试群体和保种群
体；对所述测试群体进行病原感染，获取每个死亡个体的个体存活时间；从所述测试群体内每个家系的死亡个体中选取多个个体，构建参考群体；获取所述参考群体中每个个体的dna，采用高通量snp分型技术获得参考群体的snp分型数据；基于所述参考群体的所述个体存活时间和所述参考群体的snp分型数据，估计参考群体的个体基因组育种值；根据所述参考群体的所述个体基因组育种值计算家系平均育种值，按照所述家系平均育种值从高到低对所有家系进行排名；从所有家系中选择排名在前的指定数量的家系，作为分析家系，从所述保种群体的分析家系中选择多个保种个体，采用高通量snp分型技术获得保种群体的snp分型数据；将所述参考群体的snp分型数据和所述保种群体的snp分型数据进行合并分析，获得共有snp位点，确定参考群体共有snp位点的分型数据和保种群体共有snp位点的分型数据；基于所述参考群体的所述个体存活时间、所述参考群体共有snp位点的分型数据和所述保种群体共有snp位点的分型数据，估计保种群体的个体基因组育种值；根据所述保种群体的个体基因组育种值选择保种个体进行留种和配种。
7.在其中一个优选实施例中，基于所述参考群体的所述个体存活时间和所述参考群体的snp分型数据，估计参考群体的个体基因组育种值，具体包括：基于所述参考群体的所述个体存活时间和所述参考群体的snp分型数据，利用ssbr
‑
a模型估计参考群体的个体基因组育种值；基于所述参考群体的个体存活时间、所述参考群体共有snp位点的分型数据和所述保种群体共有snp位点的分型数据，估计保种群体的个体基因组育种值，具体包括：基于所述参考群体的个体存活时间、所述参考群体共有snp位点的分型数据和所述保种群体共有snp位点的分型数据，利用ssbr
‑
a模型估计保种群体的个体基因组育种值。
8.在其中一个优选实施例中，获取所述参考群体中每个个体的dna，采用高通量snp分型获得参考群体的snp分型数据，具体包括：获取所述参考群体中每个个体的dna，利用简化基因组测序方法或基因芯片的方法进行高通量snp分型，并对获得的snp进行质量控制，质量控制后保留的snp分型数据确定为参考群体的snp分型数据。
9.在其中一个优选实施例中，从所述保种群体的分析家系中选择多个保种个体，采用高通量snp分型技术获得保种群体的snp分型数据，具体包括：获取所述分析家系中选择的每个保种个体的dna，利用简化基因组测序方法或基因芯片的方法进行高通量snp分型，并对获得的snp进行质量控制，质量控制后保留的snp分型数据确定为保种群体的snp分型数据。
10.在其中一个优选实施例中，获取所述分析家系中选择的每个保种个体的dna，具体包括：获取所述分析家系中选择的每个保种个体的触须，从触须中提取保种个体的dna。
11.在其中一个优选实施例中，从所有家系中选择排名在前的指定数量的家系，作为
分析家系，具体包括：将所有家系中排名前n%的家系确定为所述分析家系；所述n满足：10＜n＜50。
12.在其中一个优选实施例中，所述对虾家系采用下述方法构建：获取对虾种质群体，通过双列杂交方式构建育种基础群体，从所述基础群体中选取亲虾，采用巢式交配设计构建所述对虾家系。
13.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供的对虾抗病性状的选育方法中，构建测试群体和保种群体，测试群体用于病原感染，再基于参与病原感染的测试群体建立参考群体，基于参考群体中的个体存活时间、参考群体的snp分型数据及保种群体的snp分型数据估计保种群体的个体基因组育种值，最后根据保种群体的个体基因组育种值选择保种个体进行留种、配种，从而，将对虾抗病性状的选育从现有技术中的家系水平提高到保种群体中的个体水平，充分利用了对虾加性遗传变异，提高了育种抗病性状的选择准确性和选择反应；而且，通过选择测试群体中的部分个体构建参考群体，仅获取参考群体的snp分型数据，再基于参考群体的snp分型数据估计参考群体的个体基因组育种值，进而根据个体基因组育种值获取家系平均育种值，根据家系平均育种值选择排名靠前的家系作为分析家系，基于分析家系获得保种群体的snp分型数据，从而能够减少测试群体及保种群体的分型数量，降低了分型成本，同时提升选育效率。
14.结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为本发明对虾抗病性状的选育方法一个实施例的流程图；图2为采用本发明对虾抗病性状的选育方法一个具体实施例中保种群体的个体基因组育种值分布示意图；图3为采用不同模型估计个体基因组育种值预测准确性的结果示意图。
具体实施方式
17.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合附图和实施例，对本发明作进一步详细说明。
18.请参见图1，该图所示为本发明对虾抗病性状的选育方法一个实施例的流程图。
19.如图1所示，该实施例采用下述过程实现对虾抗病性状的选育。
20.步骤101：对已构建的对虾家系，从每个家系中选择多个个体，分别构成测试群体和保种群体。
21.对虾家系的构建，可以采用现有技术中构建家系的方法。
22.在一些优选实施例中，采用下述方法构建对虾家系：获取对虾种质群体，通过双列杂交的方式构建育种基础群体，从基础群体中选取亲虾，采用巢式交配设计构建对虾家系。通过双列杂交方式构建育种基础群体，能够包含丰
富的遗传变异；通过巢式交配设计构建家系，有助于在遗传评估时从加性效应中剖分出共同环境效应，使育种值估计更加准确。
23.在家系中的对虾个体长至一定长度后，从每个家系中选择部分个体，构成测试群体，用于抗病测试；选择另一部分个体，构成保种群体。一般的，每个家系中构成测试群体的个体数量小于构成保种群体的个体数量。对于保种群体，在生物安全环境下进行养殖。
24.步骤102：对测试群体进行病原感染，获取每个死亡个体的个体存活时间。
25.对于测试群体，通过可视性荧光标记组合进行不同家系的区分，然后进行病原感染。病原感染时，针对病毒病原，采用单尾口饲的方式进行人工病毒感染，具体方法可采用现有技术来实现；针对细菌病原，以家系为单位采用细菌终浓度为107cfu/ml的菌液浸泡2小时以上进行对虾人工病原感染。优选的，都选择一个较高的病原浓度进行感染，保证90%的个体在一定时间（例如，小于30天）内能够全部死亡。
26.感染结束后，参与抗病测试的对虾全部转入同一养殖池中进行混合养殖，正常投饵、换水，每隔2小时观察对虾死亡情况，并收集死亡个体，取其肌肉组织置于
‑
80℃保存，以便于后续使用。从第一尾对虾死亡开始记录个体死亡时间和所属家系，并给死亡个体编号。死亡高峰时，每隔1小时收集一次死虾；待90%以上的对虾死亡时，结束测试。死亡定义为：对虾失去平衡，倒向一侧，并对外界刺激失去反应。从感染结束开始计算，根据个体死亡时间，确定每个死亡个体的个体存活时间。
27.步骤103：从测试群体内每个家系的死亡个体中选取多个个体，构建参考群体。
28.为便于后续基因分型，从测试群体内每个家系的死亡个体中选取多个个体，所选取的个体要求具有保存较好的肌肉组织，以便于提取dna。每个家系选取的多个死亡个体作为样本，构建参考群体。
29.步骤104：获取参考群体中每个个体的dna，采用高通量snp分型技术获得参考群体的snp分型数据。
30.从参考群体中每个个体所保存的肌肉组织中提取其dna，然后，采用高通量snp分型技术获得参考群体的snp分型数据。提取dna、获得snp分型数据的过程，可采用现有技术实现。
31.在其他一些优选实施例中，在获取参考群体中每个个体的dna之后，利用简化基因组测序方法或基因芯片的方法进行高通量snp分型，并对获得的snp进行质量控制，质量控制后保留的snp分型数据确定为参考群体的snp分型数据。通过对snp进行质量控制，能够剔除数据质量较差的snp和个体，提高后续分析的准确性。
32.步骤105：基于参考群体的个体存活时间和参考群体的snp分型数据，估计参考群体的个体基因组育种值。
33.基于个体存活时间和snp分型数据估计个体基因组育种值，可以采用现有技术中的多种模型来实现。例如，采用gblup（genomic best linear unbiased prediction，基因组最佳线性无偏预测）模型、ssgblup（single
‑
step genomic best linear unbiased prediction，一步法基因组最佳线性无偏预测）模型、bayes a（贝叶斯a）模型等。
34.针对对虾抗病性状的选育，经过分析和验证，优选采用ssbr
‑
a（single
‑
step bayesian regression a，一步法贝叶斯回归a）模型估计参考群体的个体基因组育种值，能够获得准确性更高的个体基因组育种值。
35.步骤106：根据参考群体的个体基因组育种值计算家系平均育种值，按照家系平均育种值从高到低对所有家系进行排名。
36.根据个体基因组育种值计算家系平均育种值的方法，采用现有技术来实现。
37.步骤107：从所有家系中选择排名在前的指定数量的家系作为分析家系，从保种群体的分析家系中选择多个保种个体，采用高通量snp分型技术获得保种群体的snp分型数据。
38.为降低后续基因分型成本以及提高选育效率，从所有家系中选择排名在前的指定数量的家系作为分析家系，从保种群体的分析家系中选择多个保种个体，作为进行基因分型的保种个体，采用高通量snp分型技术，获得保种群体的snp分型数据。
39.在一些优选实施例中，从所有家系中选择排名在前的指定数量的家系，作为分析家系，具体包括：将所有家系中排名前n%的家系确定为分析家系。也即，将排名为前n%的所有家系的数量确定为指定数量，相应的家系作为分析家系。其中，n满足：10＜n＜50，既能减少分型的样本数量，节省分型成本，还能提高选择强度以及选育效率。
40.在获得保种群体的snp分型数据时，首先需要获得分析家系中的保种个体的dna。优选的，获取每个保种个体的触须提取其dna。例如，获取保种个体断落的触须，然后提取dna。然后，采用高通量snp分型技术获得保种群体的snp分型数据。提取dna、获得snp分型数据的具体过程，可采用现有技术实现。
41.在其他一些优选实施例中，在获取保种群体中每个个体的dna之后，利用简化基因组测序方法或基因芯片的方法进行高通量snp分型，并对获得的snp进行质量控制，质量控制后保留的snp分型数据确定为保种群体的snp分型数据。通过对snp进行质量控制，能够剔除数据质量较差的snp和个体，提高后续分析的准确性。
42.步骤108：将参考群体的snp分型数据和保种群体的snp分型数据进行合并分析，获得共有snp位点，确定参考群体共有snp位点的分型数据和保种群体共有snp位点的分型数据。
43.步骤109：基于参考群体的个体存活时间、参考群体共有snp位点的分型数据和保种群体共有snp位点的分型数据，估计保种群体的个体基因组育种值。
44.同样的，基于个体存活时间和snp分型数据估计个体基因组育种值，可以采用现有技术中的多种模型来实现。例如，采用gblup模型、ssgblup模型、bayes a模型等。
45.而针对对虾抗病性状的选育，经过分析和验证，优选采用ssbr
‑
a模型估计保种群体的个体基因组育种值，能够获得准确性更高的个体基因组育种值。
46.步骤110：根据保种群体的个体基因组育种值选择保种个体进行留种和配种。
47.具体的，选择个体基因组育种值排名靠前的保种个体进行留种和配种，实现抗病性能优良的保种个体的选育。
48.采用上述实施例的对虾抗病性状的选育方法中，构建测试群体和保种群体，实现测试群体与保种群体的分离。测试群体用于病原感染，再基于参与病原感染的测试群体建立参考群体，基于参考群体中的个体存活时间、参考群体的snp分型数据及保种群体的snp分型数据估计保种群体的个体基因组育种值，最后根据保种群体的个体基因组育种值选择保种个体进行留种、配种，从而，将对虾抗病性状的选育从现有技术中的家系水平提高到保种群体中的个体水平，充分利用了对虾加性遗传变异，提高了抗病性状育种的选择准确性
和选择反应。而且，通过选择测试群体中的部分个体构建参考群体，仅获取参考群体的snp分型数据，再基于参考群体的snp分型数据估计参考群体的个体基因组育种值，进而根据个体基因组育种值获取家系平均育种值，根据家系平均育种值选择排名靠前的家系作为分析家系，基于分析家系获得保种群体的snp分型数据，从而能够减少测试群体及保种群体的分型样本数量，同时提升选择强度以及选育效率。
49.下面以一个具体实例进一步描述基于本发明提供的方法进行对虾抗病性状的选育的过程。
50.2020年5月份，在某养殖基地构建凡纳滨对虾家系40个，其中包含6个母系半同胞家系。于7月份从每个家系中选取20尾4～5cm的个体，作为抗病测试群体，通过在个体尾部肌肉中注射不同的可视性荧光标记组合以区分不同家系，随后进行副溶血弧菌（vibrio parahaemolyticus, vp
ahpnd
）感染。另外再从每个家系随机选取100尾个体作为保种群体在遗传育种中心小水体生物安全环境下进行独立保种。
51.感染时，以家系为单位放入单独的塑料容器中，采用终浓度为107cfu/ml的vp
ahpnd
菌液浸泡3小时。感染结束后，将所有待测试个体全部转入同一大型混养池中，水温调整26
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28℃，每日按照所有对虾体重的5％分4次投喂人工配合饲料。每隔2小时观察对虾死亡情况，收集死亡个体，取肌肉组织置于
‑
80℃保存。从第一尾对虾死亡开始记录个体死亡时间和所属家系，并给死亡个体编号，将存活时间记作个体抗病性表型；死亡高峰时，每个小时收集一次死虾；待90%以上的对虾死亡时，结束测试。
52.抗病测试于2020年7月25日18:00开始，至2020年9月8日16:00结束，剩余21尾存活个体，记录有存活时间表型数据的个体数量为762尾。第一尾死亡个体与最后一尾死亡个相差1074个小时，家系平均存活时间从138.3小时至428.5小时。方差分析显示，家系间的平均存活时间差异显著（p < 0.001），表明具有较大的选择潜力和较好的选择效果。
53.从有存活时间表型记录的个体中挑选了447个肌肉组织保存较好的样本构建参考群体。采用snp芯片对447尾个体进行snp分型，获得45815个snp位点。使用plink1.9软件进行质控，剔除最小等位基因频率小于0.05与基因型检出率小于0.9的位点，剔除个体检出率小于0.8的个体，最终保留444尾个体和35927个位点。
54.基于参考群体的个体存活时间和snp分型数据，利用ssbr
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a模型估计个体抗病表型的基因组育种值。
55.使用ssbr
‑
a模型估计的参考群体的个体基因组育种值计算家系平均育种值，按家系平均育种值从高到低选择前10个家系（排名前25%），作为分析家系。从每个分析家系的保种个体中挑选健康的雌虾和雄虾各5尾，将每个保种个体的其中一个眼柄套上带有唯一编号的环状眼标作为个体标识，并取其一根触须提取基因组dna。
56.共计取样100尾个体（50尾雌虾与50尾雄虾），利用snp芯片对100个样本进行高通量snp分型，获得42300个snp位点。使用plink1.9软件进行质控，剔除最小等位基因频率小于0.05与基因型检出率小于0.9的位点，剔除个体检出率小于0.9的个体，最终保留97尾个体和31212个位点。
57.将参考群体的snp分型数据和保种群体的snp分型数据进行合并分析，获得共有snp位点，确定参考群体共有snp位点的分型数据和保种群体共有snp位点的分型数据。然后，使用ssbr
‑
a模型估计100尾保种个体的个体基因组育种值。保种群体中100尾保种个体
的个体基因组育种值分布示意图如图2所示。图2中，横坐标为家系序号，1
‑
10共10个家系；纵坐标为个体基因组育种值。从图2可以看出，家系内和家系间的个体基因组育种值都存在明显差异。最后，从保种群体中选择个体基因组育种值最高的25尾雌虾和25尾雄虾用于留种和后续配种，从而可以进一步提高遗传选择进展。
58.图3所示为采用不同模型估计个体基因组育种值预测准确性的结果示意图。
59.具体的，基于上述具体实例中获取的参考群体的个体存活时间和snp分型数据，分别利用gblup模型、ssgblup 模型、bayes a模型、bayes b（贝叶斯b）模型、bayes c（贝叶斯c）模型、ssbr
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a模型、ssbr
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b（single
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step bayesian regression b，一步法贝叶斯回归b）模型和ssbr
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c（single
‑
step bayesian regression c，一步法贝叶斯回归c）模型，估计个体抗病表型的基因组育种值。然后，采用五倍交叉验证的方法评估不同模型对基因组育种值的预测准确性。预测准确性定义为个体估计育种值与表型值间的皮尔森相关系数。交叉验证时，首先将参考群体所有个体随机均匀地分成5组，取其中1组数据作为候选群，表型设为缺失，其余4组数据合并在一起作为参考群用以计算候选群个体的育种值，然后估计育种值预测准确性。共计重复5次，使每组数据有且仅有一次机会作为候选群进行育种值估算。最后取5次的平均值作为每种模型的个体基因组育种值预测准确性。图3示出了采用各种模型估计的预测准确性的结果示意图，图中，横坐标为采用的不同模型，纵坐标为预测准确性。从图3可以看出，基于ssbr
‑
a模型的预测准确性为0.294，明显高于其他模型的预测准确性（0.17
‑
0.29），表明采用ssbr
‑
a模型进行对虾抗病性状的选育，能够获得准确性更高的个体基因组育种值。
60.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。