本发明属于生物医药，具体涉及结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用。
背景技术：
1、结核病是一种古老的疾病，两个多世纪以来曾造成超过10亿人的死亡。当前结核分枝杆菌（ mycobacterium tuberculosis， m. tb）仍然引起全球每年大概1千万人发病。据who统计，2022年结核分枝杆菌感染的人数达1060万人，结核病相关死亡总数为130万例，耐药性结核病的病例已上升至41万。卡介苗（bacillus calmette-guerin，bcg）是目前唯一获准使用的结核病疫苗，自1921年首次应用于人体以来，全球已约有80%的国家将其列入免疫规划。虽然bcg在预防婴幼儿结核性脑膜炎和播散性结核病中已表现出良好的免疫效果，但是其针对青少年和成人的保护效果十分有限，并且对结核分枝杆菌的原发感染以及潜伏感染的激活也缺乏有效保护。一项对挪威出生的个人进行的回顾性调查显示，bcg对9岁以下儿童的肺结核的保护效力67%，10～19岁为63%，20～29岁下降到50%。当前尚无针对青少年和成人群体预防性和暴露后的结核疫苗。因此，迫切需要开发新型疫苗以预防结核病。
2、作为一种专职胞内寄生的细菌性微生物， m. tb的基因组编码超过4200个蛋白，如此庞杂的蛋白表达数量为结核疫苗的开发带来了难度。截止目前，全球正在开展临床试验的结核病疫苗共有17个，根据其设计路线可分为减毒活疫苗、灭活分枝杆菌或提取物疫苗、病毒载体疫苗以及亚单位疫苗。然而这些类型的疫苗各有缺点：减毒活疫苗和灭活疫苗存在毒力恢复的风险，并且其效果可能较难超越现有的bcg；病毒载体疫苗诱导免疫反应的能力较弱，且可供选择的病毒载体有限；亚单位疫苗安全性好且容易修饰，但因免疫原性弱，需要与佐剂联合使用，而且开发的周期长。
3、随着mrna疫苗技术的不断成熟，与传统疫苗比较，mrna疫苗具有诸多优势：①设计灵活，易于规模化生产；②安全性较好，无dna疫苗的基因组整合风险且可通过自然途径降解；③生产过程不涉及活病毒操作，无感染性；④疫苗直接在胞内原位产生抗原蛋白，可同时诱导机体产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答。现有针对流感病毒、rsv、hsv、hiv、zikv、疟原虫（ plasmodium berghei）、金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（ pseudomonas aeruginosa）等多种传染性病原微生物的mrna疫苗的临床前或临床研究均表现出优良的免疫保护效果。因此，开发针对 m. tb的mrna疫苗有望弥补现有bcg疫苗的不足。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于，提供一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，能利用其制备mrna疫苗，不仅能够产生较高的ifn-γ，还能够诱导较强的t细胞免疫应答，采用bcg初免+mrna加强免疫后，优于bcg单独免疫效果，具有较好的临床应用价值和前景。
2、本发明的目的之二在于，提供一种编码上述结核分枝杆菌多免疫原抗原的多核苷酸。
3、本发明的目的之三在于，提供一种表达载体，其包含上述的核酸构建体。
4、本发明的目的之四在于，提供上述的结核分枝杆菌多免疫原抗原或多核苷酸或核酸构建体或表达载体在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
5、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6、本发明一方面公开了一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，所述多免疫原抗原为嵌合抗原或混合抗原，所述多免疫原抗原包含：
7、免疫原i：ag85a蛋白或其抗原性片段；
8、免疫原ii：esat6蛋白或其抗原性片段；
9、免疫原iii：cfp10蛋白或其抗原性片段；
10、其中，嵌合抗原为一个或多个免疫原i、ii、iii以串联方式形成的单链；
11、混合抗原为免疫原i、ii、iii的混合物。
12、本发明的部分实施方案中，所述ag85a蛋白的抗原性片段为具有如seq id no:12所示的氨基酸序列；
13、和/或，所述esat6蛋白的抗原性片段为具有如seq id no:14所示的氨基酸序列的肽段；
14、和/或，所述cfp10蛋白的抗原性片段为具有如seq id no:15所示的氨基酸序列的肽段。
15、本发明的部分实施方案中，所述嵌合抗原具有如式①所示结构：
16、式①：a-l1-e-l2-c
17、其中，a表示结核分枝杆菌ag85a蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
18、e表示结核分枝杆菌esat6蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
19、c表示结核分枝杆菌cfp10蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
20、l1、l2各自独立地为无，或者连接序列(ggggs)n，其中，n为1-10之间的任意整数。
21、本发明的部分实施方案中，所述a为具有如seq id no:12所示的氨基酸序列的肽段；
22、和/或，所述e为具有如seq id no:14所示的氨基酸序列的肽段；
23、和/或，所述c为具有如seq id no:15所示的氨基酸序列的肽段。
24、第二方面，本发明提供了一种多核苷酸mrna，其编码上述的结核分枝杆菌多免疫原嵌合或混合抗原。
25、本发明的部分实施方案中，所述多核苷酸mrna包括如seq id no:1所示的序列；
26、或者，如seq id no:2所示的序列和如seq id no:3所示的序列。
27、本发明的部分实施方案中，所述mrna包括以下结构：p1-p2-p3-p4-p5-p6-p7-p8-poly(a)；
28、或者包括如下结构：p1-p2-p3-p8-poly(a)及p1-p2-p5-p6-p7-p8-poly(a)；
29、其中p1为5’ utr序列，p2为信号肽序列；p3为免疫原i蛋白编码序列，p5为免疫原ii蛋白编码序列，p7为免疫原iii蛋白编码序列；p4、p6均为linker序列，相同或不同；p8为3’utr序列；poly(a)为多聚腺苷酸。
30、本发明的部分实施方案中，所述p1为人β血红蛋白基因的5’ utr序列；
31、和/或，p2为人血清免疫球蛋白κ轻链的信号肽序列；
32、和/或，p3为ag85a蛋白编码序列，其mrna序列如seq id no:16所示；
33、和/或，p5为esat6蛋白编码序列，其mrna序列如seq id no:17所示；
34、和/或，p7为cfp10蛋白编码序列，其mrna序列如seq id no:18所示；
35、和/或，p4和p6相同，linker序列(ggggs)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
36、和/或，p8为人α血红蛋白基因的3’ utr序列；
37、和/或，poly(a)的个数为80-200个。
38、作为优选的，poly(a)的个数为100。
39、本发明的一些实施例中，5’端utr序列如seq id no:4所示。
40、本发明的一些实施例中，3’端utr序列如seq id no:5所示。
41、本发明的一些实施例中，信号肽的氨基酸序列如seq id no:6所示。
42、本发明的一些实施例中，linker的氨基酸序列如seq id no:7所示。
43、第三方面，本发明提供了一种体外转录（ivt）质粒，其用于生产上述多核苷酸mrna；所述体外转录质粒包括质粒骨架序列和编码结核分枝杆菌抗原肽的dna序列。
44、编码结核分枝杆菌抗原肽的dna序列如seq id no:8所示或如seq id no:9所示或如seq id no:10所示；所述质粒骨架序列包括t7启动子序列、5’末端帽结构、5’端utr区、信号肽序列、3’端utr区和3’末端poly(a)尾。
45、所述5’末端帽结构为m7g(5’)ppp；5’端utr区具有如seq id no:4所示序列；信号肽序列如seq id no:6所示；3’端utr区具有如seq id no:5所示序列；3’末端poly(a)尾为80～200个a，进一步优选为100个a。
46、第四方面，本发明提供了上述结核分枝杆菌多免疫原嵌合或混合抗原或多核苷酸mrna的应用，所述应用为在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
47、本发明的部分实施方案中，所述药物为疫苗。
48、本发明的部分实施方案中，所述疫苗为mrna疫苗。
49、本发明的部分实施方案中，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
50、所述疫苗包括疫苗载体和上述多核苷酸mrna。
51、本发明的部分实施方案中，所述疫苗载体包括阳离子脂质体、阳离子蛋白、阳离子聚合物或阳离子脂质纳米颗粒中的一种，优选为阳离子脂质体或阳离子脂质纳米颗粒。
52、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
53、本发明采用mrna疫苗技术可解决减毒活疫苗、灭活分枝杆菌或提取物疫苗、病毒载体疫苗以及亚单位疫苗等技术手段方面的缺点。本发明设计并实施的mrna疫苗可以同时表达3个结核分枝杆菌抗原，无需佐剂配伍，采用lnp包裹mrna后免疫小鼠不仅能够产生较高的体液免疫，还能够诱导较强的t细胞免疫应答，采用bcg初免+mrna加强免疫后，优于bcg单独免疫效果，具有较好的临床应用价值和前景。
1.一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述多免疫原抗原为嵌合抗原或混合抗原，所述多免疫原抗原包含：
2. 根据权利要求1所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述ag85a蛋白的抗原性片段为具有如seq id no:12所示的氨基酸序列；
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述嵌合抗原具有如式①所示结构，
4.一种多核苷酸mrna，其特征在于，其编码如权利要求1-3任一项所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原。
5. 根据权利要求4所述多核苷酸mrna，其特征在于，包括如seq id no:1所示的序列；
6.根据权利要求4所述的多核苷酸mrna，其特征在于，包括如下结构：p1-p2-p3-p4-p5-p6-p7-p8-poly(a)；
7. 根据权利要求6所述的多核苷酸mrna，其特征在于，所述p1为人β血红蛋白基因的5’utr序列；
8.如权利要求1-3任意一项所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原或权利要求4-7任意一项所述的多核苷酸mrna的应用，其特征在于，在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
