一种重组I型人源化胶原蛋白C1L3T及其制备方法和用途与流程

专利检索2022-05-10  5


一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域,涉及一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t及其制备方法和用途。


背景技术:

2.胶原蛋白(collagen)是生物高分子,是动物结缔组织中的主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白,其可以占到蛋白质总量的25%~30%,在某些生物体内胶原蛋白的含量甚至高达80%以上。胶原蛋白主要分布于人体的皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等处,是这些组织的主要基质和支架,保护并连结各种组织,在体内发挥着重要的生理功能。
3.胶原蛋白最普遍的结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构,即由3条a肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质,这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个a肽链在分子结构上都是由重复出现的gly

x

y(x、y代表gly之外的任何氨基酸残基,x往往是pro,y往往是hyp)肽段构成左手螺旋,3条链在氨基酸残基的相互作用下,以同一轴为中心,以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。在生物体中,胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始,经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化,受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外,还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部,胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋,从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此,按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。
4.当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中。以胶原蛋白的氨基酸组成而言:哺乳动物猪、牛与人的相似度为95%,鱼与人的相似度65%。虽然哺乳动物猪、牛等与人的胶原蛋白相似度较高,但其难以避免病毒感染以及致敏性的危险。然而人体对于食用鱼类所萃取的胶原蛋白的利用率低于65%,无法完全被人体吸收与利用。
5.综上所述,目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用,根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。


技术实现要素:

6.发明要解决的问题
7.针对上述本领域中按照原始基因序列制备的胶原蛋白难以在体外自发的组织形成正确的空间结构,异源胶原蛋白容易诱发免疫反应及生物利用率低的情况,本发明提供了一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t,同时提供了其制备方法和用途。
8.用于解决问题的方案
9.第一方面,本发明提供了一种重组i型人源化胶原蛋白c1l3t,其中,所述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t包含以seq id no.3所示的序列。
10.进一步地,上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t任选地包含以seq id no.2所示的
序列;优选地,以seq id no.2所示的序列和以seq id no.3所示的序列直接相连。
11.进一步地,上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t包含以下序列中的一种或多种:以seq id no.4所示的氨基酸序列;与以seq id no.4所示的氨基酸序列具有80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,并且其保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果;以seq id no.4所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,并且其保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果;由核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述核苷酸序列与编码以seq id no.4所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交,并且所述氨基酸序列保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果,所述严格条件是中等严格条件,中

高严格条件,高严格条件或非常高严格条件。
12.第二方面,本发明提供了多核苷酸,其编码上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t。
13.第三方面,本发明提供了表达载体,其包含上述第二方面所提供的多核苷酸。
14.第四方面,本发明提供了宿主细胞,其包含上述第三方面所提供的表达载体。
15.第五方面,本发明提供了上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的生产方法,其包括以下步骤:

在培养基中培养上述本发明在第四方面提供的宿主细胞并生产蛋白;

收获并纯化所述蛋白,优选用ni柱和/或离子交换层析纯化所述蛋白;

任选地对所述蛋白进行酶切,优选用ppase蛋白酶酶切所述蛋白。
16.第六方面,本发明提供了上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t在制备产品中的用途,其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。
17.第七方面,本发明提供了包含上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的产品,其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。
18.第八方面,本发明提供了上述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t在制备具有促进细胞黏附作用的产品中的用途。
19.发明的效果
20.通过上述技术方案的实施,本发明所制备的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的氨基酸序列源自天然胶原蛋白氨基酸序列,不仅分子量小于天然i型胶原蛋白,且相比i型胶原蛋白本身具有更加良好的细胞黏附效果,同时制备方法简单,可获得较高产量的胶原蛋白。
附图说明
21.图1为重组表达载体pet32a

c1l3t的质粒图谱,其中c1l3t对应的氨基酸序列为seq id no.4。
22.图2为蛋白c1l3t诱导表达及纯化后的凝胶电泳图,第1泳道为分子量marker,第2泳道为ppase酶切后的c1l3t蛋白,第3泳道为用ni柱提纯后的c1l3t蛋白,第4泳道为用capto q离子交换柱纯化后的c1l3t蛋白。
23.图3为商品化的人胶原蛋白和蛋白c1l3t的细胞黏附活性检测结果。
具体实施方式
24.以下对本发明的实施方式进行说明,但本发明不限定于此。除非另有说明,本发明中使用的仪器设备、试剂、材料等均可通过常规商业手段获得。
25.本发明中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中,“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生,并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
26.本发明中,“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合,进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。
27.本发明中,“医疗器械”是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品。
28.本发明中,“中等严格条件”,“中

高严格条件”,“高严格条件”或“非常高严格条件”描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见current protocols in molecular biology,john wiley&sons,n.y.(1989),6.3.1

6.3.6,其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法,且可以使用任一种。例如,具体的杂交条件如下:(1)低严格性杂交条件在6
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中,在约45℃,然后在至少50℃,在0.2
×
ssc,0.1%sds中洗涤2次(对于低严格性条件,可以将洗涤温度升高到55℃);(2)中等严格性杂交条件在6
×
ssc,在约45℃,然后在60℃,在0.2
×
ssc,0.1%sds中洗涤1次或多次;(3)高严格性杂交条件在6
×
ssc,在约45℃,然后在65℃,在0.2
×
ssc,0.1%sds中洗涤1次或多次且优选;(4)非常高的严格性杂交条件是0.5m磷酸钠,7%sds,在65℃,然后在65℃,在0.2
×
ssc,1%sds中洗涤1次或多次。
29.在本发明中,宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,例如肠杆菌科细菌、真菌和酵母等。本领域技术人员可以通过用其它表达菌株替换大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
30.在本发明中,所述核酸分子包括编码本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的核酸序列。核酸可以是dna或cdna。核酸分子可以主要由编码本发明所述蛋白的核酸序列组成,或可以仅由编码本发明所述蛋白的核酸序列组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码具有简并性,不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。
31.在本发明中,所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的,包括启动子的选择和其他调控元件,例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如,载体可以是表达载体,在该载体中,所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制,载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。
32.在本发明中,术语“载体”包括dna分子,例如质粒、噬菌体、病毒或其他载体,它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括,但不限于:λ

噬菌体、embl噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、epstein

barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。
33.在本发明中,重组i型人源化胶原蛋白c1l3t可以通过本领域中的常规方法进行制备。例如,可以通过如下步骤生产:(1)大肠杆菌基因工程菌的构建:a.获得目的基因片段;b.将目的基因片段插入pet

32a表达载体中得到相应的重组表达质粒;c.将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中,筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养及蛋白的诱导和表达:a.挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落,重悬于含有氨苄抗生素的lb液体培养基中,37℃,220rpm培养5小时,降温至16℃;b.加入终浓度为0.25mm的iptg进行诱导,培养18小时。3000rpm、4℃离心20min收集菌体。(3)蛋
白的纯化和任选的酶切:a.用tris缓冲液(25mm tris,200mm nacl,ph8.0)重悬细菌,均质破碎,17000rpm 4℃离心20分钟,收集上清液;b.利用ni6ff亲和柱结合蛋白,用含有20mm咪唑的溶液(20mm咪唑,25mm tris,200mm nacl,ph 8.0)漂洗杂蛋白,用含有250mm咪唑的溶液(250mm咪唑,25mm tris,200mm nacl,ph 8.0)洗脱目的蛋白;c.在洗脱的蛋白样品中加入适量prescission protease(ppase)蛋白酶,在16℃条件下酶切2h;d.利用capto q离子交换柱纯化目的蛋白,将上述酶切后的蛋白透析换液至a液(20mm tris,10mm nacl,ph 8.0)中,并经过capto q柱,收集流穿液,即为去除载体蛋白的目的蛋白。
34.在本发明中,所述重组i型人源化胶原蛋白c1l3t氨基酸序列部分源自i型人胶原蛋白。所述i型人胶原蛋白序列如下:
35.mfsfvdlrlllllaatallthgqeegqvegqdedippitcvqnglryhdrdvwkpepcricvcdngkvlcddvicdetkncpgaevpegeccpvcpdgsesptdqettgvegpkgdtgprgprgpagppgrdgipgqpglpgppgppgppgppglggnfapqlsygydekstggisvpgpmgpsgprglpgppgapgpqgfqgppgepgepgasgpmgprgppgppgkngddgeagkpgrpgergppgpqgarglpgtaglpgmkghrgfsgldgakgdagpagpkgepgspgengapgqmgprglpgergrpgapgpagargndgatgaagppgptgpagppgfpgavgakgeagpqgprgsegpqgvrgepgppgpagaagpagnpgadgqpgakgangapgiagapgfpgargpsgpqgpggppgpkgnsgepgapgskgdtgakgepgpvgvqgppgpageegkrgargepgptglpgppgerggpgsrgfpgadgvagpkgpagergspgpagpkgspgeagrpgeaglpgakgltgspgspgpdgktgppgpagqdgrpgppgppgargqagvmgfpgpkgaagepgkagergvpgppgavgpagkdgeagaqgppgpagpagergeqgpagspgfqglpgpagppgeagkpgeqgvpgdlgapgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpkgadgspgkdgvrgltgpigppgpagapgdkgesgpsgpagptgargapgdrgepgppgpagfagppgadgqpgakgepgdagakgdagppgpagpagppgpignvgapgakgargsagppgatgfpgaagrvgppgpsgnagppgppgpagkeggkgprgetgpagrpgevgppgppgpagekgspgadgpagapgtpgpqgiagqrgvvglpgqrgergfpglpgpsgepgkqgpsgasgergppgpmgppglagppgesgregapgaegspgrdgspgakgdrgetgpagppgapgapgapgpvgpagksgdrgetgpagpagpvgpvgargpagpqgprgdkgetgeqgdrgikghrgfsglqgppgppgspgeqgpsgasgpagprgppgsagapgkdglnglpgpigppgprgrtgdagpvgppgppgppgppgppsagfdfsflpqppqekahdggryyraddanvvrdrdlevdttlkslsqqienirspegsrknpartcrdlkmchsdwksgeywidpnqgcnldaikvfcnmetgetcvyptqpsvaqknwyisknpkdkrhvwfgesmtdgfqfeyggqgsdpadvaiqltflrlmsteasqnityhcknsvaymdqqtgnlkkalllqgsneieiraegnsrftysvtvdgctshtgawgktvieykttktsrlpiidvapldvgapdqefgfdvgpvcfl(seq id no.1)。
36.在一些实施方案中,本发明所述的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t包含以seq id no.3所示的序列,其中以seq id no.3所示的序列为i型人胶原蛋白肽段,即seq id no.1中带下划线的部分。
37.gavgpagkdgeagaqgppgpagpagergeqgpagspgfqglpgpagppgeagkpgeqgvpgdlgapgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpkgadgspgkdgvrgltgpigppgpagapgdkgesgpsgpagptgargapgdrgepgppgpagfagppgadgqpgakgep(seq id no.3)
38.在一些优选的实施方案中,本发明所述的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t包含以seq id no.3所示的序列和以seq id no.2所示的序列(gapgpccgg),其中,以seq id no.2所示的序列为增强胶原活性的肽段,优选地,以seq id no.3所示的序列和以seq id no.2
所示的序列直接相连。
39.在一些更优选的实施方案中,本发明所述的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t包含以seq id no.4所示的氨基酸序列或以seq id no.4所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的序列,只要本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t保留seq id no.4的氨基酸序列的细胞黏附效果。“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。
40.gavgpagkdgeagaqgppgpagpagergeqgpagspgfqglpgpagppgeagkpgeqgvpgdlgapgpsgargergfpgergvqgppgpagprgangapgndgakgdagapgapgsqgapglqgmpgergaaglpgpkgdrgdagpkgadgspgkdgvrgltgpigppgpagapgdkgesgpsgpagptgargapgdrgepgppgpagfagppgadgqpgakgepgapgpccgg(seq id no.4)
41.在本发明中,氨基酸添加指在氨基酸序列,例如在以seq id no.4所示的氨基酸序列的c端或n端添加氨基酸,只要本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。
42.在本发明中,氨基酸取代指在氨基酸序列,例如以seq id no.4所示的氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代,只要本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。
43.在本发明中,氨基酸插入指在氨基酸序列,例如在以seq id no.4所示的氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基,插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻,或插入的氨基酸之间都不彼此相邻,只要本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。
44.在本发明中,氨基酸缺失指可以从氨基酸序列,例如从以seq id no.4所示的氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸,只要本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t保留以seq id no.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。
45.在本发明中,取代可以是保守氨基酸取代,指与以seq id no.4所示的氨基酸序列相比,有3个,更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据下表进行氨基酸替换而产生。
46.最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val;leu;ilevalarg(r)lys;gln;asnlysasn(n)gln;his;lys;argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro;alaalahis(h)asn;gln;lys;argargile(i)leu;val;met;ala;pheleuleu(l)ile;val;met;ala;pheilelys(k)arg;gln;asnargmet(m)leu;phe;ileleu
phe(f)leu;val;ile;ala;tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr;phetyrtyr(y)trp;phe;thr;serpheval(v)ile;leu;met;phe;alaleu
47.在实际应用中,可以将本发明的蛋白多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物作为药物直接给予患者、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予患者。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型,包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中,栓剂可为阴道栓剂,也可以是阴道环,也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。所述蛋白多肽剂型可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂,如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂,可以使用本领域常用的所有稀释剂,例如,水、乙醇、聚乙二醇、1,3

丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
48.使用上述剂型可以经注射给药,包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等;腔道给药,如经直肠、阴道和舌下;呼吸道给药,如经鼻腔;粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药,优选的注射途径是皮下注射。
49.本发明的蛋白多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述缀合物、上述多聚体和上述组合物的给药剂量取决于许多因素,例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度,患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应,所用的具体活性成分,给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个,例如二、三或四个剂量形式给药。对于任何具体的患者,具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定,所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度;所采用的具体活性成分的活性;所采用的具体组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率;治疗持续时间;与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物;及医疗领域公知的类似因素。例如,本领域的做法是,活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。
50.为了更清楚地表述本发明的技术方案,下面结合具体实施例进一步说明,但不能用于限制本发明,此仅是本发明的部分实施例。
51.实施例1:重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的制备
52.1.构建c1l3t的基因表达载体
53.本实施例中使用的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t氨基酸序列全长为以seq id no.4所示的序列,共234aa,对应的基因全长702bp,针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化,优化后的序列为:ggagcagtaggacccgctgggaaagatggtgaggcaggcgcgcagggtccaccgggcccggctggcccggctggcgaacgtggcgagcaaggtccggcgggttctccgggattccagggtctgcctggcccggcgggtccgcctggcgaagctggcaaaccgggcgagcaaggcgttccgggggacctgggtgcaccgggcccgagcggtgcccgtggtgaaagaggttttccgggcgagcgcggtgtccagggcccaccggggccggcgggtccgcgtggtgcgaacggtgcccctggtaatgatggtgcgaaaggtgatgcaggtgcgccaggcgcgccaggctcgcaaggtgctccgggcttacagggtatgccgggcgagcgcggtgcggcaggcctgccggggcccaagggcgaccgtggtgacgcaggtccgaagggcgccgatggtagcccgggtaaagatggcgtgcgtggtttgaccggtcccatcggtccgccgggcccggcgggcgcgccgggcgacaaaggcgaaagcggtccgtccggcccggcgggcccgacgggtgctcgtggtgcgccaggtgaccgcggtgaaccgggcccaccgggtccggcgggcttcgccggcccgccgggcgcggatggtcagccgggtgccaagggtgagccgggtgcaccgggtccgtgttgtggtggt(seq id no.5)。
54.上述基因片段的合成由北京盛元科萌基因生物科技有限公司进行,利用限制性内切酶bamhi和xhoi将合成后的基因片段插入pet

32a表达载体的多克隆位点之间,得到对应的重组表达质粒pet32a

c1l3t,详细质粒图谱参见图1。
55.2.重组表达质粒的转化
56.将上述重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中,筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。
57.具体过程为:

将1μl的上述重组表达质粒加入到100μl的大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中,冰上静置30min;

将其置于42℃水浴锅中热激90s,然后迅速置于冰上静置2min;

向该混合物中加入700μl不含抗生素的lb(10g/l蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l氯化钠),37℃,220rpm条件下培养1h;

取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的lb平板上(10g/l蛋白胨,5g/l酵母提取物,10g/l氯化钠,15g/l琼脂,100μg/ml氨苄青霉素);

将平板倒置培养于37℃恒温箱中,培养约16h,待长出清晰可见的菌落。
58.3.目的蛋白的诱导表达
59.挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落,置于含有氨苄抗生素的lb液体培养基中,37℃,220rpm培养5小时,降温至16℃,随后加入终浓度为0.25mm的iptg进行诱导,培养18小时。3000rpm、4℃离心20min收集菌体。
60.4.c1l3t的纯化
61.(1)ni6ff亲和柱纯化蛋白
62.用tris缓冲液(25mm tris,200mm nacl,ph8.0)重悬细菌,均质破碎,17000rpm 4℃离心20分钟,收集上清液;用清水洗涤ni亲和柱柱材,用buffer 1(25mm tris,200mm nacl,ph8.0)平衡柱材,上样,用含有20mm咪唑的溶液(20mm咪唑,25mm tris,200mm nacl,ph 8.0)漂洗杂蛋白,用含有250mm咪唑的溶液(250mm咪唑,25mm tris,200mm nacl,ph 8.0)洗脱目的蛋白;用含有1m咪唑的溶液洗涤柱材,再用水洗涤柱材,最后用20%乙醇填充柱材。
63.(2)酶切纯化蛋白
64.在上述洗脱的蛋白样品中加入适量具有his标签的prescission protease(ppase)蛋白酶16℃,酶切2h。
65.(3)capto q离子交换柱纯化蛋白
66.将酶切后的蛋白透析换液至a液(20mm tris,10mm nacl,ph 8.0)中;用5倍柱体积的a液平衡capto q(cytiva公司,货号:17531610)离子交换柱,将酶切换液后的蛋白经过capto q柱,并收集流穿液,即为去除载体蛋白的目的蛋白。
67.5.c1l3t的电泳检测
68.利用sds

page检测上述所得c1l3t蛋白的纯度。具体过程为:取纯化后的蛋白液20μl,加入5μl 5
×
的蛋白上样缓冲液(250mm的tris

hcl(ph 6.8),10%sds,0.5%溴酚蓝,50%甘油,5%β

巯基乙醇),置于100℃沸水中煮5min,然后每孔10μl加入sds

page蛋白胶中,电压150v电泳1h后,用考马斯亮蓝染色液(0.1%考马斯亮蓝r

250,25%乙醇,10%冰醋酸)进行蛋白染色3min,再利用蛋白脱色液(10%醋酸,5%乙醇)进行脱色。
69.检测结果如图2,c1l3t通过电泳所得的表观分子量为35kda,分子量对应c1l3t的蛋白,表明重组i型人源化胶原蛋白c1l3t得到正确的表达。
70.实施例2:重组i型人源化胶原蛋白c1l3t的生物活性检测
71.胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献juming yao,satoshi yanagisawa,tetsuo asakura,design,expression and characterization of collagen

like proteins based on the cell adhesive and crosslinking sequences derived from native collagens,j biochem.136,643

649(2004)。具体实施方法如下:
72.(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度,包括商品化的人胶原蛋白(sigma,c7774)、本发明提供的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t。
73.具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收,利用经验公式c(μg/ml)=144
×
(a215

a225)计算蛋白质浓度,注意需在a215<1.5的情况下检测。该方法的原理是:测定肽键在远紫外光下的特征吸收,不受生色团含量的影响,干扰物质少,操作简便,适合检测考马斯亮蓝不显色的人胶原蛋白及其类似物。检测完蛋白浓度后,用pbs将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。
74.(2)向96孔板中加入100μl各种蛋白溶液和空白pbs溶液对照,室温静置60min。
75.(3)每孔中加入105个培养状态良好的3t3细胞,37℃孵育60min。
76.(4)每孔用pbs清洗4次。
77.(5)用ldh检测试剂盒(roche,04744926001)检测每孔的od
492nm
。根据空白对照的数值,可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下:细胞贴壁率=(测试孔

空白孔)
×
100%/(阳性孔

空白孔)。细胞的贴壁率即可以反应胶原蛋白的活性。蛋白的活性越高,越能在短时间给细胞提供优质的外环境,帮助细胞贴壁。
78.结果如图3所示,从对比中可知,本发明的重组i型人源化胶原蛋白c1l3t相比于商品化的人胶原蛋白具有更加优秀的生物黏附活性。
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