一种红霉素降解菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种红霉素降解菌iurm b56及其应用。


背景技术：

2.我国作为世界上最大的抗生素原料药生产大国，每年产生大量抗生素菌渣，其成分复杂，直接排放将会给自然生态环境带来致命破坏，对人体健康构成潜在威胁。抗生素菌渣是制药行业中经微生物发酵后产生的废弃物。
3.红霉素药厂生产过程中极易易产生大量具有严重污染的菌渣，其主要成分是培养红霉素产生的菌丝体、废弃的培养基、发酵过程中产生的代谢产物、降解红霉素菌以及少量的红霉素等，菌渣含有一定量的红霉素废弃物会被国家部门认定为危险废弃物。处理不当不仅极易造成生态危害和环境污染，还会造成资源浪费。菌渣暴露在空气中一段时间后会变黑、液化、发出恶臭气味，直接影响周围居民的生活环境。
4.目前红霉素菌渣处理方法主要有：填埋、焚烧、高温水热、干燥处理、氧化处理以及高能电子束处理等。近几年来，由于红霉素产量的不断增加，红霉素菌渣的产生量也不断增加，处理成本较大、能量消耗大且国家重点整治土壤污染问题，因此，需要开发新的绿色环保的方法来对其合理利用，合理利用后的红霉素菌渣，不仅解决了环境污染问题，还能作为资源和能源进行开发。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂。本发明的红霉素降解菌iurm b56可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到48％
‑
70％。
6.为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
7.一种红霉素降解菌，其特征在于，分类命名为肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)，已于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.20855。
8.进一步的，所述菌种的16s rrna基因序列如seq id no.1所示。
9.本发明还提供上述红霉素降解菌的鉴定方法，采用pcr进行dna测序，引物序列为：
10.27f：5’agagtttgatcctggctcag 3’；
11.1492r：5’ggttaccttgttacgactt 3’。
12.本发明的第二个目的是提供了上述红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56在制备用于红霉素降解的制剂中的应用。
13.本发明的第三个目的是提供了上述红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56在制备用于红霉素环境污染后修复的制剂中的应用。
14.本发明的第四个目的是提供了上述红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56在制备用于红霉素残留污染后土壤修复的制剂中的应用。
15.本发明的第五个目的是提供了上述红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56在制备用于红霉素残留污染后水体修复的制剂中的应用。
16.本发明的第六个目的是提供了一种降解红霉素的方法，将上述的红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56制备成干粉，干粉可直接接种于红霉素污染的环境中，混合均匀后即可实现降解红霉素。
17.进一步的，上述的一种降解红霉素的方法，培养时间为72h，发现最适合降解的温度为20～35℃，最适宜ph值为6.5～8.5。
18.本发明的第七个目的是提供了一种红霉素降解菌干粉剂，所述干粉剂中含有上述的红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56，根据当地受污染情况，将此干粉剂以一定比例均匀撒入土壤或者水体中即可降解其中的红霉素。
19.本发明的第八个目的是提供了上述一种红霉素降解菌干粉剂的制备方法，是将红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56通过1000l发酵罐培养48h扩大培养后，再经过离心收集菌泥，在冷冻干燥14h后，进行产品纯度检测，最终制得该红霉素降解菌干粉剂，每克干粉含菌体数量为7.57*10
12
cfu。
20.本发明的有益效果为：
21.本发明提供的红霉素降解菌及其应用，以及降解红霉素的方法、红霉素降解菌干粉剂，是通过微生物技术法，即根据红霉素的特性，从特定环境条件中或者通过改造，得到能够降解红霉素的微生物，通过大环内酯酶，转移酶，裂解酶等对红霉素结构进行破坏，得到co2和水等无污染的代谢产物。实验证明，本发明的红霉素降解菌iurm b56可以在红霉素为唯一碳源的环境中存活，具有很高的红霉素降解活性，红霉素降解率可达到50％
‑
75％。本发明所提供的红霉素降解菌iurm b56可以应用于污染环境中的红霉素降解，在水处理和土壤修复方面具有很好的应用价值。
附图说明
22.图1显示为红霉素降解菌klebsiella pneumoniae iurm b56的单菌落形态图。
23.图2显示为实施例2的红霉素降解曲线。
24.图3显示为实施例3的红霉素降解曲线。
25.图4显示为实施例4的红霉素降解曲线。
具体实施方式
26.实施例1
27.本红霉素降解菌iurm b56的筛选方法包括以下步骤：
28.⑴
接种微生物：将含菌污泥水样接种于富集培养基中，置于35℃、150rpm的摇床中培养，富集培养基的配制组成和重量如下：kh2po
4 0.51g，mgso4·
7h2o0.12g，k2hpo
4 1.5g，(nh4)2so
4 1.0g，nacl 5.0g，红霉素100mg/l，蒸馏水1l；
29.⑵
培养微生物：将步骤
⑴
中接种后的微生物每3天转移培养物至新的富集培养基，持续富集培养20天，保证所需微生物菌种的充分生长；
30.⑶
驯化微生物：将步骤
⑵
中富集培养后的菌液在35℃、150rpm摇床的条件下，接种至按梯度递增的含有红霉素的富集培养基中进行梯度驯化，每3天作为一个梯度驯化周期，驯化10天后得到经驯化处理的微生物；
31.⑷
筛选微生物：将步骤
⑶
中驯化后的微生物菌液按10倍梯度稀释法制成浓度为10
‑5，10
‑6，10
‑7的悬浮菌液后，均匀涂布于分离培养基中，在35℃恒温培养箱中培养24h后获得形状不同的红霉素降解菌，其中，分离培养基的配制组成和重量如下：无机盐培养液1000ml，琼脂18g，而无机盐培养液的配制组成和重量如下kh2po
4 0.3g，mgso4·
7h2o 0.12g，k2hpo
4 1.5g，(nh4)2so
4 1.0g，nacl 5.0g，蒸馏水1l，并用接种环将平板中菌落接种到含分离培养基的三角瓶中，置于35℃，180rpm摇瓶培养，48h后测试菌株培养液红霉素活性，筛选出菌株iurm b56。
32.(二)红霉素降解测定
33.(1)红霉素标准曲线的绘制
34.准确称取10.0mg工业纯红霉素于100ml容量瓶中，用流动相定容至标线，制备成每毫升含有100.0mg的红霉素标准液。加入流动相稀释制备成1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、50.0和80.0mg/l的红霉素标准溶液。
35.标准曲线为y(峰面积)＝0.2031x(红霉素浓度)
‑
0.2785
36.液相条件：色谱柱：c18填料，260x4.6(mm)
37.流动相：v(0.025mol/l的k2hpo4溶液)∶v(乙睛)＝40∶60；
38.流速：0.75ml/min；进样量100μl。
39.柱温：50℃
40.紫外：210nm
41.(2)红霉素降解率测定方法
42.将降解菌接种到含有10mg的100ml液体msm培养基中，与添加50mg的100ml液体msm培养基中，接种量2％，置于35℃，ph＝7摇床中培养。每24h取一次发酵液，置于
‑
20℃冰箱保存，一共取4天。
43.取1ml发酵液用4ml流动相稀释，后取2ml液体，10000rpm离心1min，将上清液通过0.22μm滤膜后利用液相进行检测分析，再以制备标准曲线得到的方程计算出红霉素含量，得出实验组红霉素的降解率。
44.实施例2：
45.本红霉素降解菌iurm b56的筛选方法包括以下步骤：
46.⑴
接种微生物：将含菌水样接种于富集培养基中，置于35℃、180rpm的摇床中培养，富集培养基的配制组成和重量如下：
47.kh2po
4 0.51g，mgso4·
7h2o0.12g，k2hpo
4 1.5g，(nh4)2so
4 1.0g，nacl 5.0g，红霉素100mg/l，蒸馏水1l；
48.⑵
培养微生物：将步骤
⑴
中接种后的微生物每7天转移培养物至新的富集培养基，持续富集培养30天，保证所需微生物菌种的充分生长；
49.⑶
驯化微生物：将步骤
⑵
中富集培养后的菌液在35℃、180rpm摇床的条件下，接种至按梯度递增的含有红霉素的富集培养基中进行梯度驯化，每5天作为一个梯度驯化周期，驯化20天后得到经驯化处理的微生物；
50.⑷
筛选微生物：将步骤
⑶
中驯化后的微生物菌液按10倍梯度稀释法制成浓度为10
‑5，10
‑6，10
‑7的悬浮菌液后，均匀涂布于分离培养基中，在30℃恒温培养箱中培养48h后获得红霉素降解菌iurm b56，其中，分离培养基的配制组成和重量如下：红霉素100mg/l，无机盐培养液1000ml，琼脂25g，而无机盐培养液的配制组成和重量如下kh2po
4 0.5g，mgso4·
7h2o 0.15g，k2hpo
4 1.8g，(nh4)2so
4 1.5g，nacl 10.0g，蒸馏水1l，并用接种环将平板中菌落接种到含分离培养基的三角瓶中，置于32℃，180rpm摇瓶培养，84h后测试菌株培养液红霉素活性，筛选出菌株，其降解率为63.42％。(图2)
51.实施例3
52.将红霉素降解菌iurm b56接种于100克灭菌的含100mg红霉素土壤中，红霉素降解菌的接种量为1.0*10
10
cpu,，于35℃条件下培养72h，经测定，测定降解率为：49.22％。(图3)
53.实施例4
54.将红霉素降解菌iurm b56接种于含红霉素的废水中，每升废水中接入5.0*10
10
cpu的红霉素降解菌，经测定该废水的红霉素浓度为140mg/l，于35℃条件下培养72h，测定红霉素降解率为：55.96％。(图4)
55.实施例5
56.红霉素降解菌iurm b56干粉剂的制备，红霉素降解菌iurm b56通过40l发酵罐培养48h扩大培养后，再经过离心收集菌泥，在冷冻干燥14h后，进行产品纯度检测，最终制得该红霉素降解菌干粉剂，该干粉剂在5
‑
7天为一降解周期，降解效率可达48
‑
65％。
57.最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
58.红霉素降解菌iurm b56的16s rrna基因序列见序列表
59.tctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgttgaggttaataaccttgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgta。