本发明属于生物检测，具体涉及一种基于高通量测序技术的高灵敏度检测flt3-itd突变的引物组、试剂盒及应用。
背景技术：
1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)是中国最常见的白血病亚型，占所有白血病患者的一般以上，aml在30岁以下人群中发病率比较低，随后随年龄增长而逐渐升高，患者的临床表现为发热、感染、出血及脏器的白血病细胞浸润。今年来随着化疗、移植、靶向药物等诸多治疗方案的不断进步，aml的疗效取得了长足的进步，年龄<60岁的患者近年来的长期生存率可达到35％～45％，年龄≥60岁的患者长期生存率较低，仅为10％～15％。白血病复发是导致aml治疗失败的主要瓶颈。
2、通常认为白血病患者在治疗关键节点(诱导治疗后、移植前、疗程结束后复查等)的缓解深度可有效的预测患者的预后。缓解深度的评估方式有骨髓形态学、流式细胞学、分子生物学等多种方法，其中传统的骨髓形态学至今仍未判定患者是否达到完全缓解(complete remission,cr)的金标准，但患者达到cr后(骨髓涂片经瑞特-吉姆萨染色，光学显微镜检测原始细胞<5％)，患者体内仍存在着微量的恶性肿瘤细胞，称为微小残留病(minimal residual disease或measurable residual disease,mrd)并往往成为患者耐药、复发的根源。因此对于患者mrd的水平进行有效的监测，并基于此决定患者的危险度分层和后续治疗的调整，就成为了决定aml患者预后水平的关键技术难点。
3、aml患者的mrd检测方法包括多参数流式细胞术(multiparameter flowtechnology，mfc)、实时定量聚合酶链反应(rq-pcr)技术以及数字pcr(dd-pcr)和二代测序技术(next generation sequencing,ngs)等。其中rq-pcr及dd-pcr技术仅适用于融合基因阳性/npm1突变阳性的患者，且要求靶基因在疾病治疗过程中稳定表达，因此仅适用于30-60％的aml患者，且该方法无法对肿瘤治疗过程中的克隆变化情况和耐药情况进行监测，导致其临床应用受到了一定的限制；而mfc技术的分析过程较为复杂，且受抗原漂变等影响，不能确定一些特定的白血病亚群，在临床应用中也有一定的局限性。
4、flt3基因内部串联重复(flt3-itd)突变在aml中发生率约为20～30％。aml预后分层中，eln和nccn指南提示aml患者预后评估需要依靠flt3-itd突变情况评估。flt3基因itd突变是aml最常见的特征性突变之一，是最常见的aml不良预后驱动因素，在aml诊断的预后评估中具有非常强的临床相关性，同时在国际临床实践当中批准了米哚妥林或奎扎替尼用于治疗，从而改变了风险分层。但由于itd突变作为一个大片段的串联重复突变，在不同患者及同一患者不同阶段存在异质性(即序列、位置和长度)，使得基于pcr的测序方式不敏感，检测灵敏度低，低频突变检测存在技术难题。在既往的技术当中，尤其是一代毛细管电泳作为flt3-itd检测作为主要的检测方式，其检测灵敏度约为1％(即10-2)且不能识别突变的具体序列及插入位置。然而flt3-itd突变在0.01％～0.001％(即10-5～10-6)层面的阳性检测也具有明确的临床意义，准确识别flt3-itd突变的具体序列和插入位置能够帮助临床准确识别aml患者的克隆演变及复发预测。而目前缺乏相应的检测方式及生物信息能力，因此成为了aml患者在分子生物学mrd检测亟需解决的问题。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，由于在分子生物水平上对aml患者flt3-itd突变微小残留病(mrd)检测的缺陷，为了实现对不同aml患者flt3基因不同的itd突变(即不同的序列、位置和长度)的准确识别及低频检测，本发明提供了一种基于高通量测序技术的高灵敏度检测flt3-itd突变的引物组、试剂盒及应用。
2、在本发明的第一方面，提供了一种检测flt3-itd突变的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：
3、
4、进一步地，所述引物组为基于高通量测序技术检测急性髓系白血病flt3-itd突变的引物组。
5、在本发明的第二方面，提供了一种检测flt3-itd突变的引物组，其特征在于，所述引物组的引物序列包括文库接头序列和引物序列，所述引物组序列为：
6、
7、进一步地，所述引物组为基于高通量测序技术检测急性髓系白血病flt3-itd突变的引物组。
8、进一步地，所述引物组的完整序列为：
9、
10、
11、在本发明的第三方面，提供了一种检测flt3-itd突变的引物组合物，其特征在于，包含本发明第一方面或第二方面所述的引物组、taq dna聚合酶、buffer。
12、进一步地，所述引物组合物为基于高通量测序技术检测急性髓系白血病flt3-itd突变的引物组合物。
13、在本发明的第四方面，提供了一种检测flt3-itd突变的试剂盒，其特征在于，包含本发明第一方面或第二方面所述的引物组或本发明第三方面所述的引物组合物。
14、进一步地，所述试剂盒为基于高通量测序技术检测急性髓系白血病flt3-itd突变的试剂盒。
15、进一步地，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、buffer、pcr enhancer、nuclease-free water、dntp、dna纯化磁珠。
16、进一步地，所述试剂盒还包括多重pcr试剂组，所述多重pcr试剂组包括taq dna聚合酶、buffer、pcr enhancer、udiprimer；进一步地，具体包括enhancer buffer n、enhancer buffer m、polymerase mixture、udiprimer、nuclease-free water、dna纯化磁珠。
17、在本发明的第五方面，提供了本发明的第一方面或第二方面所述的引物组或本发明第三方面所述的引物组合物在制备检测flt3-itd突变的试剂盒中的应用。
18、进一步地，所述试剂盒为基于高通量测序技术检测急性髓系白血病flt3-itd突变的试剂盒。
19、进一步地，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、buffer、pcr enhancer、nuclease-free water、dntp、dna纯化磁珠。
20、进一步地，所述试剂盒还包括多重pcr试剂组，所述多重pcr试剂组包括taq dna聚合酶、buffer、pcr enhancer、udiprimer；进一步地，具体包括enhancer buffer n、enhancer buffer m、polymerase mixture、udiprimer、nuclease-free water、dna纯化磁珠。
21、进一步地，所述检测flt3-itd突变的具体步骤包括：
22、(1)dna提取：利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna；
23、(2)复合pcr扩增：利用检测试剂盒对抽提的dna应用多重pcr试剂组成分进行多重pcr反应，得到多个目标核苷酸的扩增子产物；
24、(3)对扩增产物进行纯化：加入dna纯化磁珠对多个目标核苷酸的扩增子产物进行纯化，得到纯净的扩增子产物；
25、(4)建库扩增：以纯化后的扩增子产物作为模板,应用多重pcr试剂组成分进行再次pcr反应，得到新的扩增子文库；
26、(5)对建库产物进行纯化：加入dna纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应杂质,得到纯净的扩增子文库；
27、(6)测序：对纯净的扩增子文库进行高通量测序和生物信息学流程分析获取目标区域的序列信息得出基因突变结果。
28、进一步优选地，所述步骤(1)中抽提的dna浓度大于或等于55ng/ul。
29、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序为pe150高通量测序。
30、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序使用illumina平台进行。
31、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序使用illumina novaseq6000平台进行。
32、在本发明的第六方面，提供了本发明的第四方面所述的试剂盒在制备检测flt3-itd突变的产品中的应用。
33、进一步地，所述检测flt3-itd突变的具体步骤包括：
34、(1)dna提取：利用dna提取试剂盒对待测样本进行抽提dna；
35、(2)复合pcr扩增：利用检测试剂盒对抽提的dna应用多重pcr试剂组成分进行多重pcr反应，得到多个目标核苷酸的扩增子产物；
36、(3)对扩增产物进行纯化：加入dna纯化磁珠对多个目标核苷酸的扩增子产物进行纯化,得到纯净的扩增子产物；
37、(4)建库扩增：以纯化后的扩增子产物作为模板,应用多重pcr试剂组成分进行再次pcr反应，得到新的扩增子文库；
38、(5)对建库产物进行纯化：加入dna纯化磁珠结合目标片段回收扩增子产物，洗涤去除反应杂质,得到纯净的扩增子文库；
39、(6)测序：对纯净的扩增子文库进行高通量测序和生物信息学流程分析获取目标区域的序列信息得出基因突变结果。
40、进一步地，所述生物信息学流程分析的具体步骤为：1)对原始下机数据用fastp1(version 0.23.2,https://github.com/opengene/fastp)进行质控分析，去除接头和低质量的读段；2)将质控过后的数据用bwa2(version 0.7.17,https://github.com/lh3/bwa)软件比对到hg19参考基因上；3)使用商业软件dragen(version 3.10.4,illumina)进行flt3-itd的检测，得到最终的检测结果。
41、进一步优选地，所述步骤(1)中抽提的dna浓度大于或等于55ng/ul。
42、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序为pe150高通量测序。
43、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序使用illumina平台进行。
44、进一步优选地，所述步骤(6)中的高通量测序使用illumina novaseq6000平台进行。
45、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
46、与现有技术相比，本发明具有如下优点和进步性：
47、本发明提供的引物组合物、试剂盒及应用，结合高通量测序技术，可准确的扩增出flt3相应的文库，实现对低频flt3-itd的检测，其检测灵敏度可达0.0005％(即5×10-6)，最终可实现对aml患者flt3-itd突变的mrd检测。
48、本发明的引物组合物在进行高通量测序后，通过生物信息分析还可准确给出flt3-itd突变的具体位置及插入的具体序列。
49、常规的flt3-itd突变的检测方法和试剂以一代毛细管电泳为主，检测灵敏度主要在约为1％，个别试剂盒在一代毛细管电泳中能够进行0.01％的突变检测，但上述办法均未采用高通量测序技术测序及未采用对应的生物信息分析，人工判读过程中容易存在质控不统一。而本发明提供的引物组合物、试剂盒及应用，能够在实现在低频检测的同时完成itd的具体突变检测(识别具体插入位置及插入序列)，此外由于生物信息系统可统一调配参数，可达到质控统一，排除人工判读的差异。
50、由于flt3-itd突变受其涉及区域和插入片段长度影响，传统引物设计方法使用一对引物扩增后文库片段较长，必须使用pe250进行测序。然而，在实际高通量检测中，大多数检测采用pe150测序，导致pe250在实际高通量检测中适用面窄，不便于实际操作。若设计两对或多对引物扩增，会打断flt3-itd突变插入序列，造成检测数据不准确。本发明创新性地采用经过特殊设计的一对半引物，在保证检出效果的基础上将引物扩增后文库长度缩短并得到了出乎意料的检测效果，可适配pe150测序大幅提高了通用性。
1.一种检测flt3-itd突变的引物组，其特征在于，所述引物组序列为：
2.一种检测flt3-itd突变的引物组，其特征在于，所述引物组的引物序列包括文库接头序列和引物序列，所述引物组序列为：
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组的引物具体序列为：
4.一种检测flt3-itd突变的引物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物组、taq dna聚合酶、buffer。
5.一种检测flt3-itd突变的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求3所述的引物组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重pcr试剂组，所述多重pcr试剂组包括taq dna聚合酶、buffer、pcr enhancer、udiprimer。
7.权利要求1-3任一项所述的引物组或权利要求4所述的引物组合物在制备检测flt3-itd突变的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测flt3-itd突变的具体步骤包括：
9.权利要求5或6所述的试剂盒在制备检测flt3-itd突变的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测flt3-itd突变的具体步骤包括：
