本发明涉及家畜病毒检测，具体涉及一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术：
1、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs virus,prrsv)引起的一种以发热、厌食、妊娠母猪繁殖障碍、断奶仔猪普遍发生肺炎、生长迟缓以及死亡率增高为特点的高度接触性传染病。由于该病常导致患病猪的耳朵呈蓝紫色，因此又被称为“猪蓝耳病”。该疾病主要导致母猪妊娠晚期自然流产，以及产死胎、木乃伊胎或弱小仔猪；还会导致仔猪先天性发育不良、呼吸窘迫、间质性肺炎和免疫功能抑制；它常与其他病原体的混合感染。
2、prrsv是一种有包膜的单股正链rna病毒，是动脉炎病毒属的成员。prrsv目前是威胁全球养猪业最严重的病原体之一。prrsv可分为两类基因型，欧洲型(prrsv-ⅰ型)和美洲型(prrsv-ⅱ型)，分别以lv株和vr-2332株为代表毒株。尽管这两类基因型在猪中引起相似的疾病综合征，但它们分别代表了遗传和抗原上两个不同的prrsv群体，其核苷酸序列相似性仅为约60％。该病毒于1996年首次在我国分离出来并被鉴定为prrsv-ⅱ型失。2006年至2016年，prrsv流行毒株以高致病性prrsv(hp-prrsv)的jxa1株为代表，其主要特点是在nsp2基因上存在30个氨基酸的不连续缺失。2017年后，随着病毒的变异，nadc30-like毒株逐渐成为我国prrsv流行的代表毒株，与经典prrsv(c-prrsv)相比，nadc30-like毒株在nsp2基因上具有131个氨基酸不连续缺失的特征。近年来，我国猪群中nadc34-like毒株检出率有所增加，其与ndac30-like毒株属于同一谱系，在nsp2基因上存在100个氨基酸的连续缺失。现有的以hp-prrsv为毒株母本的弱毒疫苗并不能对nadc30-like和nadc34-like毒株的感染提供完全保护。
3、prrsv基因组的长度约15kb，包含至少十个开放阅读框(orf)，包括orf1a，orf1b，orf2a，orf2b，orf3，orf4，orf5，orf5a，orf6和orf7。在这些orf中，orf1a和orf1b编码病毒的非结构蛋白(nsp)，其余8个orf分别编码病毒结构蛋白gp2a，gp2b，gp3，gp4，gp5、e、m和n。在整个基因组中，orf7基因是prrsv基因组中变化最小的区域，在不同类型毒株之间高度保守。因此，orf7基因通常作为理想的分子标记，被认为是prrsv感染通用型诊断的重要靶标。
4、prrsv核酸的诊断技术主要包括普通rt-pcr和荧光定量rt-pcr，这两种方法是目前兽医实验室诊断中最快速、最有效和最灵敏的检测方法，但缺点是普通rt-pcr技术需要价格较高的pcr仪器及配套核酸电泳仪和凝胶成像仪，而荧光定量pcr需要昂贵的荧光定量pcr仪器，两种方法均需在洁净的实验室环境中才能操作完成，并且还需要有分子生物学专业或有实验室经验的专业的技术人员操作完成，检测时间长、成本高且对环境和人员要求较高。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组、试剂盒及应用，以解决现有采用rt-pcr检测方法的时间长、成本高和操作难度高的问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
3、重组酶介导链置换核酸扩增(recombinase-aid amplification，raa)，是一种恒温核酸快速扩增技术。无需实验室专业技术人员操作和实验室环境以及价格较高或昂贵的精密仪器的配合，只需普通人员采用手握或者一台简单的恒温设备(恒温水浴锅或者培养箱)，在户外或者任何普通环境下操作1小时左右时间，然后通过肉眼观察即可完成检测及结果判定，检测时间短、成本低且对环境和人员要求较低。rt-raa先利用逆转录酶将rna逆转录成cdna，从细菌或真菌中获得的重组酶在常温下可与引物dna紧密结合，形成重组酶/引物复合体，侵入rna-cdna双链核酸模板，在侵入位点重组酶将双链打开，同时单链结合蛋白结合到被重组酶打开的单链上，维持双链模板处于开链状态。重组酶/引物复合体开始对双链进行扫描，当引物在模板上搜索到与之完全匹配的互补序列时，重组酶/引物复合体解体，dna聚合酶结合到引物的3’端，开始合成新链。合成的新链又可以作为模板，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。经过荧光标记的探针与扩增产物结合，当探针被核酸内切酶酶切后，与生物素标记的引物共同扩增形成两端有荧光及生物素标记的片段，可用通用型核酸检测试纸条进行判读。
4、因此，针对prrsv现有的诊断技术缺点以及raa检测技术优势，本发明研制了一种便于携带、不受实验室仪器和操作技术限制、操作简单、快速、准确的通用型prrsv rt-raa-lfd检测试剂盒，实现可快速、精准的确诊prrsv感染，为养猪场做好生物安全防范、药物治疗和疫苗防控提供技术支撑。
5、一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组，所述引物探针组的核苷酸序列为seq id no:1～seq id no:5。
6、进一步，所述引物探针组中的上游引物的核苷酸序列为seq id no:2，下游引物的核苷酸序列为seq id no:4，探针的核苷酸序列为seq id no:5。
7、进一步，所述引物中的下游引物的5'端用生物素标记；所述探针的5'端标记fam基团，中间用四氢呋喃残基thf替换核苷酸，3'末端标记聚合酶延伸阻断基团c3-spacer。
8、一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，包括所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组。
9、进一步，还包括：
10、buffer a：20％ peg溶液；
11、buffer b：280mm乙酸镁溶液；
12、反应干粉：40ng/μl逆转录酶、60ng/μl单链结合蛋白、140ng/μl重组酶蛋白、20ng/μl聚合酶蛋白、1ng/μl重组酶辅助蛋白，盐离子：20mm tris、50mm氯化钾，能量体系：3mmatp、80ng/μl肌酸激酶(ck)，冻干保护剂：0.06mg/ml海藻糖、0.05mg/ml甘露醇、0.02mg/mlpeg、150mm dntps。
13、进一步，还包括一次性核酸检测试纸条；所述一次性核酸检测试纸条为按照吸收垫、判读区、结合垫和样品垫顺序组成；吸收垫用于吸引试纸条下端蘸取的液体向上扩散；判读区用于肉眼判定结果(c线只要含抗fam抗体的胶体金颗粒液体经过就会产生红色带，t线只有恒温扩增出含fam-双链dna-生物素的产物与抗fam抗体的胶体金颗粒液体结合，再扩散与t现位置的生物素配体结合产生红色带)；结合垫是恒温扩增出含fam-双链dna-生物素的产物与抗fam抗体的胶体金颗粒液体结合的位置，结合后的产物再扩散到t线，过量剩余未结合的抗fam抗体的胶体金颗粒液体会与c线结合作为质控对照；样品垫是加恒温扩增产物样品的区域(可以将其直接蘸取产物)。结合垫中成份包括：结合在30μg/ml抗fam抗体的粒径为15～20nm胶体金颗粒；其中检测区t线成份：1.0mg/ml生物素配体；质控区c线成份：能够与抗fam抗体结合的抗体。
14、进一步，还包括prrsv病毒核酸无设备快速提取试剂；所述prrsv病毒核酸无设备快速提取试剂包括tris平衡酚、4m醋酸钠、5～8m异硫氰酸胍和trizol的混合液，其体积比为3:1:3:3。
15、进一步，还包括prrsv标准阳性质粒；所述prrsv标准阳性质粒是用seq id no:6序列合成的产物与pmd18-t载体连接，转化到dh5α感受态细胞中后挑取白色单菌落，摇菌提取的阳性质粒，拷贝数为1.0×109copies/μl。
16、进一步，还包括记载有判断标准的载体；所述判断标准为若试纸条出现两条红色的带，一条位于质控区，一条位于检测区，表明样品中含有prrsv的核酸，数量达到了最低检出量，则为阳性；若试纸条的质控区出现一条红色带，检测区没有条带，表明样本中不含prrsv核酸或低于试纸条最低检出量，则为阴性；若试纸条的质控区和检测区均未出现条带，则为无效。
17、所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒在制备猪繁殖与呼吸综合征诊断试剂中的应用。
18、本发明的有益效果在于：本发明研制的一种便于携带、不受实验室仪器和操作技术限制、操作简单、快速、准确的通用型prrsv rt-raa-lfd检测试剂盒，实现可快速、精准的确诊prrsv感染，为养猪场做好生物安全防范、药物治疗和疫苗防控提供技术支撑。
1.一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组，其特征在于，所述引物探针组的核苷酸序列为seq id no:1～seq id no:5。
2.根据权利要求1所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组，其特征在于，所述引物中的下游引物的5'端用生物素标记；所述探针的5'端标记fam基团，中间用四氢呋喃残基thf替换核苷酸，3'末端标记聚合酶延伸阻断基团c3-spacer。
3.一种用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd引物探针组。
4.根据权利要求3所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，其特征在于，还包括：
5.根据权利要求3所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，其特征在于，还包括prrsv病毒核酸无设备快速提取试剂；所述prrsv病毒核酸无设备快速提取试剂包括tris平衡酚、4m醋酸钠、5～8m异硫氰酸胍和trizol的混合液，其体积比为3:1:3:3。
6.根据权利要求3所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，其特征在于，还包括prrsv标准阳性质粒；所述prrsv标准阳性质粒是用seq id no:6序列合成的产物与pmd18-t载体连接，转化到dh5α感受态细胞中后挑取白色单菌落，摇菌提取的阳性质粒，拷贝数为1.0×109copies/μl。
7.根据权利要求3所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒，其特征在于，还包括记载有判断标准的载体；所述判断标准为若试纸条出现两条红色的带，一条位于质控区，一条位于检测区，表明样品中含有prrsv的核酸，数量达到了最低检出量，则为阳性；若试纸条的质控区出现一条红色带，检测区没有条带，表明样本中不含prrsv核酸或低于试纸条最低检出量，则为阴性；若试纸条的质控区和检测区均未出现条带，则为无效。
8.权利要求3-7任一所述的用于检测prrsv的rt-raa-lfd试剂盒在制备猪繁殖与呼吸综合征诊断试剂中的应用。
