本发明涉及基因检测，尤其是涉及检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、结核病（tuberculosis, tb）是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，在全世界广泛流行。目前，结核病仍是全球重要的公共卫生问题，尤其是耐药结核病患者的诊断及治疗一直是国内外关注的重点。耐药结核病与普通结核病相比，耐药结核病诊断复杂、治疗困难，疗程长，疗效差，费用高。因此，耐药结核病的诊断是结核病防控的关键一环，是实现“终止结核病”的重中之重。
2、贝达喹啉（bedaquiline）是一种属于二芳基喹啉的化合物，于2012年首次获得美国食品药品监督管理局（food and drug administration，fda）批准，用于治疗耐多药结核病（mdr-tb）和广泛耐药结核病（xdr-tb）。随着“抗结核新药贝达喹啉临床应用专家共识”的形成，贝达喹啉在我国的临床应用中得到广泛推广。贝达喹啉主要通过抑制分枝杆菌三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，atp）合成酶的质子转移链来抑制分枝杆菌活性。到目前为止已知的贝达喹啉耐药分子机制由三个基因atpe（rv1305）、rv0678（mmpr5）、pepq（rv2535c）的非同义突变导致。其中atpe基因（rv1305）编码贝达喹啉的作用靶标——atp合成酶的跨膜蛋白；atpe基因28、61、63、66位密码子的靶点突变，导致贝达喹啉与atp合成酶的fo结构域c亚基结合能力减弱，h+转移维持，atp产生，从而产生耐药。贝达喹啉药物的使用，会伴随着抗药性的产生，需要发展早期、灵敏、准确的检测技术对其进行监测。
3、耐药结核病的诊断技术主要分为两大类：第一类是表型方法（罗氏培养基比例法、h710/11比例法、mgit960）；第二类是基因型方法（分子信标、反向杂交、溶解曲线），相比于基因型方法，表型方法是耐药诊断的金标准，检测药物较多，同时也存在检测周期长，生物安全需求高等缺点，不利于耐药结核病的快速诊断。而基因型方法有着检测周期短，检测的结果重复性好，生物安全低的优势，已经被广泛使用。目前，针对于抗结核新药贝达喹啉耐药基因检测的方法及发明专利较少。因此，开发抗结核新药贝达喹啉耐药基因检测技术及其试剂盒具有广泛的应用价值，对mdr-tb和xdr-tb患者的辅助诊断及早期精准治疗意义重大。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒及检测方法，根据结核分枝杆菌atpe基因耐药突变位点，设计2对引物2条探针，构建基于探针溶解曲线的单管双色多重实时pcr体系，对痰液等样本进行结核分枝杆菌贝达喹啉耐药突变检测，可检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因atpe对应的28、61、63和66位氨基酸突变，快速、灵敏、特异，此外，还可以用于异质性耐药的检测，监控用药前后患者体内野生型菌株与耐药突变型菌株的比例，为结核分枝杆菌感染的患者提供准确科学的辅助诊疗依据。
2、为实现上述目的，本发明提供了一种贝达喹啉耐药基因突变检测的引物探针组合，包括：
3、atpe28-f：5’-gactgatcatggccggtg-3’，如seq id no.1所示；
4、atpe28-r：5’- ttgccgggcgacaccgg-3’ ，如seq id no.2所示；
5、atpe61-66-f：5’-cggctgttcacaccgttct-3’ ，如seq id no.3所示；
6、atpe61-66-r：5’-ggtgtagcgaagacgaaca-3’ ，如seq id no.4所示；
7、probe a：5’- fam-tcggtgacggtgtcgccggta-bhq1-3’ ，如seq id no.5所示；
8、probe b：5’-rox-ttgaggcggcatacttcatcaacc-bhq2-3’ ，如seq id no.6所示；
9、其中探针probe a覆盖atpe基因对应第28位氨基酸的密码子，5’端标记fam，3’端标记bhq1；探针probe b覆盖atpe基因对应第61位、63位和66位氨基酸的密码子，5’端标记rox，3’端标记bhq2。
10、本发明还提供了检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒，包括盒体、扩增试剂、对照试剂和上述的引物探针组合，扩增试剂包括pcr mix a、pcr mix b和tb酶，对照试剂包括野生型阳性对照和tb阴性对照。
11、进一步的，pcr mix a包括1×pcr buffer(10mm tris-hcl，ph 8.6、50mm kcl，5%甘油)、2.0mm mgcl2、0.2mm dntp mix（datp、dctp、dgtp、dutp）；pcr mix b包括0.06μmatpe28-f、1.2μm atpe28-r、0.06μm atpe61-66-f、0.6μm atpe61-66-r、0.4μm probe-a、0.4μm probe-b；野生型阳性对照为atpe野生型标准质粒；所述tb阴性对照为ddh2o。
12、本发明还提供了上述检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，是基于探针溶解曲线的单管多重实时pcr体系，包括以下步骤：
13、s1、试剂准备——配液区；
14、s2、样品提取及加样——提取区；
15、s3、pcr扩增——扩增区；
16、s4、试剂盒的参考值；
17、s5、结果判读。
18、进一步的，步骤s1的具体操作为：
19、①首先将所有的试剂从冰箱中取出并平衡至室温，pcr反应液配液标准为：取n×12.5μl pcr mix a、n×7 μl pcr mix b和0.5μl tb酶混合液加入到1.5ml 离心管中，振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒；
20、②pcr反应液的分装，pcr反应液分别以每管20μl分装于8联排pcr反应管中；
21、③将配制好的8联排pcr反应管装入凹凸袋转移至加样间，贮存在-20℃直至样品提取处理完毕。
22、进一步的，步骤s2的具体操作为：
23、①样本前处理：
24、a.痰液处理方式：约5ml痰标本置于相应的前处理管中，视痰标本黏稠度在其中加入4倍体积4% naoh溶液，旋紧螺旋盖后涡旋震荡30秒，使标本均质化，液化充分后，取1ml用于提取；
25、b.结核分枝杆菌分离培养物处理方式：固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用22swg标准接种环收集细菌1环，并重悬于1ml dna提取液中用于后续核酸提取；
26、对于均质液体样本：肺泡灌洗液、脑脊液、胸水、腹水等可直接取1ml进行核酸提取，
27、②样本核酸提取：
28、使用商业化核酸提取试剂盒，配合generotex系列全自动核酸提取仪完成样本核酸提取；
29、③用微量加液器向8联排pcr反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5μl，立即盖严管盖；
30、④将已加入模板的8联排pcr反应管转移至pcr扩增区。
31、进一步的，步骤s3的具体操作为：
32、①扩增和溶解曲线分析均在slan-96s实时荧光pcr仪上进行，反应程序为：95℃预变性3min；95℃ 变性10s，58℃退火15s，70℃延伸25s，55个循环，58℃ 15s处收集荧光信号；95℃ 变性2min；45℃ 保温2min；45℃～90℃，每0.1℃的升温速率从45℃-90℃进行溶解曲线分析，在溶解曲线程序中采集fam和rox两个通道的荧光信号；
33、②程序运行完毕，将8联排pcr反应管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。
34、进一步的，步骤s4的具体参考值为：
35、阳性对照，即野生型在各通道中的tm值范围如下：fam通道野生型对照峰的tm值为：76.1℃±1℃；rox通道野生型对照峰的tm值为75.4℃±1℃；其中各tm值均在slan-96s实时荧光pcr仪上所得的常见值，作为参考，当使用其它仪器时，tm值可能略有变动，以当次试验阳性对照(野生型)所得的tm值为准。
36、tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上tm值时，请参考阳性对照和阴性对照的峰型选择有效tm值。当出现仪器无法自动给出tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得tm值。
37、进一步的，步骤s5的具体操作为：
38、通过比较所检测样品与野生型模板之间熔解曲线的熔点tm值的差异，判断样品是否发生突变，若样品的熔点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过1℃）时，判断为野生型；若样本熔点低于阳性对照的熔点2℃及以上（∆tm≥2℃）时判定为突变型。并且可参考说明书中所述的∆tm值进行判断待检样本为哪一种突变类型。
39、本发明所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒及检测方法的优点和积极效果是：
40、1、本发明提供的引物探针组合用于检测贝达喹啉耐药性，扩增片段覆盖与贝达喹啉耐药相关的atpe基因，包含atpe基因对应的第28、61、63和66位氨基酸的密码子，覆盖目前文献报道的明确与贝达喹啉耐药相关的突变位点。
41、2、本发明采用双标记寡核苷酸探针，探针可选择多种类型的荧光基团和猝灭基团，此外可进行lna修饰，已达到更好区分野生型菌株与突变型菌株。
42、3、本发明极大地提高了结核分枝杆菌贝达喹啉耐药突变检测的灵敏度、特异性，可辅助临床医生，初步判断具体突变位点及类型在临床中出现的耐药情况（耐药基因类型及浓度），为mdr-tb和xdr-tb患者提供更为准确科学的辅助诊疗依据。
43、下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
1.一种贝达喹啉耐药基因突变检测的引物探针组合，其特征在于，包括：
2.检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：包括盒体、扩增试剂、对照试剂和如权利要求1所述的引物探针组合，扩增试剂包括pcr mix a、pcr mix b和tb酶，对照试剂包括野生型阳性对照和tb阴性对照。
3.根据权利要求2所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：pcr mix a包括1×pcr buffer、2.0mm mgcl2、0.2mm dntp mix；pcr mix b包括0.06μm atpe28-f、1.2μm atpe28-r、0.06μm atpe61-66-f、0.6μm atpe61-66-r、0.4μm probe-a、0.4μm probe-b；野生型阳性对照为atpe野生型标准质粒；所述tb阴性对照为ddh2o。
4.根据权利要求2或3所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，是基于探针溶解曲线的单管多重实时pcr体系，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s1的具体操作为：
6.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s2的具体操作为：
7.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s3的具体操作为：
8.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s4的具体参考值为：
9.根据权利要求4所述的检测结核分枝杆菌贝达喹啉耐药基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤s5的具体操作为：
