本发明大致涉及癌症抗原。
背景技术：
1、人内源逆转录病毒(hervs)人内源逆转录病毒，在基因组中有许多拷贝，大约8％的人基因组具有逆转录病毒来源。参考lander et al.nature.409,860-921(2001).逆转录病毒通常会由于累计的基因突变而失去感染性。除了在特定的病理情况(如，癌症)下，这些基因在正常成人组织中在多数情况下是沉默的或不表达的。
2、最具生物活性的herv是herv-k家族成员。herv-k具有能表达具有复制能力的逆转录病毒所需的所有元件的完整序列，但能在正常细胞中保持沉默。参考larsson,kato,&cohen,当前主题的微生物学和免疫学杂志,148,115-132(1989)及ono,yasunaga,miyata,
3、&ushikubo,病毒学杂志,60,589-598(1986).发明人和其他人已经报导了，有些时候，例如在肿瘤中，herv-k的表达被激活，并且其膜蛋白可以在几种不同类型的肿瘤中以比正常组织中高得多的水平检测到。参见国际专利公开wo 2010/138803(得克萨斯大学体系董事会)、wang-johanning et al.,癌症研究杂志,77,abstract nr lb-221(2017)、johanning et al.,人内源性逆转录病毒-k的表达与基底样乳腺癌症表型密切相关.科学报告杂志,7,41960(2017)及li et al.,临床癌症研究杂志(2017)。这种关联说明了herv-k可以是很好的肿瘤相关抗原和癌症免疫治疗的理想靶点。herv-k在肿瘤中表达而不存在于正常组织中，这使得脱靶效应得以最小化。
4、开发癌症治疗剂的一个重要考虑因素是肿瘤相关抗原的表达谱。herv-k在癌症组织和细胞系中是具有转录活性的。发明人鉴定了肿瘤细胞系和患者肿瘤中的herv蛋白与序列。发明人观察到在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌中和其他实体瘤中herv特别是herv-k序列的表达。他们也发现了herv-k env转录本在乳腺癌中的表达与基底乳腺癌，一种侵袭性高的亚型，高度相关(johanning et al.,人内源性逆转录病毒-k的表达与基底样乳腺癌症表型密切相关.科学报告杂志,7,41960(2017))。
5、多种诊断产品可作为伴随诊断供患者选择。一种策略靶向仅存在于癌细胞而非正常组织上的内源病毒抗原。发明人团队发现herv-k rna(env或gag)和抗herv-k抗体出现在癌症患者的循环中。
6、加深对乳腺癌肿瘤微环境的了解对于设计合理有效的治疗方法非常重要。限制针对实体瘤的成功治疗的一个问题是缺少在肿瘤细胞中高表达而在正常细胞中不表达的肿瘤抗原。在发明人之前的工作中，他们表明herv-k env蛋白通常在乳腺癌细胞表面表达。参考wang-johanning et al.,国家癌症研究所杂志,104,189-210(2012).上皮间质转化(emt)在一些肿瘤中降低cd4或cd8 t细胞的浸润(chae et al.,科学报道杂志,8,2918(2018).)。herv-k表达被证明可诱导emt，导致细胞运动性增加，这两者都有利于肿瘤散播。参考see lemaitre et al.,plos病原体杂志,13,e1006451(2017)。herv-k的过度表达会导致癌症产生并促进癌症进展提供了强力证据。
技术实现思路
1、发明人发现血浆和肿瘤浸润淋巴细胞(til)中检查点分子水平与herv-k抗体滴度高度相关，特别是侵袭性乳腺癌患者，例如，患有浸润性导管癌(idc)和浸润性乳腺癌(imc)的患者中。乳腺癌中肿瘤浸润淋巴细胞的表型和功能特征与herv-k状态相关，而且检查点抑制和herv-k抗体治疗相结合可以产生更好的杀伤功效。
2、在第一个实施方案中，本发明提供了治疗性人源化抗herv-k抗体。本发明也提供了融合的治疗性人源化herv-k抗体，针对cd3和cd8双特异性t细胞衔接器(bite)，一个dna编码的bite(dbite)，或者一个抗体-药物缀合物(adc)。过表达herv-k的癌细胞可以是本发明的抗herv-k人源化抗体和抗体-药物缀合物的良好靶标和良好模型，因为每个细胞可以结合更多抗体。
3、在第二个实施方案中，本发明提供由细菌产生的人源化抗体克隆(hum1)。本发明也提供了由哺乳动物细胞产生的人源化抗体(hu6h5)。这些抗体都能结合从来自重组herv-k env表面融合蛋白(ksu)和mda-mb-231乳腺癌细胞的裂解物产生的抗原。将哺乳动物细胞产生的hu6h5与我们的其他形式的抗herv-k抗体进行比较。hu6h5与herv-k抗原的结合亲和力类似于鼠抗体(m6h5)、嵌合抗体(cab)或人源化抗体(hum1)。hu6h5抗体诱导癌症细胞发生凋亡，抑制癌细胞增殖，并杀伤表达herv-k抗原的癌细胞。在小鼠mda-mb-231异种移植物中证明hu6h5抗体减少肿瘤存活力，并能显著减少癌细胞向肺和淋巴结的转移。与未接受抗体治疗的对照小鼠相比，用这些人源化抗体治疗的携带人类乳腺癌肿瘤的小鼠的存活时间更长。
4、在第三个实施方案中，本发明提供从乳腺癌患者生成的herv-k env基因，其作为能诱导癌细胞增殖、肿瘤生长和向肺和淋巴结转移的原癌基因。表达herv-k的细胞显示出包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶9、prb、sirt-1和cidea在内的与肿瘤抑制相关的基因的表达减少。表达herv-k的细胞显示出包括ras、p-erk、p-p-38和β连环蛋白在内的与肿瘤形成相关的基因的表达增加。
5、在第四个实施方案中，本发明提供针对t细胞cd3或cd8和肿瘤相关抗原herv-k的bites。发明人生产此类bite，其包含靶向cd3或cd8的抗体和靶向herv-k的抗体(vl-vh6h5scfv---vh-vlhucd3或cd8+c-myc+flag)或(vl-vh hu6h5scfv---vh-vlhucd3或hucd8+c-myc+flag)。flag标签是被抗体识别的肽(dykddddk)(seq id no:38)，和myc标签是被抗体识别的短肽(eqkliseedl)(seq id no:39)。
6、在第五个实施方案中，本发明提供表达慢病毒car表达载体的t细胞，该表达载体携带人源化或全人herv-k scfv。如附图1所示，这些t细胞可有效裂解并杀死多种癌症的肿瘤细胞。慢病毒载体表达的人源化k-cars是泛癌种car-ts。
7、在第六个实施方案中，本发明提供人源化单链可变片段(scfv)抗体。该抗体能结合从重组herv-k env表面融合蛋白(ksu)和来自mda-mb-231乳腺癌细胞的裂解物产生的抗原。可将由该人源化scfv产生的car克隆入慢病毒载体。该重组载体可与疗法组合使用，这些疗法包括但不限于k-car t细胞加检查点抑制剂、促炎细胞因子如白介素il-12和il-18、溶瘤病毒和激酶抑制剂。激酶抑制剂包括但不限于p-rsk和p-erk。
8、在第七个实施方案中，本发明提供在许多情况下与血浆肿瘤标志物ck的染色重叠的herv-k染色。herv-k可以是ctc标志物以及herv-k抗体疗法的靶标。
9、在第八个实施方案中，本发明提供作为干细胞标志物的herv-k。靶向herv-k可通过减慢或阻止癌症干细胞的生长来阻断肿瘤进展。用循环治疗性抗体或其他疗法靶向herv-k也可以杀伤ctcs并阻止这些循环细胞转移到远端位点。
10、在第九个实施方案中，本发明提供用药剂增强herv-k过表达促使癌细胞增加靶标的产生使癌细胞对靶向疗法更敏感以包括靶向免疫疗法，所述药剂通过先天性免疫应答(如poly i:c处理)或ltr低甲基化(如通过5-aza)诱导herv-k表达。
11、在第十个实施方案中，本发明改良了在scid/beige小鼠中的体内富集技术(ive：增强约20倍)，这允许快速扩增和b细胞激活。该改良技术可产生许多抗原特异性浆母细胞。对于携带具有更高抗体滴度的癌症的供体，该改良技术使用用人源化小鼠(hm)或人肿瘤小鼠(htm)代替标准的scid/beige小鼠的方案。对于没有癌症和没有记忆b细胞的正常供体，该改良技术使用经过修改的方案：用细胞因子混合物(cytokine cocktail)在第1、7和14天处理小鼠，并在第14和21天用抗原加强小鼠。从小鼠收集血清并通过elisa测试结合亲和力。在检测到抗体滴度增加后，采集、分析脾脏并用其制备杂交瘤。在使用体内富集方案的小鼠中检测到更高的抗体滴度。
12、在第十一个实施方案中，本发明提供确定不仅产生抗体还能结合抗原并杀伤癌细胞的细胞的方法。该方法可有效刺激并扩增cd40-b细胞以高纯度(>90％)至大数并诱导其抗体的分泌。
13、在第十二个实施方案中，本发明提供处理的b细胞的后孵育方法。洗涤盖玻片并用荧光抗人igg抗体标记，再使用微雕刻技术阅读以揭示对应于单个b细胞分泌的抗原特异性抗体的离散点。
14、在第十三个实施方案中，本发明提供平台的开发以确定微孔板中每个细胞的结合动力学和细胞与细胞相互作用。
15、在第十四个实施方案中，本发明引人注目地提供显著增强乳腺癌患者的血浆中的六种循环免疫检查点蛋白的表达。本发明还提供患者在手术后6个月或18个月相比于手术前免疫检查点蛋白水平的显著降低。可溶免疫检查点蛋白分子水平与肿瘤中herv-k表达诱导的herv-k抗体滴度发生正相关。herv-k抗体滴度可影响乳腺癌中免疫检查点蛋白水平。因此，herv-k的表达可控制乳腺癌患者的免疫应答。
16、在另一方面，这些发现共同表明herv-k的免疫抑制结构域(isd)是癌细胞上尚未被识别的免疫检查点，类似于pd-l1免疫检查点。在第十五个实施方案中，本发明提供通过herv-k的免疫检查点阻断isd，包括但不限于靶向herv-k的isd的单克隆抗体和药物。是癌症免疫调节剂疗法，其允许t细胞继续工作并释放针对癌症的免疫应答并增强现有应答，以促进消除癌细胞。
17、在第十六个实施方案中，本发明提供靶向herv-k的人源化和全人(htab)抗体。这些抗体增强检查点阻断性抗体的治疗功效。有效的组合癌症疗法包括但不限于以下的组合：
18、(a)herv-k人源化或htab(1.5mg/kg)、(b)k-car、(c)k-biate、(d)herv-k shrna或crispr/cas9基因组编辑技术以敲低herv-k基因表达、(e)或预防性或治疗性herv-k疫苗，该疫苗包括全长和截短的herv-k env蛋白和herv-k env肽。有效的组合癌症疗法包括与包括但不限于以下因素组合的全长和截短的herv-kenv蛋白和herv-k env肽：(a)抗icp抗体，(b)癌症化疗，(c)5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷或其他表观遗传调节剂，如dna甲基转移酶抑制剂(dnmti)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(hdaci)，(d)emt抑制剂，(e)细胞迁移或侵袭的抑制剂、(f)诱导s或g2期细胞周期阻滞、(g)pi3k/akt/mtor或mapk/erk信号传导途径的抑制剂，或(f)信号转导至hif1α。
19、在第十七个实施方案中，本发明提供靶向herv-k的人源化抗体，其可用于递送药物进入癌细胞和肿瘤的抗体-药物缀合物。
20、在第十八个实施方案中，本发明提供可用于肿瘤成像的靶向herv-k的抗体。
21、在第十九个实施方案中，本发明提供使用hu6h5 scfv的新car。
22、在第二十个实施方案中，本发明提供使用hu6h5 scfv的新bite，其包括cd3bites和cd8bites。
1.一种分离的 herv-k 拮抗剂抗体，其与人内源性逆转录病毒-k (herv-k) 包膜蛋白结合，其包含：
2.根据权利要求1所述的抗体，进一步包括从以下组中选取的接近cdr边界的序列：vrqapgkglew (seq id no: 46)和lqmnslraedtavyyc (seq id no: 47)。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是hum1抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是hu6h5抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体，其用于减少肿瘤生长。
6.根据权利要求1的抗体，其用于减少肺部、淋巴结或其他器官的转移。
7.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1所述的hcvr、lcvr或其组合的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.一种用权利要求8所述的表达载体转化的宿主细胞。
10.一种治疗哺乳动物中癌症的方法，其包括向有此需要的哺乳动物施用有效量的根据权利要求1所述的抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体经由接头与细胞毒性药物、澳瑞他汀或功能性肽类似物或其衍生物缀合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、睾丸癌、胃癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫癌、膀胱癌、前列腺癌、食管癌、肝癌和非小细胞肺癌。
13.一种人源化抗体，其用于car t、car nk或bite测定。
14.一种人源化抗体，其用于car t、car nk或bite测定中，其中所述测定用于开发cart、car nk或bite。
15.一种结合人cd3 t细胞或cd8 t细胞的分离的抗体，包含：
16.一种bite，包含针对cd3或cd8t细胞的抗体；和一种人源化scfv 抗体，针对肿瘤相关抗原herv-k。
17.一种t细胞表达慢病毒car载体，携带人源化或全人源herv-k scfv。
18.一种人源化单链可变片段(scfv)抗体，其能够结合来自herv-k env表面融合蛋白(ksu)和癌细胞裂解herv-k env蛋白的抗原。
19.一种car,来自权利要求18所述的人源化herv-k scfv。
20.一种用herv-k的免疫检查点抑制剂阻断免疫抑制结构域(isd)的方法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述herv-k的免疫检查点抑制剂选自单克隆抗体和靶向herv-k的isd药物。
