基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于生物传感器领域，具体涉及基于气味结合蛋白的电化学传感器及其构建方法和应用。


背景技术：

2.生活中，各事各物都具有气味，例如香味，臭味，异味等各种类型。人类能够检测并区分上亿种不同的气味刺激，其中人气味结合蛋白发挥了非常重要的作用。人气味结合蛋白是一种低分子量的可溶性蛋白质，它主要存在于人嗅觉神经细胞外侧的淋巴液中，是一种运载蛋白，其作用是与目标气味分子可逆地结合，并运输此类疏水性小分子至嗅觉细胞上的嗅觉受体，进而促使产生嗅觉。人们往往通过对气味进行感知然后做出相应的判断。
3.由于人对气味刺激的感知能力是有限的，对于微弱的气味，可能会感知不到或感知的较慢，因此借助一些方式方法对环境中的气味进行灵敏检测，对人们的生活生产具有至关重要的作用。目前，基于气味结合蛋白的传感器已经受到了人们的重视，现已开展有利用石英晶体微天平，表面等离子体共振，电化学阻抗等传感器的方法，但现有方法的检测下限，灵敏度等仍不能满足要求。
4.因此，利用纳米孔的纳米级别的优势和人气味结合蛋白结合气味分子，借助纳米孔的纳米级优势可以克服电化学检测方法对低浓度目标检测物不响应的缺陷，提高检测灵敏度。由此，发展一种基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器构建的分析方法，以期实现高灵敏的检测气味物质。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器及其构建方法和应用。本发明不需要借助精密昂贵的实验仪器，没有严格复杂的实验操作过程，利用纳米孔的纳米级别优势和人气味结合蛋白结合气味分子的作用，对目标气味分子的检测可达更低的检测下限，可实现对气味物质的灵敏检测。
6.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于气味结合蛋白的电化学传感器的构建方法，包括以下步骤：
7.1)将预处理后的多孔纳米氧化铝孔道浸泡在三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐水溶液中，常温避光48～72小时进行修饰改性得到纳米孔阵列；
8.2)用足量的超纯水冲洗后氮气吹干，使用等体积的edc/nhs溶液活化所修饰的纳米孔阵列10～20分钟，活化后用饱和碳酸氢钠溶液调节ph，使ph处于7～8之间；
9.3)向已活化好的纳米孔道中加入人气味结合蛋白溶液，最后，将板孔中的溶液通过振荡器混合2～5分钟，并将它们放在4～10℃下孵育2小时；
10.4)达孵育处理时间后用0.1m pbs缓冲液冲洗以除去未反应的edc/nhs溶液和未结合的蛋白质，得到基于气味结合蛋白的电化学传感器。
11.其中，所述三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐水溶液的浓度为5mm～6mm，所述三(2
‑
羧乙基)
膦盐酸盐水溶液用量为100～300μl，所述edc/nhs溶液为edc溶液和nhs溶液的混合溶液，所述edc溶液的浓度为6mg/ml～8mg/ml，由edc溶解在0.1m mes缓冲液制得，所述溶液用量为50～100μl，所述nhs溶液的浓度为12mg/ml～16mg/ml，由nhs溶解在0.1m pbs缓冲液制得，所述溶液用量为50～100μl，所述mes缓冲溶液为：0.1m mes、0.5m nacl，ph＝5～6，所述0.1m pbs缓冲溶液为：137mm nacl、10mm nah2po4、2.7mm kcl、2mm kh2po4，ph＝7～8。
12.其中，所述人气味蛋白溶液浓度为10μg/ml～30μg/ml。
13.本发明内容还包括所述的构建方法得到的基于气味结合蛋白的电化学传感器，所述电化学传感器是将人气味结合蛋白修饰在纳米氧化铝孔道上获得，所述多孔纳米氧化铝孔道孔径为40
‑
70nm，所述人气味结合蛋白为hobp 2b。
14.本发明内容还包括所述的基于气味结合蛋白的电化学传感器在检测香味物质中的应用。
15.其中，所述应用具体包括：将待检测目标分子溶解于一定体积分数甲醇溶液中，配制得一系列浓度的目标分子溶液，将所制备得到的电化学传感器利用自制的三电极体系采用电化学方法检测目标分子，得到相应的浓度梯度变化曲线，每一个浓度的目标分子测量后，将测试的目标分子溶液从纳米氧化铝孔道中取出，用电化学工作站电流
‑
时间方法检测每一目标物质的电流随时间的变化曲线，根据电流信号不同可以得出同一目标物质的不同浓度对应电流信号不同，从而通过变化曲线上的电流信号反映目标物质的浓度。检测结束后加入400μl 0.1m pbs缓冲溶液来浸泡纳米孔阵列10分钟以消除残留的配体复原人气味结合蛋白。每一浓度的目标分子平行操作检测3次，减少误差影响。
16.其中，所述待检测目标分子为香草醛、月桂酸和乙酸乙酯，所述目标分子浓度为0.1pg/ml～5pg/ml；所述甲醇溶液的浓度为体积分数为1％～10％甲醇水溶液，所述自制的三电极体系为铂电极作对电极，银
‑
氯化银电极作参比电极，氧化铝孔道，铂片和铜电极一起作为工作电极，所述电化学检测所用电解液为10mm k3[fe(cn)6]和0.1m kcl等体积的混合溶液。
[0017]
其中，所述目标分子浓度具体优选为0.1pg/ml，0.5pg/ml，1pg/ml，5pg/ml。
[0018]
其中，将制备的电化学传感器同实际样品放置在密闭的容器里一段时间，检测操作同标准气味物质溶液的检测一致，利用电化学检测的电流信号来反映相应气味物质的含量。
[0019]
其中，所述实际样品为香蕉时，其中气味中含量最多的是乙酸乙酯，通过该传感器检测从青色生香蕉到黄色熟香蕉过程中的乙酸乙酯含量。
[0020]
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明原理简单、所用方法简单、实验周期短，无需任何大型仪器，实验成本低，检测相对灵敏，在相同条件下可以更方便快捷的检测出目标物质。本发明借助于多孔纳米氧化铝孔道的纳米级优势，在孔道上修饰人气味结合蛋白，基于人气味结合蛋白与气味分子的结合，采用电化学方法检测目标气味分子，根据电化学方法所检测得到的电信号变化，反映出目标气味分子的检测效果。利用电化学方法检测的电信号响应，可实现更低浓度目标气味分子的检测，相比其他电化学方法，检测浓度低两个数量级，灵敏度更高；此外，在本浓度范围内，电化学阻抗方法无法产生灵敏响应，不适用于检测该目标物。本发明不需要借助昂贵精密仪器检测，检测方法简单易进行，极大地降低了气味分子的检测成本，具有灵敏度高、检测时间短等优点。
附图说明
[0021]
图1显示了基于气味结合蛋白检测水果香味物质的电化学传感器构建的分析方法的流程图，图1a表示人气味结合蛋白生物传感器的构建过程图，图1b表示基于电化学方法人气味结合蛋白生物传感器检测目标分子的过程图；
[0022]
图2a显示了基于电化学方法人气味结合蛋白检测气味分子的可行性，根据电信号变化实现实验目的，图2b显示电化学检测所用自制三电极体系的装置图；
[0023]
图3显示了在相同条件下，不同规格孔径多孔纳米氧化铝孔道修饰人气味结合蛋白后的电信号响应效果；
[0024]
图4显示了孔径为40
‑
70nm孔道生物传感器检测香草醛的时间
‑
电流图及其线性图；图4曲线a
‑
e浓度范围为0.1pg/ml～5pg/ml；
[0025]
图5显示了孔径为40
‑
70nm孔道生物传感器检测月桂酸的时间
‑
电流图及其线性图；图5曲线a
‑
e浓度范围为0.1pg/ml～5pg/ml；
[0026]
图6显示了孔径为40
‑
70nm孔道生物传感器检测乙酸乙酯的时间
‑
电流图及其线性图；图6曲线a
‑
e浓度范围为0.1pg/ml～5pg/ml；
[0027]
图7显示了孔径为40
‑
70nm孔道生物传感器采用电化学阻抗方法的曲线图；
[0028]
图8显示了孔径为40
‑
70nm孔道生物传感器检测实际样品的电流随时间变化的曲线图。
具体实施方式
[0029]
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
[0030]
本实验中用到的试剂和仪器：
[0031]
三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐(tcep
·
hcl)，1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)购自麦克林(中国，上海)。人气味结合蛋白(hobp 2b)购自sino biological。香草醛、月桂酸购自阿拉丁(中国，上海)。碳酸氢钠，铁氰化钾，氯化钾，乙酸乙酯，乙醇购自国药化学试剂公司(中国，上海)。所有溶液均为超纯水(阻抗≥18.2mωcm)配制。
[0032]
通过电化学工作站(chi 660c，上海辰华，中国)测量电流信号随时间的变化得时间
‑
电流曲线。通过使用振荡器对溶液进行混匀。
[0033]
本发明实施例中实际样品选用的是香蕉，但本技术的方案在具体应用时不限于香蕉，还可用于对橙子、苹果、芒果等水果进行检测。
[0034]
本发明实施例中的0.1m pbs缓冲溶液为：137mm nacl、10mm nah2po4、2.7mm kcl、2mm kh2po4、ph＝7.4。
[0035]
多孔纳米氧化铝孔道具有多种规格孔径，本发明实施例中使用到20
‑
30nm，40
‑
70nm，80
‑
100nm三种规格孔径的孔道，以上多孔纳米氧化铝孔道购于安徽合肥普元纳米材料有限公司。
[0036]
实施例1多孔纳米氧化铝孔道上人气味蛋白固定化
[0037]
首先，将20
‑
30nm，40
‑
70nm，80
‑
100nm三种规格孔径的多孔纳米氧化铝孔道分别用
乙醇和超纯水彻底地清洗，以除去纳米孔孔道基底上的有机残留物。然后将处理好的多孔纳米氧化铝孔道分别浸泡在100μl的5mm三(2
‑
羧乙基)膦盐酸盐水溶液中72小时进行改性，然后，用足量的超纯水冲洗并在氮气中干燥，使用edc/nhs偶联混合溶液修饰多孔纳米氧化铝孔道，其中，edc和nhs溶液分别在0.1m mes缓冲液(ph＝5，含有0.5m nacl)和0.1m pbs缓冲液(ph＝7.4)中制备。将等体积的100μl的edc(8mg/ml)和nhs(16mg/ml)溶液依次加入到多孔纳米氧化铝孔道中以活化羧基15分钟。活化后用饱和的碳酸氢钠调节ph，将ph从7.2增加至7.5后，加入100μl 20μg/ml的人的气味结合蛋白(hobps)溶液。最后，将板孔中的溶液通过振荡器混合约2分钟，并将它们放在4℃下孵育2小时。用0.1m pbs缓冲液冲洗以除去未反应的edc/nhs溶液和未结合的蛋白质后，将具有固定蛋白的装置保存在4℃备用。图1a显示了多孔纳米氧化铝孔道上人气味结合蛋白固定化的流程。
[0038]
实施例2电化学检测验证孔道固定过程
[0039]
采用实施例1处理后的20
‑
30nm，40
‑
70nm，80
‑
100nm三种规格孔径的多孔纳米氧化铝孔道，利用自制三电极体系，其中，自制的三电极体系为铂电极作对电极，银
‑
氯化银电极作参比电极，氧化铝孔道，铂片和铜电极一起作为工作电极，向电解池加入2ml等体积的10mm k3[fe(cn)6]和0.1m kcl的混合溶液作电解液，使用时间
‑
电流电化学方法检测此时孔道电信号；其次，多孔纳米氧化铝孔道上人气味蛋白固定化后，再次检测孔道电信号；最后，将电解液换成含目标气味物质的电解液，测孔道电信号。图1b显示了电化学检测验证孔道固定过程的流程。图2a显示了电化学方法验证纳米孔道固定人气味蛋白和其检测目标气味分子的电流随时间的曲线图，所用纳米孔径为40
‑
70nm规格。
[0040]
实施例3：生物传感器孔道孔径最优选择
[0041]
对20
‑
30nm，40
‑
70nm，80
‑
100nm三种不同规格孔径的纳米孔道进行人气味结合蛋白固定化，控制反应处理条件同实施例2一致，然后分别进行电化学检测，采用电流
‑
时间的检测方法，实验参数设置初始电压为0.2v，扫描时间为100s，实验灵敏度选择10
‑5，参数设置完成后，待加入电解液5min后，点击开始，测其电流信号，得电流随时间的变化曲线。比较其电流随时间变化曲线的差异，可以得出40
‑
70nm孔径孔道的效果最优。图3显示了三种大小不同孔径的孔道电流随时间变化曲线图。从图中可以看出，相同条件下，40
‑
70nm孔径更适合采用电流
‑
时间方法检测气味物质。
[0042]
实施例4电化学检测分析目标气味分子物质
[0043]
将香草醛、乙酸乙酯、月桂酸三种待检测目标分子溶解在体积分数为1％的甲醇水溶液中，配制得0.1pg/ml～10pg/ml系列浓度梯度的目标分子溶液，利用铂电极作对电极，银
‑
氯化银电极作参比电极，实施例1处理后的电化学传感器，铂片和铜电极一起作为工作电极的自制三电极体系采用电化学方法检测目标分子。将等体积的10mm k3[fe(cn)6]和0.1m kcl的混合溶液作电解液和所制待测溶液按体积比1∶1加入电极池，采用电流
‑
时间的检测方法，实验参数设置初始电压为0.2v，扫描时间为100s，实验灵敏度选择10
‑5，参数设置完成后，待加入电解液5min后，点击开始，测其电流信号，得电流随时间的变化曲线。注意每次实验进行时，控制溶液在孔道中静置5min后测其电流随时间的变化。每一个浓度的目标分子测量后，将测试溶液从阵列孔道中取出，加入0.1m pbs来浸泡纳米孔阵列10分钟，消除残留的配体以回收蛋白质。每一待测浓度溶液平行检测3次。检测香草醛这种气味物质，首先测没有加入香草醛的电流
‑
时间曲线，控制电解液2ml，电解液为体积比1∶1的10mm k3[fe
(cn)6]和0.1m kcl混合溶液，其次是测加入0.1pg/ml香草醛的电流
‑
时间曲线，此时电解液不同，电解液为1ml上述混合溶液和1ml的0.1pg/ml香草醛溶液；接着是测其他浓度的香草醛，由此得到不同浓度下的香草醛的时间电流曲线。其中对应的线性图是反映该气味物质在所检测浓度范围下成线性变化，表明检测效果好且具可行性。检测月桂酸这种物质和检测乙酸乙酯，其实验操作和方法同检测香草醛的一致。
[0044]
图4
‑
图6分别显示了孔径为40
‑
70nm的氧化铝孔道生物传感器检测不同浓度下的香草醛、月桂酸和乙酸乙酯的时间电流曲线及其电流与浓度的线性图。图4表示检测香草醛这种气味物质，范围为0.1pg/ml～5pg/ml，最低检测浓度为0.05pg/ml；图5表示检测月桂酸这种气味物质，范围为0.05pg/ml～5pg/ml，最低检测浓度为0.01 pg/ml；图6表示检测乙酸乙酯这种气味物质，范围为0.1pg/ml～5pg/ml，最低检测浓度为0.05pg/ml；
[0045]
对比例其他电化学检测方法
[0046]
同实施例4相同待检测物，利用铂电极作对电极，银
‑
氯化银电极作参比电极，实施例1处理后的电化学传感器，铂片和铜电极一起作为工作电极的自制三电极体系采用电化学阻抗方法来检测香草醛等目标气味物质，电化学阻抗方法所用电解液为10mmk3[fe(cn)6]和10mmk2[fe(cn)6]体积比1∶1的混合溶液，借助gamry工作站测其阻抗，实验参数设置为初始频率100000hz，初始电压为5mv，终止频率0.1hz，终止电压0.22v。电化学阻抗检测效果如图7。由图7可知，在0.1pg/ml～5pg/ml浓度范围内，阻抗值无明显的变化，相对于电流
‑
时间检测方法，电化学阻抗不适用于检测低浓度的目标物质。
[0047]
实施例5：电化学检测分析实际样品
[0048]
香蕉在成熟的过程会散发出香甜味道，其中这气味中含量最多的就是乙酸乙酯。利用所检测得到的乙酸乙酯标准溶液电流信号同浓度的关系，间接计算得出实际样品香蕉中乙酸乙酯的含量。利用多孔纳米氧化铝孔道传感器可以灵敏地检测从青色生香蕉到黄色熟香蕉这个过程中的乙酸乙酯含量。具体的实验操作过程，是将孔径规格为40
‑
70nm实施例1处理后得到的电化学传感器同香蕉切片放置在密闭的容器里一定时间，放置时间控制分别为2h，4h，6h和9h。利用电化学方法检测，其检测步骤与实验条件同实施例4检测香草醛、乙酸乙酯和月桂酸等气味分子的检测一样，利用电流
‑
时间技术检测的电流信号来反映实际样品中相应气味物质的含量。通过实施例4所检测的乙酸乙酯的电流
‑
时间曲线得出不同放置时间下香蕉所散发乙酸乙酯香味物质的含量。实施例4中检测乙酸乙酯所得电流与浓度线性关系为y＝2.3713
×
10
‑6c 1.5853
×
10
‑6，y代表电流值，c代表检测物的浓度。根据实际样品所检测的电流值对应可得出香蕉散发出乙酸乙酯的含量。由此计算出实际样品乙酸乙酯含量对应如下表1。
[0049]
表1
[0050][0051]
在实际样品检测的过程中，最低所能检测到乙酸乙酯的含量为0.1pg/ml，在实际样品的检测过程中，多次重复检测的实验结果一致，所检测得出的电流
‑
时间曲线也吻合重现。
[0052]
图8显示了孔径为40
‑
70nm孔道传感器检测实际样品
‑
香蕉的电流
‑
时间曲线。由图8可知随着时间的增加，此过程中香蕉逐渐成熟，散发出气味物质逐渐增多，因此利用所制的多孔纳米氧化铝孔道传感器检测到的气味物质的量逐渐的增加，相对应检测到的电流信号值逐渐减小。在图8检测结果中明显反映，可知青色生香蕉放置两小时后会散发出乙酸乙酯等气味物质，随着时间增长，香蕉所散发出的乙酸乙酯等气味物质的产生不断增加。