用于治疗慢加急性肝衰竭的成体肝祖细胞的制作方法

用于治疗慢加急性肝衰竭的成体肝祖细胞
1.本发明涉及用于治疗慢加急性肝衰竭的使用原代肝细胞产生的成体肝祖细胞。


背景技术：

2.肝脏是调节体内平衡的主要器官，是许多生命代谢途径的场所。在复杂的代谢途径中仅一种蛋白质受损即可非常有害。大量存在的重要肝酶大大增加了多种肝病发生的风险。总共存在200种不同的肝脏代谢的先天性缺陷，每2500名活产儿中影响1名。目前的治疗和长期管理均不够有效。原位肝移植(olt)是高度侵入性的、不可逆的，受供体移植物短缺的限制，并且需要最先进的手术技术。肝细胞移植(lct)可能由于肝细胞制剂的质量而仅发挥中短期功效。进一步改善所输注细胞的对冷冻保存的耐受性、永久植入性和高功能性，将是一项重大突破(sokal em,2011；russo fp和parola m,2012；allameh a和kazemnejad s,2012；parveen n等,2011)。
3.这种改善是通过使用干细胞或祖细胞、特别是在文献中使用来自不同生物体的肝组织以及胎儿或成体肝组织鉴定的肝祖细胞带来的(schmelzer e等,2007；sahin mb等,2008；azuma h等,2003；herrera mb等,2006；najimi m等,2007；darwiche h和petersen be,2010；shiojiri n和nitou m,2012；tanaka m和miyajima a,2012)。此类细胞在体外暴露于肝源性刺激后和/或在体内施用后，可提供具有通常与肝分化相关的形态学和功能特征(例如i/ii期酶活性)的细胞。
4.这些肝祖细胞或由其产生的肝细胞样细胞可用于细胞移植以及新药物开发中的药物测试，因为它们在药物代谢和药理学或毒理学体外筛选中代表原代人肝细胞的替代物(dan yy,2012；hook la,2012)。
5.wo 2016/030525公开了特定的细胞培养条件，其允许获得具有特定的表达谱和改善的生物学特征的人成体肝源性祖细胞(halpc)。此类条件可用于生产基于细胞的药物组合物(其可施用于治疗肝病)，或代谢和肝活性细胞(其可用于表征化合物的功效、代谢和/或毒性)。
6.慢加急性肝衰竭(aclf)是一种以慢性肝病的急性失代偿(ad)为特征的综合征，与器官衰竭和高短期死亡率有关。在未出现aclf(aclf 0级)的ad患者中，子群被鉴定为有较高风险进展为完全aclf，因此处于较高的死亡率风险。
7.已在多项临床试验中评估了向患者施用halpc的情况，并已在几位患者中观察到治疗诱发的血栓。大多数的这些细胞表达与激活凝血级联的组织因子表达相关的促凝活性，并导致凝血因子的消耗，从而导致严重出血。在这些情况下，因此建议通过在治疗中添加抗凝剂(例如肝素和/或比伐卢定)来控制血栓形成风险。


技术实现要素：

8.本发明涉及包含人成体肝源性祖细胞(例如异源人成体肝源性祖细胞(hhalpc)，也称为人类同种异体肝祖细胞(halpc))的组合物用于治疗已发展慢加急性肝衰竭(aclf)或有风险发展慢加急性肝衰竭(aclf)的患者的用途，其中所述治疗包括向所述患者施用一
定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个所述祖细胞的剂量；其中所述组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
9.本发明人已经发现，这种低剂量的这些祖细胞即使仅施用于患者一次或两次，在治疗aclf或引起aclf的病症(例如急性失代偿(ad))时也非常有效，导致患者的胆红素水平和meld评分显著降低。
10.还完全出乎意料地发现，人成体肝源性祖细胞，例如halpc即使在没有伴随的抗凝剂治疗下也可根据本发明施用于aclf或ad患者。这是令人惊讶的，因为已知会影响凝血级联的干细胞(例如halpc)的施用通常被认为涉及显著的血栓形成风险，它们的控制通常需要用抗凝剂共同治疗，以防止血栓形成或出血。然而，本发明人鉴定了可安全施用于aclf患者而没有显著的不良反应的高度有效量的halpc，无需用抗凝剂共同治疗。
附图说明
11.图1描绘了用本发明的halpc治疗的aclf和ad患者的meld评分(左)和child pugh评分(右)从给药前基线(pre1)到接受第一剂后3个月(3)的发展。条形图表示平均值和标准偏差(sd)。
12.图2描绘了用本发明的halpc治疗的aclf和ad患者的胆红素水平从给药前基线(pre1)到接受第一剂后3个月(3)的发展。条形图表示平均值和标准偏差(sd)。
具体实施方式
13.本发明涉及一种用于治疗已发展慢加急性肝衰竭(aclf)或有风险发展慢加急性肝衰竭(aclf)的患者的包含成体人肝源性祖细胞的组合物，其中所述治疗包括向所述患者施用一定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个此类祖细胞的剂量；其中所述组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。在优选实施方式之一中，成体人肝源性祖细胞是异源人成体肝源性祖细胞(halpc)。
14.aclf是一种以慢性肝病患者的肝功能急性和突然恶化为特征的病症或综合征，并且与肝和肝外器官衰竭有关，也与高短期死亡率风险有关，例如发作后28天内(见例如，hernaez等gut,2017(66)541
‑
553)。aclf的特征可能是例如急性失代偿(ad)，包括发展黄疸和inr(国际标准化比率)的延长，以及进一步并发症，例如腹水和/或肝性脑病。
15.然而，患有慢性肝脏病症或疾病的患者的aclf的原因或触发因素可能并不总是完全确定，aclf可能归因于的因素例如但不限于，例如细菌感染(例如败血症诱发的aclf)、病毒感染(例如b型肝炎或其他嗜肝病毒，例如a型或e型)、急性酒精性肝炎、手术、肝损伤(例如因缺血)、肝毒性药物和全身发炎中的任一种或组合。患有慢性肝病和患有aclf或有风险发展aclf的个体或患者也可任选地分为以下几组：非肝硬化慢性肝病患者、代偿性肝硬化患者和失代偿性肝硬化患者(既往或同期患有肝硬化失代偿)。
16.在一个实施方式中，本发明的组合物可用于治疗已发展aclf或有风险发展aclf的患者，其中所述患者已诊断患有或经诊断患有选自非肝硬化慢性肝病、肝硬化、代偿性肝硬化、失代偿性肝硬化(dc)或急性失代偿性肝硬化和急性失代偿(ad)的肝脏病症或疾病。
17.aclf已由clif(慢性肝衰竭)研究联盟根据与死亡率评分相关的严重程度的回溯拟合数据定义为3个等级(moreau等，2013年)。这些等级为：“1级”，定义为单一肾衰竭或伴有器官功能障碍的单一非肾器官衰竭；“2级”，定义为两个衰竭；以及“3级”，定义为三个或更多个器官衰竭(4.4％患者因急性失代偿而送进医院)。
18.通常，ad患者(也被归类为aclf前期或aclf
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0级)通常是有风险发展aclf的个体。例如，此类患者可能在短时间内经历所诊断的慢性肝病的特征和症状的恶化。aclf前期或aclf
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0级患者可能尚未发展器官衰竭，或仅有肌酐低于1.5mg/dl且无肝性脑病的单一器官衰竭(例如肝衰竭、凝血、循环或呼吸衰竭)，或血清肌酐水平低于1.5mg/dl的脑衰竭。被归类为aclf
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1的患者将有至少一个器官衰竭，要么是无轻度或中度肝性脑病的单一肾衰竭，要么是单一非肾衰竭例如肝脏、凝血循环或肺衰竭，其与范围为1.5至1.9mg/dl的血清肌酐和/或轻度至中度肝性脑病(例如1级或2级)有关，或血清肌酐水平为1.5
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1.9mg/dl的单一脑衰竭。被归类为aclf
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2的患者有两个器官衰竭，被归类为aclf
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3的患者正在经历三个或更多个器官衰竭。更高等级的aclf通常与死亡率提高相关。
19.在本发明的一个实施方式中，组合物用于施用于aclf等级为aclf前期或aclf
‑
0级的患者。在再一个实施方式中，将组合物施用于具有选自aclf
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1和aclf
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2的aclf等级水平的患者。
20.在又一个实施方式中，本发明涉及包含halpc的组合物用于治疗患有ad和有发展aclf的患者和/或患有aclf的肝硬化患者的用途，其中所述治疗包括向所述患者施用一定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个halpc细胞的剂量；其中所述组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
21.如本文所理解，“基本上不含有效量的抗凝剂”的组合物被定义为不包含抗凝剂的组合物，或者如果含有一些量的抗凝剂，则所述量在药理学上无效或其对患者的凝血状态的影响可忽略不计的组合物。换句话说，如果组合物中存在抗凝剂(例如肝素)，则所述抗凝剂仅作为赋形剂而存在，并且不会作为抗凝剂而对患者产生药理学作用。例如，对于肝素，成体患者的有效抗凝剂疗法需要初始单次剂量(bolus dose)5,000i.u.(国际单位)。因此，例如500i.u.的量不会被认为是抗凝剂的有效量。在一个实施方式中，本发明的组合物基本上不含有效量的抗凝剂。
22.因此，在一些实施方式中，组合物包含每剂量少于5,000i.u.的肝素。在这种情况下，每剂量意味着该组合物在含有单剂量halpc的组合物的体积中包含少于5,000i.u.的肝素。在其他实施方式中，该组合物包含每halpc剂量不超过约1,000i.u.的肝素，例如每剂量约0.1i.u.至约1,000i.u.的肝素。
23.在再一个实施方式中，组合物含有肝素作为赋形剂，其量无效，例如其量使得患者使用单剂量的本发明halpc细胞接受的肝素不超过10i.u./kg体重。因此，本发明提供一种用于治疗已发展慢加急性肝衰竭(aclf)或有风险发展慢加急性肝衰竭(aclf)的患者的包含成体人肝源性祖细胞的组合物，其中所述治疗包括向所述患者施用一定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个所述祖细胞的剂量；其中所述组合物包含每单剂量不超过约10i.u./kg体重的肝素，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
24.在又一个实施方式中，患者接受每单剂量的本发明halpc细胞不超过500i.u的肝素.。因此，本发明提供一种用于治疗已发展慢加急性肝衰竭(aclf)或有风险发展慢加急性肝衰竭(aclf)的患者的包含成体人肝源性祖细胞的组合物，其中所述治疗包括向所述患者施用一定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个所述祖细胞的剂量；其中所述组合物包含每单剂量不超过约500i.u.的肝素，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
25.如本文所定义，未接受用抗凝剂的任何共同治疗的患者应理解为在开始用halpc组合物治疗时或在根据本发明治疗期间均未服用任何药学有效量的抗凝剂的患者。所述期间可为第一次施用组合物之后至少24或至少48小时。在另一个实施方式中，未接受用抗凝剂的任何共同治疗的患者在自第一次施用组合物起长达约14或约28天的期间未接受任何抗凝剂。
26.本发明的组合物的halpc可通过以下方法制备：
27.在一个实施方式中，制备halpc及其组合物的方法包括以下步骤：
28.(a)解离成体肝脏或其部分以形成原代肝细胞群；
29.(b)生成(a)的原代肝细胞的制剂；
30.(c)将(b)的制剂中包含的细胞培养到支持物上，该支持物允许细胞在其上贴附和生长并出现细胞群；
31.(d)将(c)的细胞传代至少一次；
32.(e)分离(d)传代后获得的细胞群，其对本文所述的任一实施方式中鉴定的标志物呈阳性。
33.关于该方法的步骤(a)，解离步骤涉及获得肝脏或其部分，其包含一定量的可用于产生肝祖细胞或干细胞的原代细胞以及完全分化的肝细胞。术语“肝祖细胞”是指通过培养分离自肝脏的细胞而产生的未特化且具有增殖能力的细胞，其或其后代能够产生至少一种相对更特化的细胞类型。肝祖细胞产生的后代能够沿着一个或多个谱系分化以产生更特化细胞(但优选肝细胞或肝活性细胞)，其中此类后代本身可以是祖细胞，甚至可以产生终末分化的肝细胞(例如完全特化的细胞，特别是呈现出类似于原代人肝细胞的形态学和功能特征的细胞)。术语“干细胞”是指能够自我更新的祖细胞，即能够不分化地增殖，由此干细胞的后代或其至少一部分基本上保留了母干细胞的未特化或相对较少特化的表型、分化潜能和增殖能力。该术语涵盖了能够基本上无限制地自我更新的干细胞，即后代或其部分的进一步增殖的能力与母细胞相比基本上没有降低，以及表现出有限自我更新的干细胞，即后代或其部分的进一步增殖的能力与母细胞相比明显降低。
34.基于产生多种细胞类型的能力，祖细胞或干细胞通常可以被描述为全能、多能、专能或单能。单个“全能”细胞被定义为能够生长(即发育)成整个生物体。“多能”细胞不能生长成整个生物体，但能够产生源自所有三个胚层(即中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型，并且可能能够产生生物体的所有细胞类型。“专能”细胞能够产生来自生物体的两种以上不同的器官或组织中的每一个的至少一种细胞类型，其中所述细胞类型可以源自相同或不同的胚层，但不能产生生物体的所有细胞类型。“单能”细胞能够分化为仅一种细胞谱系的细胞。
35.肝脏或其部分获自“受试者”、“供体受试者”或“供体”，这些术语可互换地指脊椎
动物、优选哺乳动物、更优选人。肝脏的一部分可以是源自肝脏任何部分的组织样品，并且可以包含肝脏中存在的不同细胞类型。术语“肝脏”是指肝脏器官。术语“肝脏的一部分”通常是指来源于肝脏器官任何部分的组织样品，且对所述部分的量或其所源自的肝脏器官区域没有任何限制。优选地，肝脏器官中存在的所有细胞类型也可以存在于所述的肝脏的一部分中。肝脏的一部分的量可以至少部分地遵从实际考虑和需求，以获得对于合理实施本发明的方法而言足够的原代肝细胞。因此，肝脏的一部分可以代表占肝脏器官的百分比(例如，至少1％、10％、20％、50％、70％、90％或更多，通常为w/w)。在其他非限制性实例中，肝脏的一部分可以由重量来定义(例如，至少1g、10g、100g、250g、500g或更多)。例如，肝脏的一部分可以是肝叶，例如右叶或左叶，或是在劈肝手术或肝活检中被切除的包含大量细胞的任何片段或组织样品。
36.本发明的细胞优选由已分离自哺乳动物肝脏或肝脏的一部分的细胞产生，其中术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括但不限于人、家畜和农场动物、动物园动物、比赛动物、宠物动物、伴侣动物和实验动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪和灵长类动物，例如猴和猿。
37.更优选地，肝祖细胞或干细胞由已分离自人肝脏或其部分、优选人成体肝脏或其部分的细胞产生。术语“成体肝脏”是指出生后，即出生后的任何时间、优选足月的受试者的肝脏，并且可以是例如出生后至少1天、1周、1个月或超过1个月的年龄，或至少1、5、10年或更长。因此，“成体肝脏”或成熟肝脏可存在于人受试者中，人受试者还将以“婴儿”、“儿童”、“青少年”或“成体人”的常规术语来描述。技术人员将理解，肝脏可以在不同的动物物种中在出生后不同的时间间隔内达到实质的发育成熟，并且可以参考每个物种来适当地解读术语“成体肝脏”。
38.在本发明的一个替代性实施方式中，成体肝脏或其部分可以来自非人类动物受试者、优选非人类哺乳动物受试者。可有利地使用如本文所述源自非人类动物或非人类哺乳动物受试者的肝脏的祖细胞或干细胞或细胞系或其后代。作为示例而非限制，用于人类疗法的特别合适的非人类哺乳动物细胞可以源自猪。
39.供体受试者可以是活的或死亡的，这由本领域公认的标准确定，例如“心肺”标准(通常涉及循环和呼吸功能的不可逆停止)或“脑死亡”标准(通常涉及整个大脑、包括脑干的所有功能的不可逆停止)。采集可以包括本领域已知的程序，例如活组织检查、切除或割除。
40.技术人员将理解，采集供体受试者的肝脏或其部分的至少一些方面可能受到相应的法律和伦理规范的约束。作为示例而非限制，从活的人类供体采集肝组织可能需要兼顾供体后续生命的维持。
41.因此，通常可以从活的人类供体中取出仅一部分肝脏，例如使用活组织检查或切除术，从而在供体中维持足够水平的生理肝功能。另一方面，从非人类动物采集肝脏或其部分可以但不必兼顾该非人类动物的后续存活。例如，在采集组织后，可以人道地处死非人类动物。这些和类似的考量对于技术人员来说将是显而易见的，并且反映了法律和伦理学标准。
42.肝脏或其部分可以获自具有持续性循环(例如心脏跳动)和持续性呼吸功能(例如呼吸肺或人工通气)的供体、优选人类供体。根据伦理和法律规范，供体可能需要或不需要
脑死亡(例如，切除整个肝脏或其部分，这不能兼容人类供体的后续存活，但在脑死亡人类中可以是允许的)。从这些供体中采集肝脏或其部分是有利的，因为组织不会遭受通常由缺血(循环停止)引起的显著缺氧(缺乏氧合作用)。
43.作为另选，肝脏或其部分可获自在采集组织时已停止循环(例如，心脏停止跳动)和/或已停止呼吸功能(例如，具有非呼吸肺且没有人工通气)的供体、优选人类供体。虽然来自这些供体的肝脏或其部分可能已经遭受至少一定程度的缺氧，但也可以从这些组织中分离出活的祖细胞或干细胞。肝脏或其部分可在供体的循环(例如，心跳)停止后约24小时内采集，例如在供体的循环(例如，心跳)停止后约20小时内、例如约16小时内、更优选约12小时内、例如约8小时内、甚至更优选约6小时内、例如约5小时内、约4小时内或约3小时内、更优选约2小时内、最优选约1小时内、例如约45、30或15分钟内采集。
44.可将所采集的组织冷却至约室温，或冷却至低于室温的温度，但通常避免冷冻组织或其部分，尤其是在这种冷冻会导致成核或冰晶生长的情况下。例如，组织可以保持在约1℃和室温之间、约2℃和室温之间、约3℃和室温之间或约4℃和室温之间的任何温度下，并且可以有利地保持在约4℃。如本领域已知的，组织也可以保持“在冰上”。组织可以冷却全部或部分缺血时间，即供体循环停止后的时间。即，组织可以经受热缺血、冷缺血或二者的组合。在处理前，所采集的组织可以保持例如至多48小时，优选少于24小时、例如少于16小时、更优选少于12小时、例如少于10小时、少于6小时、少于3小时、少于2小时或少于1小时。
45.在进一步处理组织之前，所采集的组织可以有利地(但不必须)保持(例如完全或至少部分地浸没)在合适的培养基中，和/或可以(但不必须)用合适的培养基灌注。技术人员能够选择合适的培养基，该培养基可以支持组织细胞在处理前期间的存活。
46.从肝脏或肝脏的一部分分离出祖细胞或干细胞根据本领域已知的方法，例如ep1969118、ep3039123、ep3140393或wo2017149059中所述的方法来进行(见实施例1)。
47.首先从肝脏或其部分的解离中获得肝脏原代细胞群，以形成来自所述肝脏或其部分的原代细胞群。如本文所用，术语“解离”是指部分或完全破坏组织或器官的细胞组构，即部分或完全破坏细胞与组织或器官的细胞成分之间的联结，以从所述组织或器官获得细胞(细胞群)悬浮液。该悬浮液可包含单独的或单个的细胞，以及物理附着形成两个或更多个细胞的簇或团块的细胞。解离优选不引起或引起尽可能小的细胞活力降低。解离肝脏或其部分以获得原代细胞群(悬浮液)的合适方法可以是本领域公知的任何方法，包括但不限于酶消化、机械分离、过滤、离心及其组合。特别是，解离肝脏或其部分的方法可包括酶消化肝组织以释放肝细胞和/或机械破碎或分离肝组织以释放肝细胞。通过肝活检获得的小而薄的肝组织碎片可直接用于根据以下步骤(c)进行细胞培养，而无需酶或机械破碎。
48.如上述解离肝脏或其部分的方法在文献中记载为广泛使用的两个或更多个步骤的胶原酶灌注技术，该技术已经过各种调整和修改以用于对整个肝脏或肝脏片段进行。肝组织用在37℃下预热且不含二价阳离子，但含有阳离子螯合剂(例如edta或egta)的缓冲液灌注。缓冲液可包括盐溶液(例如hepes、williams e培养基)或也可包括诸如nacl和kcl等盐的任何其他平衡盐溶液，等等。这导致使细胞保持在一起的桥粒结构破坏。
49.然后用含有二价阳离子(例如ca2 和mg2 )和用于消化组织的基质降解酶的缓冲液灌注该组织。通常通过温和的机械破碎和/或加压通过过滤器以机械地完成细胞解离过程，从而释放原代肝细胞。此类过滤器可具有允许细胞通过约0.1mm、0.25mm、0.50mm、1mm或
更大的筛孔尺寸。可使用一系列筛孔尺寸逐渐变小的过滤器来逐渐解离组织并释放细胞。解离的细胞用含有蛋白酶抑制剂、血清和/或血浆的缓冲液冲洗以使灌注过程中使用的胶原酶和其他酶失活，然后通过低速离心(例如，在10x g和500x g之间)将其粒化，从混合物中分离出来。即使没有全部也有大部分活细胞可粒化，而死细胞和细胞碎片则基本上被清除，随后用冰冷的缓冲液洗涤以纯化细胞悬浮液。原代肝细胞的数量和品质可根据组织的品质、所使用的不同溶液的组成以及酶的类型和浓度而不同。该酶通常是胶原酶，但也可使用链霉蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、嗜热菌蛋白酶及其组合。胶原酶可能由纯化不良的酶混合物组成和/或表现出蛋白酶活性，这可能导致影响活细胞的品质和量的不必要的反应，而这些反应又可通过选择足够纯度和品质的酶制剂来避免。其他采集原代肝细胞的方法可能不包括酶消化技术，并且可能涉及用含有蔗糖的溶液灌注肝脏，随后进行机械破碎。
50.关于所述方法的步骤(b)，本文中所定义的并且通过解离肝脏或其部分获得的原代细胞群通常可以是异质的，即，其可以包含属于一种或多种属于任何肝脏构成细胞类型的细胞类型的细胞，包括祖细胞或干细胞，其可能存在于肝实质和/或肝非实质部分中。如本文所用，术语“原代细胞”包括存在于从受试者的组织或器官(例如肝脏)获得的细胞悬浮液中的细胞，所述悬浮液通过使用适当的技术使存在于这些外植的组织或器官中的细胞解离而获得。
51.示例性的肝脏构成细胞类型包括但不限于肝细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)、库普弗细胞、肝星状细胞(ito细胞)、卵圆细胞和肝内皮细胞。上述术语具有本领域公认的含义并且在本文中被广义地解释为包括任何这样分类的细胞类型。
52.术语“肝细胞”涵盖了上皮和实质肝细胞，包括但不限于不同大小或倍性(例如，二倍体、四倍体、八倍体)的肝细胞。根据解离肝脏的方法和/或基于物理性质(尺寸、形态)、活力、细胞培养条件或细胞表面标志物的表达用任何适合的技术将肝细胞和/或其他细胞类型的初始制剂分级分离或富集的任何方法，原代细胞群可以包含不同比例(总细胞的0.1％、1％、10％或更多)的肝细胞。
53.本文中所定义并通过解离肝脏(或其部分)获得的原代细胞群可以立即用于建立细胞培养物作为新鲜的原代肝细胞，或者优选地，使用常用技术将其储存为原代肝细胞的冻存制剂以用于长期保存。
54.关于步骤(c)，将步骤(b)中获得的肝原代细胞制剂直接培养到完全合成的支持物(例如塑料或任何聚合物)或预涂有饲养细胞、蛋白质提取物或任何其他生物来源材料的合成支持物上，其允许类似的原代细胞的贴附和增殖，并允许出现具有所需标志物的成体肝祖细胞群，这些标志物优选通过免疫组织化学、流式细胞术或其他基于抗体的技术在蛋白质水平上鉴定。原代细胞在细胞培养基中培养，以维持它们的贴附和同质细胞群的增殖和出现。如上定义的原代肝细胞的这种培养步骤导致培养物中肝祖细胞的出现和增殖，并且可以持续到肝祖细胞或干细胞已经充分增殖。例如，可以持续培养直到细胞群达到一定程度的汇合(例如，至少50％、70％或至少90％以上汇合)。例如，将细胞培养至少7天、至少10天或至少12天。在一个实施方式中，来自原代细胞群的细胞在7和12天内培养。如本文所用，术语“汇合”是指培养的细胞的密度，其中细胞彼此接触，基本上覆盖所有可用于生长的表面(即，完全汇合)。
55.如ep3140393或wo2017149059中所述，在步骤(c)中获得的肝祖细胞或干细胞可以
通过允许检测在该阶段(即，步骤(d)中所示的细胞传代之前)已有的相关标志物的技术来进一步表征。在用于鉴定此类标志物并将其测定为阳性或阴性的技术中，优选蛋白质印迹(western blot)、流式细胞术免疫细胞化学和elisa，因为这些技术允许在蛋白质水平上检测标志物，即使在这一步时可用的肝祖细胞量少的情况下也是如此。
56.然后可以基于所确认的细胞身份，即标志物图谱、形态和/或活性，进行肝祖细胞的分离或采集。例如，肝祖细胞对至少一种间充质标志物呈阳性。间充质标志物包括但不限于波形蛋白、cd13、cd90、cd73、cd44、cd29、α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)和cd140
‑
b。另外，肝祖细胞可分泌hgf和/或pge2。此外，它们可任选地对至少一种肝标志物呈阳性和/或表现出至少一种肝脏特异性活性。在一个实施方式中，细胞对至少一种肝标志物呈阳性和/或表现出至少一种肝脏特异性活性。例如，肝标志物包括但不限于hnf
‑
3b、hnf
‑
4、cyp1a2、cyp2c9、cyp2e1、cyp3a4和α
‑
1抗胰蛋白酶，还可包括白蛋白(alb)。肝脏特异性活性可包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α
‑1‑
抗胰蛋白酶分泌和cyp3a4活性。
57.在一个实施方式中，肝祖细胞是异源人成体肝源性祖细胞(halpc)，其表达选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)的至少一种间充质标志物，并且其还分泌hgf。在再一个实施方式中，肝祖细胞是异源人成体肝源性祖细胞(halpc)，其表达选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)的至少一种间充质标志物，并且其还分泌hgf和pge2。
58.关于所述方法的步骤(d)，将原代细胞在维持它们的贴附以及同质细胞群的增殖和出现的细胞培养基中培养，该细胞群在至少一次传代后逐渐富集肝祖细胞或干细胞。这些肝祖细胞可以快速扩增以产生足够的细胞以获得具有所需特性的后代，如例如在ep3140393或wo2017149059中所述，细胞倍增可在48
‑
72小时内获得，并维持具有所需特性的肝祖细胞至少2、3、4、5或更多传代。
59.术语“传代”或“传代”在本领域中是常见的，是指将培养的细胞与培养基质以及彼此之间分开和解离。为简单起见，在贴壁培养条件下第一次生长细胞后进行的传代在本发明的方法中称为“第一次传代”(或传代1，p1)。细胞可以传代至少一次，优选两次或更多次。传代1之后的每次传代在本文中以增加1的数字表示，例如传代2、3、4、5，或p1、p2、p3、p4、p5等。
60.可将分离的肝祖细胞平板接种(plated)在允许细胞贴附于其上的基质上，并在维持其进一步增殖的可含有血清或可无血清的培养基(通常为液体培养基)中培养。通常，允许细胞贴附于其上的基质可以是任何基本上亲水性基质。目前用于使贴壁细胞生长的标准实践可以包括使用添加或不添加牛血清、人血清或其他动物血清的确定的化学培养基。这些培养基可以补充有机或无机化合物的适当混合物，不但可以提供营养成分和/或生长促进剂，还可以促进特定细胞类型的生长/贴附或消除/脱离。所添加的血清除了提供营养成分和/或生长促进剂外，还可以通过用能够更好地贴附细胞的基质层涂覆经处理的塑料表面来促进细胞贴附。如本领域技术人员所理解的，可以对细胞进行计数以便于随后以所需的密度平板接种细胞。
61.如常规定义，术语“血清”是按如下方式从全血样品中获得的：首先使样品中发生凝固，随后通过适当的技术、通常通过离心将血液样品中如此形成的凝块和细胞成分与液体成分(血清)分离。惰性催化剂(例如玻璃珠或粉)可以促进凝固。有利地，血清可以使用血
清分离器皿(sst)来制备，其含有对哺乳动物呈惰性的催化剂。
62.可以平板接种细胞的环境可以至少包含细胞培养基，在本发明的方法中，通常为液体培养基，其支持分离的肝祖细胞的存活和/或生长。可以在将细胞引入之前、同时或之后将液体培养基添加到系统中。
63.术语“细胞培养基”或“细胞培养介质”或“培养基”是指包含可用于细胞维持或生长的营养成分的水性液体或凝胶状物质。细胞培养基可以含有血清或不含血清。
64.通常，培养基将包含本领域已知的基础培养基制剂。许多基础培养基制剂可用于培养本文的原代细胞，包括但不限于eagle氏最低必需培养基(mem)、dulbecco氏改良的eagle氏培养基(dmem)、α改良最低必需培养基(alpha
‑
mem)、基础必需培养基(bme)、iscove氏改良的dulbecco氏培养基(imdm)、bgjb培养基、f
‑
12营养混合物(ham)、liebovitz l
‑
15、dmem/f
‑
12、必需改良的eagle氏培养基(emem)、rpmi
‑
1640、培养基199、waymouth氏mb 752/1或williams培养基e，以及它们的修改和/或组合。上述基础培养基的组成是本领域公知的，并且针对培养的细胞按需改变或调节培养基和/或培养基补充剂的浓度在本领域技术人员的技能范围内。优选的基础培养基制剂可以是市售的一种，例如williams培养基e、imdm或dmem，据报道它们可以维持成体肝细胞的体外培养，并且包括用于它们的适当生长、增殖、所需标志物和/或生物活性的维持或长期储存的生长因子混合物。另一种优选的培养基是可商购的支持肝祖细胞生长的无血清培养基，例如来自miltenyi的stemmacs
tm
。
65.如本文所用，术语“生长因子”是指影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移的生物活性物质，并且可以单独地或在受到其他物质调节时影响生物体的发育、形态学和功能变化。生长因子通常可以作为配体与细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合来起作用。本文的生长因子可以特别是包含一个或多个多肽链的蛋白质实体。术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(fgf)家族、骨形态发生蛋白(bmp)家族、血小板衍生生长因子(pdgf)家族、转化生长因子β(tgf
‑
β)家族、神经生长因子(ngf)家族、表皮生长因子(egf)家族、胰岛素相关生长因子(igf)家族、肝细胞生长因子(hgf)家族、白细胞介素
‑
6(il
‑
6)家族(例如制瘤素m)、造血生长因子(hegf)、血小板衍生内皮细胞生长因子(pd
‑
ecgf)、血管生成素、血管内皮生长因子(vegf)家族或糖皮质激素类的成员。当所述方法用于人肝细胞时，本方法中使用的生长因子可以是人或重组生长因子。在本方法中优选使用人和重组生长因子，因为预期这些生长因子会对细胞功能产生期望的影响。
66.此类基础培养基制剂含有哺乳动物细胞发育所必需的成分，这些成分本身是已知的。作为说明而非限制，这些成分可以包括无机盐(特别是含有na、k、mg、ca、cl、p和可能的cu、fe、se和zn的盐)、生理缓冲液(例如hepes、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸盐(例如丙酮酸钠)、乙酸盐(例如乙酸钠))等。还将明显可见的是，许多培养基可作为含或不含丙酮酸钠的低葡萄糖制剂获得。
67.为了用于培养，可以向基础培养基提供一种或多种其他成分。例如，可以使用额外的补充剂为细胞提供必需的微量元素和物质，以实现最佳生长和扩增。此类补充剂包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些成分可以包含在盐溶液中，例如但不限于汉克斯平衡盐溶液(hbss)、厄尔盐溶液。可以添加其他抗氧化剂补充剂，例如β
‑
巯基乙醇。虽然许多基础培养基已经含有氨基酸，但一些氨基酸可能会后续补充，例如l
‑
谷氨酰胺，已知它在溶液
中不太稳定。可以向培养基进一步提供抗生素和/或抗真菌化合物，例如通常为青霉素和链霉素的混合物，和/或其他化合物，例如但不限于两性霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、霉酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤霉素、利福平、壮观霉素、四环素、泰乐菌素和zeocin(博来霉素)。
68.激素也可有利地用于细胞培养，包括但不限于d
‑
醛固酮、二乙基己烯雌酚(des)、地塞米松、雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人生长激素(hgh)、促甲状腺素、甲状腺素、l
‑
甲状腺氨酸、上皮生长因子(egf)和肝细胞生长因子(hgf)。肝细胞也可以受益于与三碘甲状腺原氨酸、α
‑
生育酚乙酸酯和胰高血糖素一起培养。
69.脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。此类脂质和载体可以包括但不限于环糊精、胆固醇、与白蛋白结合的亚油酸、与白蛋白结合的亚油酸和油酸、未结合的亚油酸、与白蛋白结合的亚油酸
‑
油酸
‑
花生四烯酸、未结合和结合至白蛋白的油酸，等等。白蛋白可类似地用于不含脂肪酸的制剂中。
70.还考虑用哺乳动物血浆或血清补充细胞培养基。血浆或血清往往含有活力和扩增所必需的细胞因子和成分。还考虑使用合适的血清替代物。用于本文所述的培养基中的合适的血清或血浆可包括人血清或血浆，或来自非人类动物、优选非人类哺乳动物的血清或血浆，例如非人类灵长类动物(例如狐猴、猴、猿)、胎牛或成体牛、马、猪、羔羊、山羊、犬、兔、小鼠或大鼠的血清或血浆等。在另一个实施方式中，上述血浆和/或血清的任意组合可用于细胞培养基中。
71.当传代时，将培养的细胞与培养基质以及彼此之间分开和解离。细胞的分开和解离可按照本领域公知的方式进行，例如通过用蛋白水解酶的酶处理(例如，选自胰蛋白酶、胶原酶(例如i、ii、iii或iv型)、分散酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等)，用二价离子螯合剂的处理(例如edta或egta)或机械处理(例如，通过小口径移液管(pipette)或移液管尖头重复移液)，或这些处理的任何组合。
72.合适的细胞分开和分散方法应确保所需的细胞分开和分散程度，同时保留培养物中的大多数细胞。优选地，分开并解离培养的细胞将产生相当大比例的作为单个活细胞的细胞(例如，至少50％、70％、90％或更多的细胞)。剩余的细胞可能以细胞簇存在，各自包含相对少量的细胞(例如，平均1至100个细胞)。
73.如此分开和解离的细胞(通常作为等渗缓冲液或培养基中的细胞悬浮液)可以重新平板接种在允许细胞贴附于其上的基质上，并随后在如上所述的培养基中培养，维持halpc和halpc后代的进一步增殖。然后这些细胞可以通过将其以10至105个细胞/cm2的密度和约1/16至1/2、优选约1/8至1/2、更优选约1/4至1/2的分割比重新平板接种来培养。分割比表示接种到表面积与获得细胞的容器相同的空的(通常是新的)培养容器中的传代细胞的比例。培养容器的类型以及允许细胞贴附到培养容器和细胞培养基中的表面类型可以与最初使用的相同，并且如上所述，也可以不同。优选地，将细胞维持在或任何其他适当的支持物上，该支持物涂覆有细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白，优选i型胶原蛋白)或gmp条件下可接受的合成肽。
74.关于上述步骤(e)，halpc群体的分离适用于对所列标志物呈阳性的细胞，进一步验证上述步骤(c)中最初鉴定halpc的标准，但鉴于传代后可用的细胞数量更多，可以更容易建立这一标准。
75.如本文所用，术语“分离的细胞”通常是指不与该细胞在体内所联结的一种或多种细胞或一种或多种细胞成分联结的细胞。例如，分离的细胞可以已从其天然环境中移出，或可以由已从其天然环境中移出的细胞繁殖(例如，离体繁殖)得到。
76.术语“细胞群”和“细胞群体”一般是指一组细胞。除非另有说明，否则该术语是指基本上由本文定义的细胞组成或包含本文定义的细胞的细胞组。细胞群可基本上由具有共同表型的细胞组成，或可以包含至少一部分具有共同表型的细胞。当细胞在一个或多个可证明的特征方面基本相似或相同时，则称这些细胞具有共同的表型，所述特征包括但不限于：形态学外观、特定细胞成分或产物(例如rna或蛋白)的表达水平、某种生化途径的活性、增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的响应、或体外培养期间的行为(例如，贴附或单层生长)。因此，这种可证明的特征可以定义细胞群或其部分。如果大多数细胞具有共同的表型，则细胞群可能是“基本上同质的”。“基本上同质的”细胞群可包含至少60％、例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至至少99％的具有共同表型的细胞，例如具体提及的表型(例如，本发明的肝祖细胞或干细胞的表型，或本发明的肝祖细胞或干细胞的后代)。此外，如果存在于群体中的任何其他细胞不会改变或实质影响该细胞群的整体性质并因此可以将其定义为细胞系，则该细胞群可以基本上由具有共同表型的细胞组成，例如本发明的肝祖细胞或干细胞的表型(即，本发明的肝祖细胞或干细胞的后代)。
77.不论所采用的方法，细胞计数都可在最终采集时、或在制备要施用于患者的药物组合物的制剂的过程中、或在品质控制试验期间的细胞悬浮液上进行。可以使用本领域已知的任何方法，例如使用比尔克尔室(burker chamber)的人工计数方法和自动nucleocounter“nc
‑
200”。这些方法的目的是测定细胞的总数量以及活细胞的数量。
78.使用比尔克尔室的人工计数
79.使用比尔克尔室的人工计数方法基于台盼蓝排除试验(trypan blue exclusion test)。
80.细胞悬浮液用pbs稀释，以计数每室100至200个活细胞。台盼蓝以1:1的比例添加到细胞悬浮液中。通过显微镜和细胞计数器对细胞进行计数。白色细胞是活细胞；蓝色细胞是死细胞。然后计算活细胞和死细胞的百分比。进行两次细胞计数。如果两次计数之间的δ>15％，则进行第三次计数。
81.自动nucleocounter“nc
‑
200”82.nucleocounter nc
‑
200 1
‑
步骤提供高精度自动化细胞计数器，其基于荧光显微镜和高级图像分析，对死细胞和总细胞进行图像细胞计数排除。一步法使用via1
‑
cassette
tm
，其含有固定化荧光染料，即吖啶橙和dapi(4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚)，其分别自动染色总细胞群和死细胞群。
83.将细胞悬浮液稀释至计数为7x105至2x106个总细胞/ml。via1
‑
cassette
tm
将移液校准体积，nc
‑
200将自动确定总细胞和死细胞浓度以及活力百分比。所有计数一式三份进行。可报告的值是三个独立取样的三个有效结果的平均值。为了有效，总细胞计数必须介于之间，并且总细胞浓度和活力的变异系数(cv)不得超过15.0％。
84.在一些优选实施方式中，根据本发明提供的剂量和剂量范围根据自动化细胞计数方法、特别是使用nucleocounter nc
‑
200或等效仪器的上述自动化方法测定。例如，每kg体重250000至2500000个halpc的剂量应优选解释为剂量范围，其中细胞数量根据自动化细胞
计数方法，并且优选使用诸如nucleocounter nc
‑
200或其技术等效替代品等仪器测定。在这种情况下，技术等效替代品是指产生与基于本文所述的nucleocounter nc
‑
200的方法基本等效的结果的仪器或细胞计数系统，考虑到在细胞计数方法内部和之间通常观察到的可变性。
85.这些相同的偏好适用于其他剂量范围，例如每kg体重500000至1500000个halpc、每kg体重500000至1000000个halpc的剂量，或每kg体重例如600000、800000、1000000或1200000个halpc的剂量：这些优选通过上述自动化方法测定。此外，鉴于该方法的典型技术可变性，特定的细胞数量应理解为具有合理限度(margin)的数量以说明这种可变性。
86.例如如上所述获得的halpc可用于体内施用，例如以包含此类细胞的药物组合物的形式施用，用于治疗已发展aclf或有风险发展aclf的患者。这些药物组合物可作为halpc产品提供，任选地将halpc与适合所需的治疗方法、所选的施用途径和/或储存的液体载体(例如细胞培养基或缓冲液)组合，以及以用于提供此类药物组合物的优选方式提供(例如在试剂盒内)。可提供任何其他有用效果的源自生物的其他制剂(例如抗体或生长因子)或源自化学的其他制剂(例如药物、保存或标记化合物)也可组合在此类组合物中。
87.在一个实施方式中，halpc产品和/或包含halpc的药物组合物可以全身施用，例如通过静脉内、肌肉内或腹膜内注射，或通过静脉内输注。
88.任选地，halpc产品或组合物的施用或治疗用途可包括施用或使用另一种产品(其可以是例如药物、治疗剂、另一种细胞类型或其他生物材料)。halpc产品可用于(或应用于)如本文所述的治疗方法，其中还对患者施用此类另一种产品作为该方法的一部分。其他产品可与halpc产品组合施用，例如作为同一组合物的一部分，或单独、同时或依次(以任何顺序)施用。其他产品可具有与halpc产品的效果(特别是治疗效果)相容或甚至协同的效果。
89.在一个实施方式中，组合物中包含的肝祖细胞对至少一种间充质标志物呈阳性。间充质标志物包括但不限于波形蛋白、cd13、cd90、cd73、cd44、cd29、α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)和cd140
‑
b。另外，肝祖细胞可分泌hgf和/或pge2。此外，它们可任选地对至少一种肝标志物呈阳性和/或表现出至少一种肝脏特异性活性。例如，肝标志物包括但不限于hnf
‑
3b、hnf
‑
4、cyp1a2、cyp2c9、cyp2e1、cyp3a4和α
‑
1抗胰蛋白酶，并且还可包括白蛋白(alb)。肝脏特异性活性可包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α
‑1‑
抗胰蛋白酶分泌和cyp3a4活性。
90.在本发明的另一个实施方式中，组合物中包含的halpc表达选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)的至少一种间充质标志物，并且它们还分泌hgf。
91.在本发明的另一个实施方式中，组合物中包含的halpc表达选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)的至少一种间充质标志物，并且它们还分泌hgf和pge2。
92.在本发明的另一个实施方式中，组合物中包含的halpc表达选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)的至少一种间充质标志物，并且它们任选地还表达至少一种肝标志物和/或表现出肝脏特异性活性和/或表现出肝脏特异性活性。
93.在一个实施方式中，细胞对至少一种肝标志物呈阳性和/或表现出至少一种肝脏
特异性活性。例如，肝标志物包括但不限于hnf
‑
3b、hnf
‑
4、cyp1a2、cyp2c9、cyp2e1、cyp3a4和α
‑
1抗胰蛋白酶，并且还可包括白蛋白(alb)。肝脏特异性活性可包括但不限于尿素分泌、胆红素结合、α
‑1‑
抗胰蛋白酶分泌和cyp3a4活性。
94.在本发明的另一个实施方式中，halpc共同表达如上文关于步骤(c)所述的至少一种间充质标志物；或者标志物可选自cd90、cd44、cd73、cd13、cd140b、cd29、波形蛋白和α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)；以及选自甲胎蛋白(afp)、α
‑
1抗胰蛋白酶、hnf
‑
4和mrp2转运蛋白的一种或多种肝标志物以及任选的肝标志物白蛋白(有时也称为肝细胞标志物)。它们任选地还表现出肝脏特异性活性，其可选自尿素分泌、胆红素结合、α
‑1‑
抗胰蛋白酶分泌和cyp3a4活性。此外，halpc优选表达hgf和pge
‑
2。
95.在本发明的另一个或再一个实施方式中，halpc被测量为：
96.(a)对α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)、cd140b以及可选的白蛋白(alb)呈阳性；
97.(b)对细胞角蛋白
‑
19(ck
‑
19)呈阴性；
98.(c)以及可选的对含sushi结构域的蛋白质2(susd2)呈阴性。
99.在本发明的另一个实施方式中，halpc细胞被测量为：
100.(a)对α
‑
平滑肌肌动蛋白(asma)、cd140b以及可选的白蛋白(alb)呈阳性；
101.(b)对含sushi结构域的蛋白质2(susd2)和细胞角蛋白
‑
19(ck
‑
19)呈阴性。
102.在本发明的又一个或再一个实施方式中，halpc细胞被进一步测量为对以下呈阳性：
103.(a)选自hnf
‑
3b、hnf
‑
4、cyp1a2、cyp2c9、cyp2e1和cyp3a4以及可选的白蛋白的至少一种肝标志物；
104.(b)选自波形蛋白、cd90、cd73、cd44和cd29的至少一种间充质标志物；
105.(c)选自尿素分泌、胆红素结合、α
‑1‑
抗胰蛋白酶分泌和cyp3a4活性的至少一种肝脏特异性活性；
106.(d)选自atp2b4、itga3、tfrc、slc3a2、cd59、itgb5、cd151、icam1、anpep、cd46和cd81的至少一种标志物；和
107.(e)选自mmp1、itga11、fmod、kcnd2、ccl11、aspn、kcnk2和hmcn1的至少一种标志物。
108.在再一个实施方式中，所述细胞对hla
‑
dr呈阴性。
109.在再一个实施方式中，halpc对某些标志物(例如cd133、cd45、ck19和/或cd31)呈阴性。
110.在再一个实施方式中，halpc还可被测量为对wo2016/030525的表6中列出的一种或多种酶活性呈阳性。在一些实施方式中，这种类型的成体肝祖细胞可通过一系列阴性标志物进一步表征，特别是针对由itgam、itgax、il1r2、cdh5和ncam1组成的组中的一个或多个。另外，halpc还可被测量为对由hp、cp、rbp4、apob、lbp、orm 1、cd24、cpm和apoc1组成的组中的一个或多个呈阴性。
111.上面列出的生物活性、标志物和形态学/功能特征可以以不同标志物组合呈现在halpc中，例如：
112.(a)对α
‑
平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、cd90、cd73、cd44、cd29、cd140b和cyp3a4活性以及可选的白蛋白呈阳性；和
113.(b)对含sushi结构域的蛋白质2、细胞角蛋白
‑
19和cd271呈阴性。
114.还可测定上述实施方式的halpc在任何功能和技术组合中的其他特征，例如测定对选自atp2b4、itga3、tfrc、slc3a2、cd59、itgb5、cd151、icam1、anpep、cd46和cd81的至少一种其他标志物呈阳性。在一些这样的实施方式中，halpc可被测量为对选自由itgam、itgax、il1r2、cdh5和ncam1组成的组中的至少一种其他标志物呈阴性。在一些这样的实施方式中，hhalpc可被测量为对hp、cp、rbp4、apob、lbp、orm1、cd24、cpm和apoc1中的至少一种呈阴性。
115.在再一个实施方式中，将本发明的组合物施用于患者，其中患者在治疗前的meld评分小于40，例如在10至40的范围内。在又一个实施方式中，患者的meld评分在13至35的范围内，和/或已经经历或正在经历至少一个器官衰竭。
116.在再一个实施方式中，患者在治疗前的基线meld评分在约20至35之间。在另一个实施方式中，患者在治疗前的基线meld评分分别在17至35的范围内，或在17至30的范围内。在又一个实施方式中，患者在治疗前是肝移植的候选人，即患者满足肝移植的标准要求。
117.meld是终末阶段肝病评分系统模式(model for end
‑
stage liver disease scoring system)的首字母缩写，用于评估终末阶段肝病的严重程度。meld评分在本领域中用于预测死亡率，并且还用于对需要肝移植的(12岁以上)患者进行分级。评分基于患者血清肌酐、胆红素、inr(凝血酶原时间的国际标准化比值)的值，并根据以下公式确定：9.57x log e(肌酐mg/dl) 3.78x log e(胆红素mg/dl) 11.2x log e(inr) 6.43。所得评分通常四舍五入到最接近的整数。
118.在另一个实施方式中，包括施用本发明的组合物的治疗会导致患者的meld评分降低。例如，meld评分可在治疗过程中降低10％以上。在再一个实施方式中，meld评分在施用第一剂组合物后优选在28天期间内，或作为另选，优选在约1个月或3个月期间内降低至少20％。在再一个实施方式中，meld分数分别降低至少25％或至少30％。meld评分的降低百分比通过将已接受治疗的患者的meld评分与患者在治疗前，即在向患者第一次输注或提供组合物之前所获得的meld评分进行比较来确定。
119.此外，治疗的效果可通过患者的child
‑
pugh评分的改善来表示。child
‑
pugh评分，也称为child
‑
turcotte
‑
pugh评分或child标准，用于评估慢性肝病的预后。在一些实施方式中，将本发明的halpc疗法施用于患者，特别是患有aclf的患者，其在治疗前的child
‑
pugh评分分别在约5至约15，或约6至约14的范围内。在一些实施方式中，根据本发明治疗的患者的child
‑
pugh评分在开始根据本发明治疗后一个月内降低至少约10％，即从给药前基线值至给药(或分别第一次给药)halpc后一个月内估测的child
‑
pugh评分。在再一个实施方式中，在(第一次)施用细胞后两个月内或三个月内，child
‑
pugh评分降低至少约10％。在又一个实施方式中，根据本发明治疗的患者的child
‑
pugh评分在(第一次)施用细胞后两个月内或三个月内降低至少约20％。
120.在再一个实施方式中，将组合物施用于患者，患者在开始治疗之前，即在第一次输注组合物之前表现出的总胆红素血清浓度为至少5mg/dl。在再一个实施方式中，第一次输注之前的总胆红素血清浓度为至少约6mg/dl。
121.如上所述，本发明的治疗包括施用每kg体重250000至2500000个halpc细胞的剂量。在一个优选实施方式中，施用于患者的剂量在每kg约250000至约2000000个细胞的范围
内。在另一个优选实施方式中，剂量在每kg约250000至约1500000个细胞的范围内，或在每kg约250000至约1250000个细胞的范围内，或在每kg约500000至约1200000个细胞的范围内，例如分别为每kg约500000、600000、640000至800000、100000或1200000个细胞。本发明人惊奇地发现，这种相对低剂量的halpc，特别是具有上述与其表达的标志物相关的一些或全部优选特征的halpc，在改善肝功能和患者的整体状况上显著有效，同时避免通常与施用大量干细胞有关的副作用。在一些实施方式中，这些范围是使用如上所述的自动化细胞计数方法确定的。
122.在再一个实施方式中，施用于患者的组合物包含每kg约250000至约1500000个细胞、每kg约250000至约1250000个细胞、每kg约500000至约1200000个细胞、或每kg体重约500000至约1000000个细胞的剂量。
123.在特定实施方式中，本发明涉及一种包含halpc的组合物，其用于治疗患有ad和有风险发展aclf的患者和/或患有aclf的肝硬化患者，其中该治疗包括向所述患者施用一定量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg约250000至约1500000万个细胞、每kg约250000至约1250000个细胞、每kg约500000至约1200000个细胞、或每kg体重约500000至约1000000个halpc细胞的剂量；其中该组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中该患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
124.在再一个实施方式中，根据本发明使用的组合物可以施用于已发展aclf或有风险发展aclf的患者。该组合物包含每kg体重约250000个halpc细胞、每kg体重约500000个halpc细胞、或每kg体重约1000000个halpc细胞的剂量。在另一个实施方式中，该组合物包含每kg体重不超过约1500000个细胞、或每kg体重不超过约2500000个细胞的剂量。
125.根据再一个实施方式，施用于患者的剂量为约50000000至约200000000个halpc，或约50000000至约150000000个halpc，例如约100000000个halpc。
126.在任何前述实施方式中，包含halpc的组合物可以以无菌液体的形式施用于患者。
127.所述无菌液体可由halpc细胞的重组悬浮液制备，例如通过用生理上与患者兼容且适于静脉内输注的诸如无菌水溶液等无菌稀释剂(任选地包含赋形剂，例如ph调节剂和/或人血清白蛋白)稀释解冻的浓缩halpc细胞悬浮液制备。
128.在一个实施方式中，组合物经由静脉内输注施用，任选地使用外周导管。作为另选，组合物可通过中心线施用于患者。
129.包含halpc细胞的无菌液体形式的组合物的体积和浓度优选适于静脉内输注。在一个实施方式中，可以以无菌液体形式施用于患者的组合物在最终调整后包含的halpc细胞的浓度为至多每ml约10000000个细胞，特别是每ml约500000至5000000个细胞。在另一个实施方式中，可向患者施用浓度为每ml 500000至2000000个halpc细胞、例如每ml约1000000个halpc的无菌液体组合物。作为另选，组合物的细胞浓度可分别在每ml约1000000至约5000000个细胞、或每ml约2000000至5000000个细胞的范围内。这些最终细胞浓度可通过适当稀释浓度更高的halpc组合物来获得。
130.每次输注施用于患者的组合物的体积优选根据患者的体重进行调节。在一个实施方式中，在最终调整细胞浓度后每次输注施用的组合物的体积可分别在约5至约500ml、优选约10至约200ml、或约20至约150ml的范围内。
131.在又一个实施方式中，用于进行本发明的组合物是无菌液体组合物，其分别以每
分钟约0.1至约5ml的输注速率、或以每分钟约0.5至2ml的速率静脉内输注给患者。还优选的是，选择输注速率以使得施用单剂量所需的总输注时间不超过约4小时，或甚至不超过约1小时。例如，组合物可以以每分钟约1ml的输注速率静脉内输注给患者。进一步优选的是，输注速率为每分钟约1至2ml，例如每分钟约1.5ml。如本文所用，术语输注速率应理解为包括平均输注速率，例如每次给药输注的组合物的总体积除以输注的持续时间。
132.在再一个优选实施方式中，输注速率分别在每分钟约500000至约10000000个细胞、或每分钟约1000000至约7500000个细胞的范围内选择。
133.组合物可使用输液袋施用于患者，例如由乙烯乙酸乙烯酯(eva)制成的150ml混合输液袋(例如mib150(由hegewald或hemedis提供))，其容纳具有其最终浓度的组合物。输液袋可连接到管，例如输血管和过滤器组(过滤器孔径约200μm)和流量调节器。
134.在另一个优选实施方式中，组合物使用注射泵施用。合适装置的实例是ca
‑
700非固定注射泵(canafusion technology inc.)。然而，也可使用与具有所需内部体积容量(例如50ml)和可调节的流速的注射器兼容的任何其他注射泵。注射泵的安装应优选使得注射器具有垂直方向。本发明人已发现，在优选的输注速率下，垂直方向会使halpc在输注时间内更均匀地传送至患者，并且无需在输注过程中搅拌组合物。因此，在优选实施方式中，组合物用垂直安装的输注泵以每分钟约0.1至约5ml的速率、或以每分钟约0.5至2ml、例如每分钟1.5ml的速率施用于患者。
135.本发明人已进一步发现，通过包含至少两剂量halpc的给药方案实现了特别有效的治疗。因此，本发明的再一个实施方式涉及一种包含halpc的组合物，其用于治疗已发展aclf或有风险发展aclf的患者，其中：
136.a)该治疗包括施用第一量的所述组合物的步骤，所述组合物包含每kg体重250000至2500000个halpc细胞的剂量，其中所述组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗；以及其中
137.b)该治疗进一步包括向所述患者施用第二量的所述组合物的步骤，所述第二量包含每kg体重250000至2500000个halpc细胞的第二剂，并且其中所述组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中所述患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗；以及
138.其中所述第二量在第一量之后5至21天施用。
139.本发明人已惊奇地发现，第一次和第二次给药之间相隔5至21天的时间实质上有利于对治疗的耐受性，并且应避免更短的间隔。特别是，可显著降低患者出血或血栓形成等不良事件的发生和严重程度。
140.在一个实施方式中，施用组合物的第一量和第二量之间的时间间隔大于4天，例如5至21天。在另一个实施方式中，halpc组合物的第二量在第一量之后6至8天施用。在又一个实施方式中，组合物的第二量在所述第一量之后7天施用。
141.在再一个实施方式中，施用于患者的第二量包含每kg体重500000至1000000个hhlapc细胞的剂量。在另一个实施方式中，施用于患者的组合物的第二量包含每kg体重1000000至2500000个hhlapc细胞的剂量。
142.在又一个实施方式中，施用于患者的组合物的第一量和第二量可相同。作为另选，施用于患者的组合物的第一量可与组合物的第二量独立选择。
143.本发明可进一步描述为治疗已发展aclf或有风险发展aclf的患者的方法，其中该
治疗包括向所述患者施用一定量的组合物的步骤，该组合物包含每kg患者体重250000至2500000个人成体肝源性祖细胞、例如halpc细胞的剂量；其中该组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中该患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
144.此外，本发明涉及人成体肝源性祖细胞例如halpc在制造用于治疗和/或预防aclf的药物中的用途，其中该治疗包括向患者施用一定量的所述组合物的步骤，该组合物包含每kg体重250000至2500000个此类祖细胞的剂量，其中该组合物基本上不含有效量的抗凝剂，并且其中该患者未接受用抗凝剂的任何共同治疗。
145.进一步定义
146.术语“成体人肝源性祖细胞”与“人成体肝源性祖细胞”或“人类同种异体肝祖细胞”同义使用；“异源人成体肝源性祖细胞”缩写为“hhalpc”或“hhalpcs”或“halpc”或“halpcs”，代表特定的成体人肝源性祖细胞的类型，可如上文所述获得。相关技术领域的技术人员将了解，这些细胞已通常被标记为“异源”，即使源自人类肝脏。因此，这些细胞也可被标记为“同种异体”而非“异源”，以传达其源自与将接受细胞进行治疗的那些同一物种但不同个体的含义。
147.如本文所用，术语“体外”表示在动物或人体外部或外界。如本文所用，术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人体中取出并在身体外(例如在培养容器中)维持或繁殖的组织或细胞。
148.如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不会对受试者造成显著刺激并且不会消除所施用的组合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。载体的实例为但不限于丙二醇、盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物。
149.术语“足够量”是指足以产生所需和可测量的效果的量，例如足以改变蛋白表达谱的量。
150.术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
151.术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其目的是预防或减缓(减轻)目标病理病症或疾患。那些需要治疗的人包括那些已经患有该疾患的人以及那些易于患有该疾患的人或那些需要预防该疾患的人。
152.如本文所用，术语“同种异体”是指供给的材料来自与受体不同的个体。同种异体干细胞移植是指一个人接受来自遗传上相似但不相同的供体的干细胞的程序。
153.如本文所用，术语“纤维化”是指在修复或反应过程中在器官或组织中形成过多的纤维结缔组织。
154.术语“肝纤维化”是指急性或慢性肝损伤后间质或“瘢痕”细胞外基质的积聚。肝硬化是进行性纤维化的终末阶段，其特征是隔膜形成和围绕肝细胞小节的瘢痕环。通常，纤维化需要数年或数十年才能在临床上显现出来，但肝硬化在数月内发展的值得注意的例外情况可以包括小儿肝病(例如胆道闭锁)、药物诱发的肝病和与肝移植后免疫抑制相关的病毒性肝炎。
155.以下实施例用于说明本发明，但是不应理解为限制本发明的范围。
156.实施例
157.实施例1：halpc的制备
158.halpc如ep 3140393或wo2017/149059中的描述，从健康尸体供体或无心跳供体的肝脏制备。简言之，将肝细胞制剂重新悬浮在补充有10％fbs、10mg/ml ins、1mm dex的williams'e培养基中。原代细胞在烧瓶上培养，并在37℃下在含有5％co2的完全湿化的大气中培养。24小时后，更换培养基以清除未贴壁的细胞，此后每周更新两次，同时每天在显微镜下追踪培养物。12
‑
16天后将培养基更换为补充有9％fbs的高葡萄糖dmem。具有间充质样形态的细胞类型出现并增殖。当达到70
‑
95％汇合时，用重组胰蛋白酶和1mm edta对细胞进行胰蛋白酶化，并以1
‑
10x103个细胞/cm2的密度重新平板接种。在每次传代时，细胞在80
‑
90％汇合时进行胰蛋白酶化。
159.对细胞的测试证实，它们尤其表达以下标志物：cd90、cd73、波形蛋白和asma。还对细胞进行了测试，发现对于以下标志物呈阴性或表现出非常低的表达：cd133、cd45、ck19和cd31。将halpc以5ml的等分试样填充到小瓶中，各自包含10至50x106个细胞/ml,，相当于每小瓶50至250x106个细胞，并冷冻。
160.实施例2：对患者施用halpc(中期结果)
161.8位确诊慢加急性肝衰竭(aclf)的患者和7位患有急性失代偿(ad)、有风险发展aclf的患者使用本发明的给药方案，用根据实施例1制备的halpc治疗。使用上述人工方法对细胞进行计数。患者在治疗前的meld评分在18至35的范围，平均为约27。每位患者的总胆红素血清浓度均高于6mg/dl(≥100umol/l)；在患者之间，其在约7至约43mg/dl的范围，平均为约22mg/dl。所有患者均根据其临床状况的需要接受标准医疗(smt)，但没有伴随的抗凝剂治疗。
162.对于halpc的每次施用，将装有根据实施例1制备的细胞的小瓶解冻并用45ml无菌液体载体稀释，该载体含有碳酸氢钠和人类血清白蛋白以及作为赋形剂的药理学上无效的微量肝素(不高于500i.u./患者)。经计算含有指定剂量细胞的一定体积的组合物通过静脉内输注施用。
163.第一位参与的患者由于技术问题没有接受细胞。15位患者中有3位接受了单剂量250000个细胞/kg体重的hhalpc，有9位患者接受了500000个细胞/kg的剂量。在接受500000个细胞/kg的患者中，有7位在第一次施用之后7天施用500000个细胞的第二剂。
164.尽管施用的细胞剂量较低，但发现这些给药方案在改善肝功能和全身发炎方面对患者构成了高度有效的治疗干预。患者的胆红素水平以及meld评分显著降低。此外，患者的改善在整个随访期间是可持续的：对于在m3(开始治疗后第3个月)无移植存活的患者，胆红素水平已降低约60
‑
80％，并且meld评分下降40
‑
55％。
165.另外，两位患者(均为aclf)如上所述进行治疗，不同之处在于，每次给药施用每kg体重1000000个细胞的单剂量。一位患者在治疗后立即显示胆红素和meld评分的明显改善；另一位患者虽然有些延迟但也显示治疗效果。所有经历的不良事件均与基础疾病和合并症(comorbidities)相关。
166.也注意到的事实是，即使在没有伴随的抗凝剂治疗下，halpc也能成功地施用于患者。这是尤其令人惊讶的，因为表达可激活凝血级联的组织因子的干细胞(包括halpc)的施用通常被认为涉及提高的血栓形成风险，因此通常认为有必要用抗凝剂共同治疗，以防止血栓形成或出血。然而，这些结果表明，高度有效量的halpc可以安全地施用于患有aclf或有风险发展aclf的患者；即使这些患者基本上缺乏抵抗力，他们也能很好地耐受治疗，没有
与细胞疗法相关的显著的不良反应。特别是，在血小板、纤维蛋白原或凝血因子上，均未观察到临床上显著下降。在这些患者上观察到的任何报告的不良事件(ae)均与基础疾病和合并症相关。
167.应注意，该实施例2代表来自临床研究的中期结果，其完整结果由以下实施例3提供。
168.实施例3：对患者施用halpc(完整结果)
169.继续实施例2的临床试验，直到总共22位患者均进行本发明的治疗。本实施例的细胞计数和剂量，使用nucleocounter nc
‑
200通过上述自动化方法测定而提供。总之，对患者的治疗如下：
170.一位患者由于技术问题没有接受细胞。有三位患者接受了约600000个细胞/kg的一次输注。另有三位患者以约7天的间隔接受了约600000个细胞/kg的两次输注。另有三位患者接受了约800000个细胞/kg的一次输注。四位患者接受了约1200000个细胞/kg的一次输注。有八位患者以约7天的间隔接受了约1200000个细胞/kg的两次输注。在所有情况下，所输注的细胞包含在组合物中，该组合物仅含有药理学上不显著量的肝素，即每kg体重不超过10i.u.。没有患者接受抗凝剂共同用药。
171.结果，施用于患者的halpc剂量似乎良好耐受。这些患者报告的不良事件与基础疾病和合并症相关。
172.就功效而言，存活患者在第3个月的平均预后评分通常低于第1天，并且没有患者在第3个月患有aclf。预后评分的改善由患者的meld评分(尤其与移植优先顺序相关)和child
‑
pugh评分(尤其与评估死亡风险相关)的发展来说明，如图1所示。在第1、2和3个月，平均meld分数分别为21(标准偏差(sd)＝7.9)、15(sd＝5.2)和14(sd＝5.0)，低于基线(27；sd＝4.2)。在第3个月，12/13(92％)存活患者的meld评分低于各自的基线，8/13(61％)患者的meld评分≤15。在第1、2和3个月，平均child
‑
pugh评分分别为8.8(sd＝1.7)、7.6(sd＝1.6)和6.8(sd＝2.0)，低于基线(11；sd＝1.6)。在第3个月，12/13(92％)存活患者的child
‑
pugh评分低于各自的基线，7/13(53％)患者的child
‑
pugh评分≤6。
173.血液和血清生化值表明肝功能在3个月期间稳定或改善，包括那些有助于meld和child
‑
pugh评分的值。如图2所示，例如，在第2个月和第3个月的胆红素值的平均值和标准偏差分别为3.0mg/dl(sd＝1.8)和2.9mg/dl(sd＝2.0)，远低于基线(18mg/dl；sd＝9.6)，即使平均值仍高于正常参考范围(0
‑
1.2mg/dl)。肌酐和钠水平在活跃的研究期间似乎总体稳定，表明没有任何肾脏疾病恶化。
174.总之，本研究中获得的结果显示肝功能和全身发炎在输注后得到改善。临床上显著的meld和胆红素改善被认为是令人鼓舞的功效迹象。
175.实施例4：aclf患者中halpc的功效和安全性
176.进行一项随机、以安慰剂为对照的、双盲、多中心iib期研究以评估halpc在患有慢加急性肝衰竭(aclf)的患者中的功效和安全性。最近被诊断患有aclf 1级或2级的患者将被建议接受筛选程序以参与研究。aclf分级将基于clif器官衰竭(clif
‑
of)评分。患者将至少为18岁并且具有至少5mg/dl的胆红素值。此外，参与该研究的患者将具有不高于35的meld评分，并且没有因胆道疾病或自身免疫性肝炎引起的基础肝硬化。
177.然后，参与研究的患者将被随机分配，要么接受最佳标准护理治疗加安慰剂，要么
接受最佳标准护理加间隔约1周的两次输注halpc，每次输注含有每kg体重约1000000个细胞的halpc剂量。halpc输注将作为不包含任何药理学相关量的抗凝剂(特别是每次输注不超过10i.u./kg肝素)的组合物施用。
178.治疗方案后将是输注后3个月的评估期，其中将从患者获得安全性和功效数据。
179.根据先前获得的临床数据(见实施例2和3)，期望该进一步研究将使用本发明的给药方案证实halpc在aclf患者中的功效。更具体而言，就第一次输注后90天的患者整体存活比例的积极影响而言，它还将证明2次输注(iv)halpc(每次含有1000000个细胞/kg，间隔7天施用)的功效。
180.比较例
181.两位患有aclf的患者如实施例2中所述进行治疗，不同之处在于，每次给药施用250000000个halpc的单剂量，即每kg体重约4000000
‑
5500000个细胞。一位患者在第一剂之后四天接受了250000000个细胞的第二剂。患者经历了与治疗相关的不良反应：两位患者均经历了凝血因子大幅下降，并伴有严重的外周出血，包括严重的鼻出血。一位患者在经颈静脉活检的插入侧出血。
182.在不希望受理论限制下，据信细胞输注后导致严重出血的可能作用机制可能与细胞激活凝血级联有关，可能是由于halpc表达组织因子，导致因肝功能不全而造成这些因子的保留受到限制的患者消耗凝血因子；凝血因子的减少随后导致出血。