背景技术：
1、化学寡核苷酸合成(cos)是目前产生合成dna和rna的方法，已有近40年的历史，并且在领域诸如功能基因组学、合成生物学、基于dna的数据存储和依赖快速且低成本dna合成的医学应用的新发现已受到限制。在过去的二十五年里，cos的成本仅改善了20x(参见，例如，生物经济资本网站上生物经济主页显示的数据)，并且尚未跟上对合成dna不断增长的需求。此外，cos受限于具有高达或约200个核苷酸的核酸链，并且需要采用复杂设备和生产工艺的大型集中设施。对合成核酸的快速增长的需求需要能够递送长核酸分子的新型快速且低成本的合成路线。由于自然界中有丰富的dna和rna聚合酶，所以酶促核酸合成路线受到广泛关注。
2、酶促寡核苷酸合成(eos)已被各种商业团体追求了数年(efcavitch 2016,hiatt1995,hiatt 1995a)，最近获得令人兴奋的发现和进展(palluk 2018,perkel 2019,hoff2020,lee 2020)。此类策略可以旨在制备rna或dna寡核苷酸，或rna-dna嵌合体。
3、大多数eos策略使用末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)，其是能够在体外将核苷酸添加至单链dna的3'末端的不依赖模板的dna聚合酶(tidp)(deibel 1980,fowler 2006,motea2010,jensen 2018,loc'h 2018,deshpande 2019,sarac 2019)。已知的tdt将通过酶的高加工性或高开关速率(gouge 2013)聚合数百个核苷酸长度的dna(ddeibel 1980,delarue2002,fowler 2006,motea 2010,jensen 2018,loc'h 2018,sarac 2019)。其他dna聚合酶，特别是参与dna修复过程的dna聚合酶，也已被证明在体外具有不依赖模板的dna聚合酶(tidp)活性(clark 1988,domínguez 2000,ruiz2001,juárez 2006,moon 2007,moon2007a,hogg 2012,moon 2014,kent2016,frank 2017,yang 2018,chang 2019)，尽管非tdt酶的tidp活性尚未得到广泛研究。
4、为了产生确定长度和序列的多核苷酸，目前的eos过程使用3'-封闭的核苷酸，在每个添加循环后去除封闭基团(图1a)。3'封闭基团防止每个添加循环添加多个核苷酸。
5、然而，3'-封闭的核苷酸具有限制该领域进展的许多缺点。首先，大多数天然dna聚合酶非常低效地掺入具有3'修饰的核苷酸，并且还显示出明显的碱基偏好和序列特异性。其次，3'封闭基团的化学性质至关重要，因为它需要同时足够稳定以避免在添加步骤过程中自发或酶催化去除，并且完全可去除以为下一个添加步骤做准备。这种平衡很难达到，并且已将该领域限制为具有期望质量的少量封闭基团化学。第三，酶需要适应3'封闭基团，这产生核苷酸化学和酶优化的相互关联的挑战。第四，该策略的去封闭步骤相对于其他酶促合成过程增加了化学反应步骤，这增加了过程复杂性，并且可能涉及使用昂贵且有毒性的化学品。
6、已描述使用天然或未封闭的核苷三磷酸的寡核苷酸合成的可选方法(schott1984)。由于通过不依赖模板的核酸聚合酶进行多个核苷酸的进行性添加，该方法要求在每个添加循环后，将接受单个核苷酸添加的寡核苷酸分子与接受0、2或更多个核苷酸的寡核苷酸分离。每次添加循环后要求进行寡核苷酸纯化限制了该方法的效用。
7、为了简化酶促寡核苷酸合成的问题，并创建差异化方法用于有效酶促寡核苷酸合成过程，我们开发了图1b中所示的策略，其仅使用天然核苷酸。有效添加核苷酸，然后不能移位并保持与dna模板缔合的tidp，在每个合成循环中将可靠地仅添加单个核苷酸。因此，该酶可以防止向寡核苷酸底物的3'末端添加多于一个核苷酸，并且不需要修饰的核苷酸。在开始新循环之前，通过洗涤、加热和/或用离液盐去除核苷酸并解离酶。适用于该过程的tidp的发展被大大简化，并且dna合成成本将大幅降低。primordial genetics的成本模型显示，在小(fmol)和中等(nmol-μmol)合成规模下，这种eos过程将比cos具有10x-100x成本优势。
8、本公开证明了这种独特的dna合成方法的可行性，该方法使用一组第一代dna合成酶，该酶具有将单个核苷酸掺入至单链寡核苷酸末端的能力。
9、随着合成dna应用的快速增长，该领域的商业机会是巨大的。2018年，全球寡核苷酸合成市场规模为$4.3b，并且预期将以10-12.5％的复合年均增长率(cagr)增长，至2025年将达到>$80亿(2018年全球寡核苷酸合成市场规模)。合成dna的主要应用包括分子和合成生物学r&d、基因组学(靶标富集)、治疗学、诊断学(dna微阵列、pcr和fish)、crispr/cas9系统、纳米技术和新兴技术，诸如基于dna的数据存储和dna计算(2018年全球寡核苷酸合成市场规模，lee 2018，jensen 2018，lee 2019)。
10、本公开描述了新型酶促寡核苷酸合成路线，其使用具有自由或未封闭的3'羟基基团的核苷三磷酸作为底物，下文称为“未封闭的核苷三磷酸”。迄今为止，已经描述的具有tidp活性的dna聚合酶在体外与三磷酸盐一起反应时，通常显示核苷酸进行性添加至单链寡核苷酸或多核苷酸末端。本公开描述了当与未封闭的核苷三磷酸一起使用时，具有将单个核苷酸添加至寡核苷酸的3'末端能力的dna聚合酶。
11、本公开确定地根源于已知的dna聚合酶机制。简言之，已知所有dna聚合酶均经历六个关键机制步骤(bberdis 2009,beard 2014,berdis 2014)：1)聚合酶与dna底物结合；2)与核苷三磷酸形成初始三元络合物；3)构象变化导致产生三元底物络合物；4)催化作用导致化学后产物三元络合物；5)构象变化导致产物(ppi)释放，和6)聚合酶易位以为下一轮核苷酸添加或聚合酶从dna底物解离做准备。这些机制步骤中的各种步骤由聚合酶的不同结构域介导(kaminsky 2020)。
12、已知聚合酶易位与特定dna聚合酶序列和结构域有关(samkurashvili1996,rechkoblit 2006,golosov 2010,dahl 2014,ren 2016,yang 2018,hoitsma 2020)，并且已报道具有与其底物的解离速率差异很大的聚合酶(andrade 2009,zahn 2011)。已经在影响易位速率的dna和rna聚合酶中识别突变(samkurashvili 1996,dahl 2014,ren 2016)，并且聚合酶易位与在dna和rna聚合酶中发现的特定结构域和序列基序有关(samkurashvili1996,rechkoblit 2006,golosov 2010,dahl 2014,hoitsma 2020)。因此，能够开发添加单个未封闭的核苷酸但由于无法易位而不能添加其他核苷酸的核酸聚合酶。
13、核酸聚合酶分为不同类别，一个类别中的聚合酶表现出特定序列或特性，将其与另一个类别的聚合酶区分。例如，dna聚合酶被分类为家族a、b、c、d、x、y和rt(bebenek2002,ramadan 2004,jarosz 2007,guo 2009,uchiyama 2009,yamtich 2010,berdis2014,maxwell 2014,moon 2014,trakselis 2014,yang 2014,vaisman 2017,yang 2018,hoitsma 2020,kazlauskas 2020)。不同家族中的聚合酶在核酸复制、修复和重组方面具有不同生物学功能。来自不同家族的纯化的聚合酶通常在体外具有一系列不同的活性，如以上所列参考文献中所举例说明的。
14、还已知核酸聚合酶在使核酸聚合中表现出强序列特异性或对特定序列的偏好。在使核酸聚合时，核酸聚合酶还已表现出碱基特异性(fiala 2007,hoitsma 2020)。
15、基于dna聚合酶的已知性质，有各种潜在的方式可以实现将单个核苷酸添加至单链核酸分子的3'末端，而没有进行性添加多个核苷酸的风险，包括但不限于：1)使用对经修饰的核酸分子的3'末端序列具有高序列特异性的聚合酶；根据聚合酶掺入特定类型核苷酸(即a、c、g、t、u或i)的偏好，该末端序列特异性可以与碱基特异性偶联，或可以不与碱基特性偶联；2)使用在核苷酸添加(上述步骤6)后不能易位并且在核苷酸添加后保持与核酸分子的3'末端缔合的的dna聚合酶；3)其组合；和4)使tidp非进行性地作用于核酸底物并且仅以不依赖模板的方式添加单个未封闭的核苷酸的其他机制。
技术实现思路
1、本公开描述了酶促从头合成核酸的新方法，其涉及通过不依赖模板的核酸聚合酶(tinap)将单个核苷酸添加至核酸底物，而不使用核苷三磷酸单体上的3'封闭基团。本公开还描述了能够以不依赖模板的方式将单个核苷酸添加至核酸的3'末端的酶。该出乎意料的发现与已知和认为dna聚合酶起作用的渐进方式相矛盾。因此，发现这种酶或其修饰的衍生物在eos过程的开发中具有效用，该eos过程需要将核苷酸受控添加至核酸的3'末端，一次一个核苷酸。本公开描述了这种酶在用于合成用于工业、医学、诊断、农业和/或r&d用途的核酸的方法中的用途。
1.一种合成期望的核酸的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸底物是rna。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸底物是dna。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸底物是包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的嵌合核酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，合成的核酸是rna。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，合成的核酸是dna。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，合成的核酸是包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的嵌合分子。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述核酸聚合酶是rna聚合酶。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述核酸聚合酶是dna聚合酶。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述核酸聚合酶是x家族dna聚合酶。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述核酸聚合酶是y家族dna聚合酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述核酸底物被固定化在固体载体上。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，在仅将单个核苷酸添加至所述核酸底物时，所述不依赖模板的核酸聚合酶具有36-100％有效性。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，在仅将单个核苷酸添加至所述核酸底物时，所述不依赖模板的核酸聚合酶具有60-100％有效性。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，在仅将单个核苷酸添加至所述核酸底物时，所述不依赖模板的核酸聚合酶具有80-100％有效性。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，在仅将单个核苷酸添加至所述核酸底物时，所述不依赖模板的核酸聚合酶具有90-100％有效性。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，在仅将单个核苷酸添加至所述核酸底物时，所述不依赖模板的核酸聚合酶具有100％有效性。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，相对于核酸底物末端，存在摩尔过量的不依赖模板的核酸聚合酶。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，存在等摩尔量的不依赖模板的核酸聚合酶和核酸底物末端。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，相对于不依赖模板的核酸聚合酶，存在摩尔过量的核酸底物末端。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，在(d)中使用的所述至少一种不依赖模板的核酸聚合酶不同于在步骤(a)中使用的所述至少一种不依赖模板的核酸。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，所述至少一种不依赖模板的核酸聚合酶被固定化在固体支持物上。
