本发明涉及增强dna酶促生产的新型核苷酸复合物。所述核苷酸复合物包括二价阳离子，其以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在，而几乎不含一价离子(除了来自任何溶剂的氢或水合氢离子之外)。所述核苷酸复合物对于脱氧核糖核酸(dna)的合成、特别是dna的无细胞酶促合成、优选大规模或工业规模具有期望的性质，能够改进产率和/或改进效率。此外，本发明包括制备所述核苷酸复合物的改进方法。该方法产生独特的核苷酸复合物，其中该复合物仅用二价阳离子以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例进行反离子化。来自起始物质的所有提供一价阳离子的实体基本上都被去除。还公开了另外的复合物，其在较高浓度下具有加速dna合成的独特性质，这些复合物还含有两性离子分子。
背景技术：
1、脱氧核糖核酸(dna)的扩增可以通过使用基于细胞的方法来进行，例如通过在发酵罐中培养产生待扩增的dna的细菌。还描述了从起始模板扩增dna的无细胞酶促方法，包括聚合酶链式反应和链置换反应。
2、过去，使用基于微量滴定板和机器人控制的移液器的设备根据需要添加反应组分，来进行测试规模的dna扩增。此类设备和方法适合制备少量的用于测试目的的dna，但不能为其他目的提供足够的量。特定核酸和蛋白的大规模扩增和制备大多是通过基于细胞的方法进行。此类方法通常对于生产极大体积的产物是有效的，但是生产成本很高。此外，对于临床和治疗目的，优选在无细胞环境中合成dna。对于使用本领域常规方法例如发酵来扩增质粒，商业规模的生产可能能够制备2.6g/l。这被本领域技术人员认为是“工业规模”的。
3、迄今为止，诸如聚合酶之类的生物催化剂尚未常规用于dna产品的体外工业规模生产，并且反应主要限于微升量级的体积。对使用dna酶促合成的方法进行的放大已被证明存在问题，尤其是dna产物的产率令人失望。
4、本技术人先前已经使用可商购的核苷酸解决了放大的能力。如wo2016/034849中所述，开发了一种新方法，该方法包括随着核苷酸耗尽或产物浓度达到阈值而向反应混合物中添加新的核苷酸，该文献通过引用并入本文。但是，已经明确了有可能实现甚至更高的产率，并且发明人已经开发了与二价阳离子和一价阳离子的混合物相关的核苷酸复合物(pct/gb2021/050366)。本技术包括对核苷酸复合物的进一步改进。
5、酶促dna合成通常需要使用聚合酶或聚合酶样酶来催化将核苷酸添加至新生核酸链。通常，需要在反应中扩增的模板dna。但是，也可以进行从头发生整合的无模板dna合成。
6、重要的是，注意到由于核酸的高带电性质，它们经常被反离子包围以中和其大部分电荷，而这减少了序列各部分之间的静电排斥，使得它们能够在细胞中缩合成整齐而紧凑的结构。核酸的构建部件(核苷酸)也是离子性物质，需要阳反离子的存在来保持电荷中性。因此，大多数(如果不是全部)核苷酸以具有阳反离子(positive counter-ion)的盐的形式提供。如果没有来自盐的阳反离子，核苷酸会以其游离酸形式呈现，在该形式中电荷中性通过氢离子保持。由于核苷酸具有四个负电荷，因此通常用2个二价阳离子或4个一价阳离子制备盐。对于本领域技术人员显而易见的是，一旦核苷酸(盐或酸)分散在水或其他溶剂中，它们就可以在溶液中解离成阴离子和阳离子组分。
7、通常，以锂盐或钠盐的形式提供核苷酸用于dna合成、扩增或测序。通常优选锂，因为这些盐比钠盐具有更大的溶解度以及对反复冻融循环的稳定性，并且由于锂对各种微生物的抑菌活性而保持无菌，从而提供了更高的可靠性和更长的保存期。这些盐的使用是如此常规，以至于本领域技术人员似乎并不对与核苷酸一起存在的反离子提出疑问。实际上，在wo2016/034849的实施例中使用的所有核苷酸都是核苷酸的锂盐，因为这些是作为本领域技术人员的最佳选择而销售的。仅以二价阳离子如镁离子的盐形式提供的核苷酸是高度优选的，因为在酶促dna合成过程中同样需要它们作为辅因子。不幸的是，以镁盐形式提供的核苷酸是高度不溶的，这限制了它们的使用。相比之下，镁通常以氯化物盐的形式单独提供给反应，并与利用一价阳离子物质反离子化的核苷酸组合。
8、本发明人先前已经发现，作为反离子存在于核苷酸盐中的阳离子物质对于高产率酶促dna合成反应的产率、效率和准确度至关重要，如wo2020/035698和wo2021/161051(pct/gb2021/050366)详述，这些文献通过引用并入本文。
9、本发明人已经开发了新型核苷酸复合物的新家族，其可以是粉末化的或可以是在溶液中。所述核苷酸复合物具有一个重要特征，即以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在至少一种二价阳离子。最简单地，所述新型核苷酸复合物仅包含以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子，并且不存在对复合物进行反离子化的其他阳离子。技术人员将理解，潜在存在于任何溶剂中的离子(例如存在于水中的氢和水合氢离子)排除在该阳离子定义之外。可以向该最简单的核苷酸复合物添加另外的实体，例如两性离子分子。发明人已经证明了包含二价阳离子和两性离子的混合物的核苷酸复合物具有非常快速地产生大量dna的特别用途。
10、本发明人现已开发了一种增加dna合成反应的最大可耐受起始核苷酸浓度的方法，该方法更进一步地通过使用从被二价和一价阳离子的混合物有效反离子化的核苷酸复合物中去除来自一价阳离子的多原子部分的过程，或者通过从仅与一价阳离子结合的核苷酸复合物中去除一价实体，然后合并仅与二价阳离子结合的核苷酸复合物来启动该方法。所述方法的起始物质可以有效地是混合的反离子核苷酸复合物，如wo2021/161051(pct/gb2021/050366)中所述，其中一价阳离子是多原子的并且多原子实体在合适的条件例如真空下变得具有挥发性(rendered volatile)。
11、起始物质还可以是单一反离子核苷酸复合物，如wo2020/035698中所述，例如包含4个铵离子。使用该起始物质，可以在去除一价实体后添加二价反离子化核苷酸复合物。一价阳离子是多原子的并且多原子部分可以在合适的条件例如真空下变得具有挥发性。
12、任一方法都可进一步允许在去除一价阳离子的多原子部分之前、期间或之后添加两性离子分子。
13、使用本发明的方法，发明人发现可以以允许不使用缓冲剂而将干燥的核苷酸复合物重悬在溶剂中的方式，进一步从核苷酸复合物中去除“一价阳离子”。这是完全出乎意料的，最值得注意的是，这是在已知具有二价阳离子例如镁的核苷酸盐是难溶的情况下。净效应是与wo2021/161051(pct/gb2021/050366)中所述相比甚至进一步减少了存在的一价阳离子的量。这很重要，因为发明人推定一价阳离子在大浓度下对dna合成具有抑制作用。无论阳离子的来源(核苷酸、缓冲液成分等)如何，一价阳离子的这种抑制作用都可发生。此外，通过还提供二价阳离子作为核苷酸的反离子，特别是在镁、锰或钙的情况下，这还可以有效地提供合成酶所需的辅因子。因此，不需要再提供进一步的或另外的二价阳离子。由于镁或锰通常以盐的形式(包括一个或多个阴离子上的两个负电荷)添加到反应中，因此，将它们作为核苷酸的反离子包含在内本质上会减少存在的阴离子量。这种减少可有利于下游dna加工酶，因为在合成反应结束时，需要更少的步骤来准备用于进一步加工的dna。
14、此外，发明人在实施例中令人惊讶地证明，向本发明的新型核苷酸复合物添加另外的分子，例如两性离子，提供了具有改变的dna合成特性的另外的新型核苷酸复合物。这些复合物似乎特别有利于加速dna合成速度，特别是在起始浓度高于100mm时。
15、实施例中显示的数据表明，所述新型核苷酸复合物在产率和效率方面的表现优于先前制备的核苷酸复合物，特别是在远远更高的核苷酸实体浓度(特别是大于60mm并且甚至大于100mm)情况下。值得注意的是，dna用作生产大量rna(尤其是mrna)的模板，因此以商业规模生产dna对于例如rna疫苗的大量生产至关重要。因此，目前对工业规模的清洁、高效dna生产的需求呈指数级增长。使用本发明生产的dna可以用作生产sars-cov-2mrna疫苗等的模板。所述dna可用于制备病毒颗粒，例如慢病毒和腺相关病毒。
技术实现思路
0、发明概述
1、本发明涉及新颖的核苷酸复合物，其全部需要以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子的存在。实际上，不存在或提供其他阳离子用于对核苷酸进行“反离子化(counter-ion)”。
2、这些二价阳离子优选是二价金属阳离子，任选地是镁、锰或钙中的一种或多种。二价阳离子可以是单一离子(例如镁)或离子混合物(例如镁和钙)。
3、在最简单的核苷酸复合物中，所述新型核苷酸复合物包含以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子，并且基本上不存在对复合物进行反离子化的其他阳离子。
4、技术人员将理解，在任何溶剂中天然存在的离子(例如水中存在的氢和水合氢离子)排除在该阳离子定义之外。
5、可以向该最简单的核苷酸复合物添加另外的实体，例如两性离子分子。发明人已经证明，包含二价阳离子和两性离子的混合物的核苷酸复合物具有非常快速地产生大量dna的特别用途。
6、本发明涉及一种核苷酸复合物，其包含与以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0-4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合的核苷酸。因此，两性离子分子的存在是任选的。
7、本发明涉及一种核苷酸复合物，其包含与以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子结合并且任选地还与以每个核苷酸小于或等于4个两性离子分子的量存在的两性离子分子结合的核苷酸。
8、本发明涉及至少一种用于制备新型核苷酸复合物的方法，其中先前描述的核苷酸复合物(例如wo2021/161051中的那些)经过干燥，以有效地进一步减少起始物中包含的一价阳离子的挥发性碱。当被选择用于起始物质的一价阳离子是多原子的并且在合适的条件例如真空下变得具有挥发性时，就会发生这个过程。干燥或蒸发步骤后的核苷酸复合物可以是部分或完全干燥，例如大部分或全部溶剂可已被去除。因此，应当理解，起始核苷酸复合物可以在溶液中。该过程的起始物质可以简单地是与二价阳离子结合的核苷酸复合物和与多原子一价阳离子结合的核苷酸复合物的混合物。
9、本发明允许与所述二价阳离子结合的核苷酸和与所述多原子一价阳离子结合的核苷酸在任何适当的点混合；这可以是在多原子部分被去除之前、去除期间或去除之后。所述多原子部分的去除是通过使其在合适的条件下变得具有挥发性来进行的。
10、本发明的方法可以被认为是“干燥”或“蒸发”，特别是如果起始核苷酸复合物或第二核苷酸复合物在溶液中。
11、与目前的方法相比，干燥过程和随后的重悬可以增强dna的生产，即增加的或更大的产率、更高效的过程或在具有比在当前方法下认为可能的更少的额外组分的环境中进行酶促dna合成的能力。这显著提高了生产力，同时降低了合成dna的成本，尤其是大规模合成时。特别地，此类核苷酸复合物显示出适合在特别高的核苷酸起始浓度下使用，例如60mm或甚至100mm及以上。
12、为了在工业规模上实现高产率，有必要利用高浓度的dna“构建部件”，即核苷酸(特别是dntp)。整体上，发明人已经发现，仅改变反应条件的参数不会明显增加酶促反应的产率以使其适合工业目的。
13、鉴于向酶促反应提供的核苷酸是盐的形式，增加核苷酸的量会导致反应混合物的离子强度显著增加。离子强度随存在的所有离子的浓度而变化。这是一个重要的考虑因素，因为催化dna合成反应的酶是蛋白，增加的离子强度会导致蛋白解折叠，从而使酶活性失活。
14、此外，可以认为盐的存在也会影响反应混合物的ph。根据组分离子的酸碱性质，盐可以溶解在水中以产生中性溶液(强酸/强碱)、碱性溶液(弱酸/强碱)或酸性溶液(强酸/弱碱)。因此，通过在反应混合物中增加核苷酸盐或任何其他盐的浓度(例如氯化镁)，这也可能影响ph并进一步限制存在的任何缓冲剂的ph稳定性能。因此，例如，添加更高浓度的核苷酸盐可能导致次佳的ph控制，这会在降低dna产率或不利影响dna合成准确性方面显著影响酶促dna合成。因此，关于酶促dna制造的“放大”有许多要考虑的因素，而本发明人已经设计了提高产率而不对dna合成反应产生不利影响的方法。
15、不希望受理论的束缚，发明人推定核苷酸复合物上的磷酸盐基团可以在溶液中提供一些缓冲能力。此外，随着dna合成反应的进行，由于磷酸盐从核苷酸复合物中释放，反应可能会自我缓冲(self-buffer)。所进行的测量表明，尽管在制备核苷酸复合物后ph值降低，但ph值的降低并没有预期的那么多，可能是由于挥发性部分被去除后核苷酸发生质子化。
16、因此，本发明涉及通过将先前描述的核苷酸复合物进行干燥过程，任选地干燥至没有溶剂残留的程度，以进一步改进所述核苷酸复合物的方法。用于制备本发明的核苷酸复合物的起始物质可以是混合的反离子核苷酸复合物，例如wo2021/161051(pct/gb2021/050366)中描述的那些。这可以包括二价阳离子和多原子一价阳离子的存在，所述多原子一价阳离子在合适的条件例如真空下变得具有挥发性。所述起始物质可以是单一反离子核苷酸复合物或盐，如wo2020/035698中所述。
17、本发明涉及一种制备核苷酸复合物的方法，包括对起始核苷酸复合物施加热和/或真空的步骤，其中所述起始核苷酸复合物包含与多原子一价阳离子结合的核苷酸，其中所述多原子部分在热和/或真空下变得具有挥发性。
18、本发明涉及一种制备核苷酸复合物的方法，包括蒸发起始核苷酸复合物中存在的多原子部分的步骤，其中所述起始核苷酸复合物包含与多原子一价阳离子结合的核苷酸。
19、本发明的任何方面的起始核苷酸复合物还可以包含二价阳离子。或者，可以在进行所述方法之前或之后将包含与二价阳离子结合的核苷酸的核苷酸复合物添加到起始物质中。
20、或者，所述多原子部分可以被描述为“可挥发的(volatisable)”。
21、换言之，本发明提供：
22、一种制备核苷酸复合物的方法，所述方法包括：
23、(i)提供起始核苷酸复合物，其包含与多原子一价阳离子结合的核苷酸，其中所述阳离子的多原子部分是可挥发的；
24、(ii)对起始核苷酸复合物施加热、真空和/或ph变化中的任何一种或多种，以使一部分多原子部分能够气化；和
25、(iii)在步骤(ii)之前、期间或之后，将起始核苷酸复合物与第二核苷酸复合物混合，所述第二核苷酸复合物包含与二价阳离子结合的核苷酸。
26、所述多原子部分是可挥发的。这意味着它们在适当的条件下可以变得具有挥发性，但在正常/标准条件下通常没有挥发性。合适的条件可以是施加热、真空和/或改变核苷酸复合物的ph。可以改变ph以增加或降低ph，优选增加ph。
27、所述方法还可包括：
28、(iv)在步骤(ii)之前、期间或之后，将起始核苷酸混合物与两性离子分子混合。
29、起始核苷酸复合物可以是与多原子一价阳离子结合的核苷酸，该多原子一价阳离子以每个核苷酸0.2至4个多原子一价阳离子的比例存在，任选地以0.5至3之间、1至2之间、或其间的任何比例。所述阳离子可以是单一种类的多原子一价阳离子，或者它可以是不同种类的混合物。
30、第二核苷酸复合物可以是与二价阳离子结合的核苷酸，该二价阳离子以每个核苷酸0.2至4个二价阳离子的比例存在，任选地以0.5至3之间、1至2之间、或其间的任何比例。所述阳离子可以是单一种类的二价阳离子，或者它可以是不同种类的混合物。
31、本发明涉及通过蒸发起始核苷酸复合物中存在的多原子部分来制备核苷酸复合物的方法，其中所述起始核苷酸复合物结合每个核苷酸0.2至2个二价阳离子和0.2至2.5个多原子一价离子。
32、所述新型核苷酸复合物可以按本发明任何方法制备的形式使用。或者，在蒸发多原子部分的过程之前或之后，可以向所述新型核苷酸复合物提供至少一种两性离子分子。此外，本发明还涉及使用核苷酸转移酶(nucleotidyltransferase)和本发明制备的任何核苷酸复合物的酶促dna合成，例如聚合酶或其他dna合成酶，其中任何一种都可以任选地被工程化以赋予其特定性质。
33、本发明可涉及从核酸模板进行dna合成或在没有模板的情况下从头合成dna，这取决于所使用的核苷酸转移酶。
34、本发明可涉及合成dna的等温方法，其不需要在扩增期间通过加热和冷却来循环温度，但是可以允许使用热在一开始将模板变性(如果模板存在的话)。本发明优选涉及独立地或在其他酶的帮助下通过链置换复制能够复制核酸模板的聚合酶的用途。
35、本发明的方法涉及起始物质(起始核苷酸复合物)和任选的第二核苷酸复合物的使用，所述核苷酸复合物是具有结合的离子的复合物形式的核苷酸，所述结合的离子在本文中也可称为反离子(counter-ion)。所述核苷酸复合物通常存在于溶液中，因此结合的反离子可分散在溶液中或可不分散在溶液中。由于其制备的性质，反离子可以有效地在核苷酸之间“共享”，使得反离子与核苷酸的比例可以不是整数。在具有所述核苷酸的溶液中，离子物质是二价反离子和多原子一价反离子，使得每个核苷酸的部分或完全电荷平衡是由一价和二价阳离子的混合物贡献的。该提供可以使得复合物是电荷中性的，或者可以具有净负电荷。所述起始核苷酸复合物可以在溶液中提供，或者可以通过将固体核苷酸复合物添加至溶液中而分散在溶液中。
36、或者，起始复合物可以是仅与一价阳离子结合的核苷酸，其在所述过程中与仅与二价阳离子结合的核苷酸混合。由于其制备的性质，反离子可以在核苷酸之间有效地“共享”，使得反离子与核苷酸的比例可以不是整数。
37、起始核苷酸复合物在溶液中，并且包含与至少两种不同的阳反离子(阳离子)结合的核苷酸(本文中也描述为核苷酸离子或离子种类)。优选的是，这些反离子之一是多原子一价阳离子，即其由于失去一个电子而具有单个正电荷。一价阳离子的多原子部分应当能够在合适的条件下例如在真空下变为挥发性的。它是可挥发的或可挥发性的。应当理解，在常温常压(ntp为20℃和1atm)下，多原子一价阳离子的多原子部分优选是基本上不挥发的，并且应用合适的条件以使该部分变得具有挥发性。优选的是，起始核苷酸复合物中的这些反离子之一是二价阳离子，即其由于失去两个电子而具有双正电荷。为了避免疑问，这些二价反离子在本发明的方法期间没有损失、去除或蒸发。或者，可以在所述过程期间通过以与二价阳离子结合的核苷酸复合物的形式添加来提供二价反离子。
38、所述起始核苷酸可以以具有多原子一价和二价阳离子的混合反离子的复合物的形式提供。所述起始核苷酸可以以具有多原子一价阳离子的反离子的复合物的形式提供。
39、应当理解，为了使用本发明进行处理，多原子一价阳离子将能够在合适的条件例如真空下变得具有挥发性。因此，简单的金属一价阳离子例如锂、钠和钾不适合用作起始物质中的反离子，因为它们既不是多原子的，也不能在合适的条件例如真空下变得具有挥发性。由于原始制造过程中的污染，核苷酸复合物中存在的极小比例的一价反离子可能是此类金属离子。
40、因此，起始核苷酸复合物可以基本上由核苷酸和相结合的一价多原子阳离子和任选的二价阳离子组成。可能存在一些少量的一价金属离子污染，但其浓度对于本发明来说是非实质性的浓度。非实质性的量(immaterial amount)可以是小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％核苷酸复合物浓度的浓度。在一些实施方案中，起始核苷酸复合物在溶液中，并且可以添加额外的实体，以帮助蒸发或挥发多原子部分，或为所形成的新型核苷酸复合物提供额外的稳定性。此类实体通常不包括金属离子，而是多原子的并且优选包括两性离子分子。此类实体优选在与多原子部分相同的条件下不可挥发。
41、应当理解，由于核苷酸具有四个负电荷，因此通常提供四个正电荷(通常通过4个一价阳离子)来维持电中性，并且大多数商业核苷酸盐都是在此基础上获得的。作为起始物质，当核苷酸复合物在溶液中时，多原子一价和/或二价阳离子可能提供少于4个正电荷用作反离子。不希望受理论的束缚，发明人推定剩余的电荷可以由诸如水合氢离子的实体提供，以便在需要时达到电中性。如果存在额外的实体例如两性离子，则发明人认为它们有助于使复合物稳定。一旦对核苷酸复合物进行本发明的方法，则一部分或基本上全部的多原子部分被去除或蒸发。一部分可以是50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被去除或蒸发(与起始核苷酸复合物相比)。优选地，100％的所述部分被去除或蒸发。优选地，残留了每个核苷酸少于0.2个多原子一价阳离子，任选少于0.1个，优选没有。
42、多原子一价阳离子的多原子部分是可挥发的并且可以在任何合适的条件下变得具有挥发性。多原子部分优选在常温常压下不具有挥发性。多原子部分在本文中被描述为变得具有挥发性。描述这样的部分的替代方式有：可蒸发的、可汽化的、可气化的或可挥发的。挥发性由物质的蒸气压表示。具有较高蒸气压的物质比具有较低蒸气压的物质在适当的条件下更容易气化。在给定的温度和压力下，蒸气压高的物质更有可能以蒸气形式存在，而蒸气压低的物质更有可能以液体或固体存在。选择合适的条件来使物质气化。
43、使物质变得具有挥发性的合适条件有温度(例如施加热)或压力(例如真空的使用)。一些多原子实体可以通过ph的变化、例如通过增加ph(例如通过包含碱性氨基酸)而变得具有挥发性。使多原子部分变得具有挥发性的最合适的条件是加热和/或真空。
44、多原子一价阳离子可以在真空下变得具有挥发性。使阳离子在真空下变得具有挥发性的温度可以是任何合适的温度，使得溶液中的复合物可以处于室温(约20℃)或可以冷却或加热。如实施例中所用，可使用加热以帮助使多原子一价阳离子具有挥发性。可以使用范围为20-80℃、25-75℃、30-70℃、35-65℃或在其间的任何合适的温度下的加热，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80℃。
45、真空可以产生气体压力小于大气压的区域。因此，气体压力可以是范围从105帕斯卡(pa)至小于10-10pa的任何适当的压力。理想地，真空将在105帕斯卡(pa)至100pa的压力下产生。标准大气压是101,325pa。真空可以使用任何适当的技术来产生，包括使用真空泵或通过任何其他降低压力的方法，例如使用快速流动的液体。
46、多原子一价阳离子在加热下可以变得具有挥发性。可以使用范围为40-100℃、45-95℃、50-90℃、55-85℃或在其间的任何合适的温度下的加热，例如40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100℃。
47、本文所述的一价离子是多原子的，使得其是由多于一个原子组成的离子。这些原子之一可以是氮，例如质子化的氮原子。示例性离子是铵离子(nh4+)。
48、多原子一价阳离子可被描述为碱的共轭酸，其中所述碱是挥发性部分。例如，对于真空下的铵：
49、
50、在这个实施例中，铵离子是氨的共轭酸(两者均标有*)。
51、因此，多原子一价阳离子可被描述为碱的共轭酸，其中所述碱是挥发性部分。一般来说，碱是共轭酸提供质子后形成的物质。或者，所述一价阳离子可以描述为-lowry酸，其中共轭碱是挥发性的。假设是，在本发明的方法中质子被提供给核苷酸实体。因此，在所述方法中蒸发或去除的部分是碱——本文中称为“多原子部分”。
52、示例性的共轭碱和酸包括乙胺碱和乙铵共轭酸、甲胺碱和甲铵共轭酸。两者都是铵的衍生物，并且都失去质子而形成挥发性共轭碱(多原子部分)。
53、因此，所述多原子一价阳离子可以包含氮原子，优选质子化的氮原子。
54、所述多原子一价阳离子可以是铵或其衍生物。还包括铵的衍生物，并且这些的非限制性示例性列表包括：单烷基铵或二烷基铵。本领域技术人员将知晓适合在本发明中使用的带有单个正电荷的铵衍生物。
55、或者，所述多原子一价阳离子可被描述为有机阳离子。通常，铵被描述为无机离子，但许多衍生物是有机的，并且铵离子可以与其有机衍生物归为一类。有机氮以多种形式存在，包括有机溶剂、肽和蛋白。
56、因此，提供了一种制备新型核苷酸复合物的方法，所述方法包括对核苷酸复合物进行干燥，其中所述复合物包含核苷酸和以每个核苷酸0.2至2个二价阳离子的比例存在的二价阳离子，以及以每个核苷酸0.2至2.5个多原子一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子。干燥优选在加热和/或真空下进行，并且一价阳离子的多原子部分在这些条件下变得具有挥发性。优选地，每个核苷酸存在0.2至1个二价阳离子。
57、因此，还提供了一种制备新型核苷酸复合物的方法，所述方法包括从起始核苷酸复合物中去除多原子部分，其中所述起始核苷酸复合物包含核苷酸和以每个核苷酸0.2至4个多原子一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子。起始核苷酸复合物可以与第二核苷酸复合物混合，所述第二核苷酸复合物包含核苷酸和以每个核苷酸0.4至2个二价阳离子的比例存在的二价阳离子。该混合步骤可以在去除多原子部分之前或之后发生。
58、因此，还提供了一种制备新型核苷酸复合物的方法，所述方法包括从起始核苷酸复合物中去除多原子部分，其中所述起始复合物包含核苷酸和以每个核苷酸0.2至2个二价阳离子的比例存在的二价阳离子以及以每个核苷酸0.2至2.5个多原子一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子。
59、所述去除优选在改变的ph、加热和/或真空下进行，并且一价阳离子的多原子部分在这些条件下变得具有挥发性。
60、根据本发明的任何方法，干燥、蒸发或去除挥发性部分优选在真空下进行。
61、本领域技术人员应当理解，用作起始物质的核苷酸复合物通常处于溶液中，以使其能够被干燥或者使可挥发部分蒸发或被去除。
62、应当理解，本文所用的术语“核苷酸”也可以理解为核苷酸离子或核苷酸离子物质；它是不存在任何反离子的核苷酸实体。
63、进一步，还提供了：
64、一种用于酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括获得溶液中的核苷酸复合物，和添加核苷酸转移酶，其中所述复合物是根据本文描述的任何过程或方法制备的。
65、在制备后，认为本发明的核苷酸复合物基本上不包含任何最初结合的一价阳离子。因此，预期水平已降低至每个核苷酸存在0至1个一价阳离子，优选每个核苷酸0至0.5个一价阳离子，任选每个核苷酸少于0.2个一价阳离子，例如每个核苷酸0.2、0.1或0个一价阳离子。因此，质子或水合氢离子不被认为是用于本发明目的的一价阳离子。
66、因此，本发明提供了一种新型核苷酸复合物。所述新型核苷酸复合物是与以每个核苷酸0.5至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸小于0.5个一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子结合的核苷酸。这样的新型核苷酸复合物可以存在于溶剂中，例如水中。除了可能是来自核苷酸本身的制造性污染物的残留金属一价阳离子之外，溶液中的核苷酸复合物可基本上不包含其他阳离子。本文公开了这些物质的合适的耐受水平。
67、因此，本发明提供了一种新型核苷酸复合物溶液，其有效地由以下组成：核苷酸、以每个核苷酸0.5至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子以及以每个核苷酸小于0.5个一价阳离子的比例存在的一价阳离子。
68、优选的是其中二价阳离子以每个核苷酸存在0.5至1.5、0.6至1.4、0.7至1.3、0.8至1.2、0.9至1.1或者恰好一个二价阳离子的比例存在的新型核苷酸复合物溶液。
69、优选的是其中一价阳离子以每个核苷酸存在少于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1个一价阳离子或者实际上不存在一价阳离子的比例存在的新型核苷酸复合物。
70、使用本发明的方法，上述的任何组合都是可行的。
71、所述二价阳离子优选是钙、镁或锰。
72、发明人推定，当所结合的二价阳离子的“电荷”不使核苷酸上的电荷平衡时，水合氢离子(h3o+)提供额外的正电荷。因此，对于本文描述的所有核苷酸复合物，可以存在水合氢离子。这些离子可以以每个核苷酸0.5至3.5个、任选1至3个、任选1.5至2.5个、任选约2个离子的比例存在。这些不是主动添加的，它们是在根据本发明的方法制备核苷酸复合物时形成的。
73、本发明的方法还可以包括向起始核苷酸复合物或新型核苷酸复合物中添加一种或多种两性离子分子。优选地，此类两性离子分子在本发明方法中使用的条件下不具有挥发性。
74、两性离子包含带正电荷和带负电荷的基团，净电荷为零。一些两性离子不能异构化而消除带正电荷和带负电荷的基团，但是大多数两性离子能够失去所有电荷并变得完全中性，这通常在中性ph(ph7)下，但不总是如此。在不同的ph值下，两性离子分子可在溶液中获得或失去水合氢离子，使它们带电并将分子转变为非两性离子形式。两性离子分子可以是氨基酸，其中负电荷来自羧酸盐离子，而正电荷来自铵离子。两性离子分子可以是叶立德(ylide)。叶立德是中性两极分子，含有直接连接至带形式正电荷的杂原子(通常是氮、磷或硫)的带形式负电荷的原子(通常是碳负离子)。叶立德是极性两性离子的一个子类；其中带正电荷的原子和带负电荷的原子键合在一起，即x+-y-。将氨基酸和叶立德两者添加到本文示例的核苷酸复合物中。
75、特别是在氨基酸的情况下，可以选择任何合适的对映体(enantiomer)。本文示例的是组氨酸的l-对映体。l-对映体通常可见于生物学上，并因此可能是优选的。优选的氨基酸是路易斯酸:碱。作为路易斯酸:碱的两性离子可适合于本发明。
76、假设有一个单独的带正电荷基团，则可与核苷酸复合物结合的两性离子的最大数量为4，但溶液中可能存在其他的两性离子。
77、因此，本发明提供了一种新型核苷酸复合物。所述新型核苷酸复合物是与以每个核苷酸小于或等于4个两性离子分子的量存在的两性离子分子、以每个核苷酸0.5至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子以及任选的以每个核苷酸少于0.5个一价阳离子的比例存在的一价阳离子结合的核苷酸。这种新型核苷酸复合物可以存在于溶剂中，例如水中。除了可能是来自核苷酸本身的制造性污染物的残留金属一价阳离子之外，溶液中的核苷酸复合物可基本上不包含其他的或另外的阳离子或离子。
78、因此，本发明提供了一种新型核苷酸复合物溶液，其有效地由以下组成：核苷酸、以每个核苷酸小于或等于4个两性离子分子的量存在的两性离子分子、以每个核苷酸0.5至1.5个二价阳离子的量存在的二价阳离子以及任选的以每个核苷酸小于0.5个一价阳离子的量存在的一价阳离子。
79、优选的是其中二价阳离子以每个核苷酸存在0.5至1.5、0.6至1.4、0.7至1.3、0.8至1.2、0.9至1.1或者恰好一个二价阳离子的比例存在的新型核苷酸复合物溶液。
80、优选的是其中一价阳离子以每个核苷酸存在少于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1个一价阳离子或者实际上不存在一价阳离子的比例存在的新型核苷酸复合物。
81、优选的是其中两性离子分子以每个核苷酸存在0-4、0-3、0.5至2.5、1至2或1.5个两性离子分子的比例存在的新型核苷酸复合物。如本文所用，两性离子和两性离子的可互换使用。
82、使用本发明的方法，上述的任何组合都是可行的。
83、所述二价阳离子优选是钙、镁或锰或其混合物。
84、所述两性离子分子优选是氨基酸或叶立德，并且优选的氨基酸是组氨酸、赖氨酸和精氨酸。
85、提供了一种新型核苷酸复合物，其包含与以每个核苷酸0.5至1.5个二价金属阳离子的比例存在的二价阳离子以及以每个核苷酸0.5至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合的核苷酸。
86、优选的新型核苷酸复合物包含与每个核苷酸0.5至1.5个钙、镁和/或锰以及选自组氨酸、赖氨酸、精氨酸或二甲基亚砜-(异丁酰基)甲基化物中任何一种或多种的0.5至4个分子结合的核苷酸。
87、应当理解，任何上述比例都可以应用于这些新型核苷酸复合物。所述新型核苷酸复合物也可以基本上由列出的实体组成，如果需要的话还可以加上溶剂。其他离子优选不存在，或处于非常低的水平，如先前所讨论的(小于5％、4％、3％、2％或1％的核苷酸浓度是污染性离子)。
88、本发明进一步包括一种用于酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括使用任意本文所述的新型核苷酸复合物。
89、一种用于酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括获得溶液中的核苷酸复合物和核苷酸转移酶，其中所述复合物是与以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0至1个一价阳离子的比例存在的一价阳离子结合的核苷酸。任选地，所述核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸小于或等于4个两性离子分子的量存在的两性离子分子结合。
90、一种使用核苷酸转移酶酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括将所述酶与核苷酸复合物组合，其中所述复合物是与以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0至1个一价阳离子的比例存在的一价阳离子结合的核苷酸。任选地，核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合。
91、还提供了溶液中的新型核苷酸复合物，其包含核苷酸、以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子以及以每个核苷酸0至1个一价阳离子存在的一价阳离子。任选地，核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子存在的两性离子分子结合。
92、还提供了溶液中的新型核苷酸复合物，其基本上由核苷酸、每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子以及每个核苷酸0至1个一价阳离子组成。任选地，核苷酸复合物还可以与每个核苷酸0至4个两性离子分子结合。
93、应当理解，本文所用的术语核苷酸也可以理解为核苷酸离子或核苷酸离子物质；它是不存在任何反离子的核苷酸实体。
94、应当理解，形成复合物的离子在溶液中可以解离也可以不解离。
95、就核苷酸复合物而言，本文所用的一价阳离子通常不包括质子化或与水合氢离子结合。这两者的任一者可以存在于溶液中的核苷酸复合物中以平衡存在的电荷。
96、优选的是，酶促dna合成用于更大规模地生产dna，即用于治疗性或预防性用途(以克/升反应混合物表示)，而不是实验室规模的扩增(ng至mg/升的规模)。正是在这种对实验室规模扩增的扩大中，本发明人发现它并不像提供更多底物和其他组分并发现产率随之而来那么简单。因此，所述方法包括整体以等于或大于30mm的浓度使用核苷酸复合物，所述浓度是在核苷酸复合物与核苷酸转移酶组合时确定的。核苷酸复合物和酶的混合导致反应混合物的形成。由于核苷酸复合物是经干燥的(或挥发性多原子部分被蒸发)，因此可以简单地将其添加到含有核苷酸转移酶的溶液中。浓度是在进行该方法的反应混合物中测定的。因此，核苷酸复合物的浓度是在添加核苷酸复合物时在反应混合物中测定的。因此，所述浓度是初始浓度或方法开始时的浓度。
97、因此，提供了一种酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括使用溶液中浓度至少30mm的核苷酸复合物，其中所述复合物根据本文所述的任何方法制备。
98、任选地，所述复合物可以以至少40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm或120mm的浓度存在。任选地，所述复合物以40mm至160mm、50mm至150mm、60mm至140mm、70mm至130mm或80mm至120mm或这些值之间的任何范围的浓度存在。
99、不希望受理论束缚，根据本文所述的方法制备的核苷酸复合物包含与0.2至1.5个二价阳离子和0至1个一价阳离子结合的核苷酸，其中所述一价阳离子是多原子的。任选地，所述核苷酸复合物还可以与每个核苷酸0至4个两性离子分子结合。所有这些都可以描述为存在于核苷酸复合物中。
100、根据本发明的任何方面，所述核苷酸复合物基本上不含任何一价金属阳离子，例如锂(浓度小于1％核苷酸浓度)、钠(小于5％)和钾(小于5％)。如果dna合成过程中需要变性剂，例如氢氧化钠，则可以一旦制成核苷酸复合物就将该变性剂添加到反应混合物中。
101、因此，提供了一种酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括获得溶液中浓度至少30mm的核苷酸复合物，和添加核苷酸转移酶，所述复合物包含与以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0至1个多原子一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子结合的核苷酸。任选地，所述核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合。任选地，所述复合物可以以至少40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm或120mm的浓度存在。任选地，所述复合物以40mm至160mm、50mm至150mm、60mm至140mm、70mm至130mm或80mm至120mm或这些值之间的任何范围的浓度存在。
102、酶促dna合成可涉及能够合成dna的任何酶，特别是核苷酸转移酶，其在本文中的定义包括能够基于模板或从头合成而将核苷酸转移至新生多核苷酸链末端的所有酶。核苷酸转移酶可包括聚合酶或修饰的聚合酶，例如dna聚合酶或rna聚合酶。聚合酶可以来自任何已知的dna聚合酶家族，包括家族a、b、c、d、x、y和rt。来自x家族的dna聚合酶的一个实例是末端脱氧核苷酸转移酶。
103、核苷酸转移酶可以存在于溶液中，并且核苷酸复合物可以作为固体制备物添加到溶液中的酶中，例如作为冻干粉末。
104、酶促dna合成可以在不使用模板的情况下从头合成而发生。
105、酶促dna合成可包括模板，例如核酸模板，包括dna模板。
106、酶促dna合成可以在包含本文描述的组分的反应混合物中进行。
107、换句话说，提供了一种在溶液中合成dna的无细胞方法，所述方法包括在一种或多种核苷酸复合物的存在下使模板与至少一种核苷酸转移酶接触，其中所述核苷酸复合物包含与以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0至1个多原子一价阳离子的比例存在的多原子一价阳离子结合的核苷酸。任选地，所述核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合。任选地，所述核苷酸复合物的浓度为至少30mm，优选40mm。任选地，所述复合物可以以至少40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm或120mm的浓度存在。任选地，所述复合物以40mm至160mm、50mm至150mm、60mm至140mm、70mm至130mm或80mm至120mm或这些值之间的任何范围的浓度存在。
108、换句话说，所述核苷酸复合物包括二价和多原子一价阳离子的混合物以及核苷酸本身。任选地，所述核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合。因此，提供了一种用于合成dna的无细胞方法，所述方法包括在一种或多种核苷酸复合物的存在下使模板与至少一种核苷酸转移酶接触以形成反应混合物，其中所述核苷酸复合物以至少30mm的浓度存在并且包含与以每个核苷酸0.2至1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子和以每个核苷酸0至1个一价阳离子的比例存在的一价阳离子结合的核苷酸。任选地，所述核苷酸复合物还可以与以每个核苷酸0至4个两性离子分子的比例存在的两性离子分子结合。
109、优选的是，当提及核苷酸或核苷酸复合物的浓度时，这是当dna合成方法开始时核苷酸(或其复合物)的浓度，即核苷酸(或核苷酸复合物)的起始或初始浓度。因此，它是添加至反应混合物后的浓度。应当理解，在该方法过程中可以添加其他成分；此类添加可能会稀释核苷酸/核苷酸复合物的浓度，除非进一步提供核苷酸/核苷酸复合物来补充浓度。此外，由于核苷酸/核苷酸复合物将被所述方法(即dna合成反应)使用或消耗，核苷酸/核苷酸复合物的浓度将随着所述方法的进行而下降。在某些实施方案中，随着所述方法的进行，可以进一步添加核苷酸/核苷酸复合物，以便补充酶促反应的底物。理想地，dna合成反应中的核苷酸浓度将保持在40mm至160mm、50mm至150mm、60mm至140mm、70mm至130mm或80mm至120mm的范围内，或这些值之间的任何范围或值。核苷酸浓度的恒定维持可有利于dna合成反应。
110、本发明人惊奇地发现，如果将包含多原子一价阳离子和二价阳离子的混合物的核苷酸复合物在加热和/或真空下干燥并随后重悬，则所生成的核苷酸复合物可用于利用聚合酶的dna合成反应中，其中核苷酸转化为dna的效率在不同浓度下保持恒定。实施例表明，使用这些新型核苷酸的反应效率保持在55-65％的量级，而无论测试浓度在40mm和120mm之间如何。本发明人迄今尚未观察到这种效应，他们先前已注意到其他复合物具有他们优选执行操作的特定“峰”。这种进一步的改进是相比于先前描述的具有4个一价阳离子的常规核苷酸盐或混合核苷酸复合物。在120mm下获得相同的核苷酸复合物转化效率尤其令人兴奋，因为它提供了在不损失效率的情况下扩大规模的能力。
111、本发明人在实施例中进一步证明，特别是在高于60mm的浓度下，本发明的新型核苷酸复合物、特别是包含一个镁离子(有或没有两性离子分子)的那些核苷酸复合物的表现优于核苷酸铵盐(4个铵离子)。产生了dna的更高产率。
112、已观察到向本发明的核苷酸复合物中添加两性离子分子可加速dna的产生，从而更快地实现更高的产率，特别是在核苷酸复合物的浓度高于100mm时。对于所测试的两种两性离子分子都观察到了这一点。事实上，根据实施例7，仅在48小时内就合成了16g/l dna。
113、因此，本发明提供了一种在40至55小时的时间段内酶促生产至少15g/ldna的无细胞方法，所述方法包括使用核苷酸转移酶和核苷酸复合物，所述核苷酸复合物包含与约1个镁或锰离子和至少一个两性离子分子(任选地是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或二甲基亚砜-(异丁酰基)甲基化物)结合的核苷酸。
114、所述核苷酸复合物的所有组分如前所述。
115、发明人还注意到，镁或锰阳离子与核苷酸复合物的结合意味着反应混合物中不需要额外的镁或锰来合成dna。这有利于减少组分，从而降低成本。此外，这意味着与现有技术相比，反应混合物的离子强度可以进一步降低，发明人发现这有利于dna合成反应。这样的条件可非常适合于各种合成反应，例如单链dna的生产。发明人在迄今进行的工作中注意到，本文首次描述的核苷酸复合物似乎比产生它们的亲本核苷酸复合物生产更多的单链dna。
116、例如，惯例规定，镁(二价阳离子)在dna合成反应中与核苷酸的最小比例为至少1:1。这是因为某些核苷酸转移酶的活性位点可能需要镁；它可以在掺入之前与核苷酸形成复合物，并且进一步可以与在dna合成过程中释放的磷酸盐离子物质形成其自身的盐。在核苷酸复合物中包含镁或锰的优势在于，这减少或消除了对额外的镁或锰的需求。它有助于将镁或锰与核苷酸的比例维持在约1:1(或低于1:1)，本发明人先前已确定这一比例是大规模dna合成反应中所希望的。这一点很重要，因为减少在dna合成中包括的组分会显著降低成本，但此外，更高浓度(大于1:1)的镁与dna合成中的准确性(fidelity)降低有关。一些dna合成酶利用钙而不是镁，这些酶包括dp04。对于这些酶来说，包括钙作为二价离子是有吸引力的。
117、与所述复合物中的核苷酸结合的二价阳离子可以包含选自以下的一种或多种金属：镁(mg2+)、铍(be2+)、钙(ca2+)、锶(sr2+)、锰(mn2+)或锌(zn2+)，优选mg2+或mn2+。溶液中二价金属阳离子与核苷酸(核苷酸离子或核苷酸离子物质)的比例可以是约1:1，但优选地是0.2:1至2:1之间，任选地是0.5:1至1.5:1之间。低于1:1的比例是期望的，并且在dna合成中更优选，这是由于高于1:1的比例可能导致dna合成中的一些不准确。因此，提供与核苷酸复合物相关的二价阳离子可以减少或消除向反应混合物中添加额外的二价阳离子的需要。然而，如果进一步需要，这些二价阳离子可以以任何合适的盐的形式提供给酶促dna合成。
118、此外，本发明人在此开发的方法对于存在的其他组分可以在大范围的条件下进行。这些条件的范围从传统的缓冲水平到不提供另外的缓冲剂，有效地与水中的所需组分进行反应。增加缓冲剂的浓度可以增加缓冲能力以直接改善ph控制，但化学缓冲剂也可能螯合包括镁离子在内的一系列金属离子，并可能不利地干扰最佳dna产率所需的一价和二价阳离子的平衡。因此，可能需要使用尽可能低浓度水平的缓冲剂，同时平衡其他必需反应组分，以将ph值保持在最佳dna生产的可接受范围内。本领域技术人员将理解，本文中提及的一些反离子可能具有它们自己的缓冲能力，或者在dna合成过程中释放或产生的实体(例如，焦磷酸盐和磷酸盐)也可能有助于缓冲过度的ph变化。
119、不管缓冲剂的提供方式如何，所需的组分都可以包括诸如聚合酶的dna合成酶(核苷酸转移酶)、核苷酸复合物以及根据反应条件所需的可选额外组分，其选自以盐形式提供的二价金属阳离子、模板、变性剂、焦磷酸酶或一种或多种引物/引发酶(primase)。这些组分可以形成反应混合物。因此，在其最基本的形式中，反应混合物仅是所制备的核苷酸复合物加上核苷酸转移酶。应当理解，期望反应混合物不含多余的离子物质，因为这些实体可能对dna合成产生不期望的影响。除了核苷酸复合物中存在的离子之外，其他离子可以以最小量存在，例如在变性剂(例如氢氧化钠或氢氧化钾)或缓冲剂中。取决于所选择的核苷酸复合物和参与反应的酶，可能需要进一步补充镁盐或锰盐。优选的是，反应混合物中“额外离子”的浓度，例如在反应开始时，可保持在最低水平，例如小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于20mm或小于10mm。此类额外的离子是除了在反应过程中以核苷酸复合物提供或由核苷酸复合物产生的离子之外的离子。
120、因此，将核苷酸以与减少的混合反离子的复合物的形式提供给所述方法(即反应混合物)是有利的，因为这令人惊讶地提高了dna产率和/或提高了核苷酸转化为dna的效率。这些提高可以是相比于类似的反应混合物(其中所有核苷酸均以仅具有必需的一价阳离子的常规盐的形式提供)。提供所述新型核苷酸复合物而不是常规使用的核苷酸盐具有一些另外的令人惊讶的优点，例如能够降低反应混合物中缓冲剂的浓度(在某些情况下降低至零)，和/或降低、减少或完全去除为反应混合物额外提供二价阳离子辅因子最尤其是镁(其通常以盐的形式添加)的需求。鉴于可以不再需要这种盐，本发明具有降低反应混合物的离子强度的效果，因为如果不添加二价阳离子盐，则不会向反应混合物中提供结合的阴离子(例如，mgcl2——因此避免了两个氯离子的添加)。溶液的离子强度是该溶液中离子浓度的量度。当离子化合物溶解在水中时会解离成离子。如本文所用，测量单位是摩尔(mol/l)。发明人推定，反应混合物的离子强度的降低可有利于所述方法。核苷酸实体提供的一价阳离子可能在高浓度时抑制所述方法，并且因此通过本发明的方法进一步去除它们，可能还有进一步的改进。可选地或另外，在标准方法中，镁或锰以盐的形式提供，并且来自该盐的高浓度的结合阴离子例如氯离子也可能抑制所述方法。此外，发明人已经发现，如果需要操纵使用本发明产生的dna，则引入反应混合物中的酶例如切割和连接靶序列的酶(dna加工酶)会偏好离子强度较低的条件，因为这些酶通常是在dna合成反应结束时添加的，而此时离子强度可能会因常规核苷酸和二价盐而显著增加。因此，来自这样的dna合成反应的产物可能适合于进一步酶促加工(例如，用作模板以使用rna聚合酶生产rna)。
121、一方面，模板指导所述方法中的酶促dna合成。该模板可以是任何核酸模板，例如dna或rna模板。所述模板可以是天然核酸、人工核酸或两者的组合。所述模板的扩增优选通过链置换。所述模板的扩增优选是等温的，即不需要在低温和高温之间循环来进行扩增。在这种情况下，如果需要，可以在开始时使用加热来使模板变性，或者可以通过化学方式使模板变性。然而，一旦模板已经变性，如果合适的话，为了允许任何引物或实际上是引发酶进入双链模板之间，温度可以保持在不影响模板和产物变性的温度范围内。等温温度条件要求反应不加热到模板和产物变性的温度(与需要循环加热以使模板和产物变性的pcr相比)。通常，此类反应在恒定温度下进行，具体取决于酶本身的偏好。温度可以是任何对酶来说适合的温度。
122、所述无细胞方法优选包括通过链置换复制来扩增模板。这种合成释放出单链dna，转而可以使用聚合酶将其复制成双链dna。术语链置换描述了置换合成过程中遇到的下游dna的能力，其中聚合酶打开双链dna以延伸新生的单链。具有不同程度的链置换活性的dna聚合酶可商购获得。或者，可以通过提供dna聚合酶和单独的解旋酶来实现链置换。复制性解旋酶可以打开双链体dna并促进前导链聚合酶的前进。
123、独立地，本发明的任何方面的任选特征可以是：模板可以是环状的。dna可以通过模板的扩增，任选地通过链置换复制来合成。所述dna模板的链置换扩增可以通过滚环扩增(rolling circle amplification，rca)进行。聚合酶可以是phi29或其变体。dna的扩增可以是等温扩增，即在恒定温度下。可以使用引物或引发酶来启动扩增。可以使用切口酶在双链环状模板上“原位”产生引物。所述一种或多种引物可以是随机引物。可以使用一对或一组引物。合成的dna可以包含多联体(concatamer)，所述多联体包含从dna模板扩增的dna序列的串联单元。dna模板可以是闭合的线性dna；优选地，将dna模板在变性条件下孵育以形成闭合环状单链dna。
124、可合成的dna量等于或高于3g/l反应混合物，特别是16g/l或更高，优选高达25g/l或更高。
125、根据本公开的方法制备的新型核苷酸复合物可以允许以高起始浓度，例如90mm、100mm或甚至120mm及以上的起始浓度进行dna合成。
126、可合成的dna量可超过所计算的反应混合物最大产率的60％。优选地，可以合成的dna量可以超过所计算的最大产率的80％。所计算的最大产率是基于所有核苷酸都掺入产物中的理论产率，这可以由本领域技术人员计算。
127、从核苷酸(或核苷酸复合物)合成dna的效率可以描述为提供给反应混合物的核苷酸或其复合物在反应过程中成功掺入产物中的百分比。
128、通过本发明，dna合成的效率还可以在更宽的核苷酸浓度范围内保持，从而导致可以进行dna合成的浓度范围的改进。
129、制备新型核苷酸复合物的方法需要至少一种起始核苷酸复合物。根据需要，可以存在任何合适数量的磷酸盐基团。然而，优选地，核苷酸/核苷酸复合物是脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)或其衍生物或修饰形式。所述核苷酸是脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)及其衍生物中的一种或多种。每个单独的起始核苷酸复合物可以但不要求用提供4个正电荷的各种阳离子进行电荷平衡以维持电中性。用于干燥过程的起始核苷酸复合物可以包括一种或多种多原子一价阳离子，即一种或多种多原子一价阳离子物质，和一种或多种二价阳离子，即一种或多种二价阳离子物质。应当理解，这些可以在溶液中解离，并且因此，与每个核苷酸复合物结合的阳离子的数量不需要是整数，因为所述离子可以在溶液中解离。如果电荷完全平衡，则起始核苷酸复合物可被认为是盐。
130、该起始核苷酸复合物可以如wo2021/161051(pct/gb2021/050366)中所述。
131、溶液中的起始核苷酸复合物用于制备具有减少的一价阳离子供应的核苷酸复合物。这是通过施加热和/或真空来实现的，使得一价阳离子的多原子部分变得具有挥发性并从溶液中去除。它们被有效蒸发。还可以从溶液中去除溶剂，例如水。这种一价阳离子的进一步减少供应产生了一种新型核苷酸复合物，其不需要缓冲剂来重新溶解。
132、整体上，发明人将两种不同的核苷酸复合物(一种仅具有二价阳离子，另一种仅具有一价阳离子)混合在一起，以制备本发明方法中使用的起始核苷酸复合物。或者，这两种核苷酸复合物可以在所述过程期间或之后混合，以去除一价实体。所述核苷酸复合物可以各自独立地包含其中并非所有负电荷被平衡的复合物。这有几个优点。与二价阳离子复合的核苷酸具有低溶解度，因此不常规用于任何应用。与镁离子复合的核苷酸存在特殊问题；它们不在溶液中，并且以其当前形式无法使用。然而，当与结合一种或多种一价阳离子的核苷酸复合物混合时，所述混合物是可溶的并形成溶液。因此，这提供了一种利用先前期望但无法使用的核苷酸复合物的巧妙方式。
133、多原子一价离子可以是单一种类的多原子离子，或者是不同种类的多原子离子的混合物。二价离子可以是单一种类的离子或不同种类的离子的混合物。二价离子可以是镁。
134、多原子一价离子在合适的条件下例如在加热和/或真空下或随着ph的变化而变得具有挥发性。因此，多原子一价阳离子可以是碱的共轭酸，其中碱是挥发性部分。因此，多原子一价阳离子的去质子化形式可被描述为挥发性部分。这可以称为“多原子部分”。
135、挥发性表示一个部分在给定条件下蒸发的趋势，也描述为所述部分气化的容易程度。这是在给定温度和压力下显示的。挥发性通常参考所述部分的沸点来描述(特别是对于液体)。沸点是液体的蒸气压等于周围压力导致液体快速蒸发或沸腾时的温度。这取决于压力。一般来说，挥发性部分的沸点可以低于100℃。
136、干燥过程、去除或蒸发可以在真空下进行。真空可以产生气体压力小于大气压的区域。因此，气体压力可以是105帕斯卡(pa)至100pa的任何适当的压力。因此，压力可以是105pa、104pa、103pa、102pa或101pa或其间的任何压力。低真空可以发生在105至3×103pa，中真空可以发生在3×103至10-1pa，高真空可以发生在10-1至10-10pa。优选低真空或中真空。标准大气压为101,325pa，高于低真空的起始水平。可以使用任何适当的技术来产生真空，包括使用真空泵或通过任何其他降低压力的方法，例如使用快速流动的液体。可以使用任何合适的实验室设备、抽吸器，包括传统的旋转叶片泵、组合泵、活塞泵、隔膜泵和涡旋泵以及无油真空泵来产生真空。真空经设计用于降低系统内的压力，从而降低一个部分的沸点。通过降低沸点，所述部分在低得多的温度下蒸发。
137、干燥过程、去除或蒸发可以在任何适当的温度下进行。技术人员知晓，挥发性部分的沸点将决定一组适合的干燥条件，例如压力和温度。该过程或方法可以在室温下进行。或者，可以对起始核苷酸复合物施加热。温度可升至25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90℃或其间的任何温度范围。使所述部分具有挥发性所需的温度将取决于进行干燥的压力。
138、可优选的是，合适的条件是施加热和真空。装置可用于此类组合处理，如实施例中所例证的。
139、或者或另外，可以通过改变ph，例如通过添加碱性组分来增加ph，从而使所述部分变得具有挥发性。
140、起始核苷酸复合物在真空下的干燥或处理可以促使共轭酸和挥发性碱之间的平衡达到完全，使得基本上所有的挥发性部分被蒸发。
141、起始核苷酸复合物的干燥或处理可导致基本上所有多原子一价部分从复合物中去除，使得每个核苷酸保留少于0.2个多原子部分。理想地，基本上所有的多原子部分都被去除。不受理论的束缚，发明人认为核苷酸实体被质子化，使得挥发性碱自由蒸发。核苷酸可以在氮或磷酸盐基团上质子化。或者，水分子被质子化，产生水合氢离子。
142、所述干燥、去除或蒸发可以导致经干燥的核苷酸复合物的形成，也被描述为粉末。如本文所用，粉末是由许多非常细的颗粒组成的干燥固体，其在摇动或移动时可以自由流动。所述粉末可以是结晶的。干燥可以导致去除起始核苷酸复合物溶液中存在的基本上所有溶剂。一般来说，溶剂可以是水。水或其他溶剂可以在干燥过程中被蒸发。理想地，可以去除所有溶剂，使得产生的核苷酸复合物是干燥的(0％起始体积)。或者，可以残留残余量的溶剂，使得产物中溶剂的水平大约小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的起始体积。这样可以在视觉上观察到“粘性物质”。在实施例中，将核苷酸复合物在真空下从大于1ml的起始体积干燥至约20μl的最终体积。
143、一般而言，多原子一价阳离子以多原子一价阳离子相比于本发明的起始核苷酸复合物的比例为0.2至4、或0.2至2.5的比例存在。该范围包括每个核苷酸复合物0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4和2.5或2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4个多原子一价离子。这些离子可以在核苷酸离子之间共享。使用本文描述的干燥方法可有效地或显著地去除或蒸发这些多原子部分。在本发明的方法期间，一部分多原子部分被去除。该比例可以是60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。优选100％被去除。干燥过程后，多原子部分(共轭酸的挥发性碱)的水平大大降低，优选降低至每个核苷酸少于0.2个多原子部分、少于0.1个多原子部分或甚至降低至零的水平。
144、本文所述的称为干燥过程的过程产生核苷酸复合物，然后当重悬在水中时，其具有降低的ph。这种ph的降低被认为是由于干燥过程中复合物中核苷酸的质子化造成的。在实施例中，发明人发现重悬的核苷酸复合物的酸性不如预期，并且可能是由于核苷酸复合物能够用作缓冲剂。发明人不需要使用缓冲液以在使用前重新溶解或溶解核苷酸复合物。
145、多原子一价阳离子优选包括质子化的氮原子。合适的多原子一价阳离子包括铵及其衍生物。正是该质子在多原子部分的蒸发过程中转移至核苷酸实体。
146、在基本上干燥或完全干燥后，核苷酸复合物可以储存在适当的条件下，例如冰箱中，直到需要使用。在使用中，制备的核苷酸复合物需要重新溶解，例如在水或其他溶剂中。这些可以单独提供或与核苷酸转移酶组合提供，以形成反应混合物。可以将其他组分添加到反应混合物中。
147、用于重新溶解的溶剂可以是水。所述溶剂可以是任何合适的溶剂。本发明人惊奇地发现，尽管失去了挥发性部分，但重新溶解不需要缓冲剂。因此，推测核苷酸复合物能够独立地缓冲ph，这可能是通过一个或多个磷酸基团的存在。
148、所述重新溶解可允许添加其他实体，例如上文描述的两性离子分子。它们可以存在于溶剂中或单独添加。
149、在干燥过程或蒸发中，起始核苷酸复合物可以处于任何适当的浓度。
150、使用干燥过程或蒸发的优点在于，它产生新型核苷酸复合物，其在用于dna的酶促合成时特别有优势。
151、优选的是，在dna的酶促合成中，即在反应混合物中，核苷酸或其复合物的浓度可以大于30mm并且高达至少160mm。这样的浓度对于生产更高产率的dna非常重要，在所给出的两个浓度的情况下产率可高达9.75g/l至52g/l。优选的是，所述的核苷酸或其复合物的浓度是合成反应开始时的浓度，即反应混合物中核苷酸或其复合物的起始或初始浓度，所述反应混合物中还包括dna合成所需的酶。随后添加其他组分可能会降低该浓度，并且dna合成酶对它们的使用也会降低来自起始浓度的浓度。本领域技术人员将知晓如何在制备方法时基于其他组分和所用的储备核苷酸复合物溶液/粉末的体积来计算核苷酸/核苷酸复合物的浓度。如上所述，通过持续监测和在浓度降低时添加进一步的核苷酸，或通过恒定添加核苷酸复合物，在dna合成反应中保持核苷酸复合物的浓度恒定，例如在100mm、110mm、120mm、130mm或140mm，对于整个反应可能是有益的。
152、需要注意的是，在dna合成或扩增领域中，当作者想表示“核苷酸盐”时，使用术语“核苷酸”，因为目前并没有可能在dna合成中提供和利用核苷酸而没有任何形式的反离子。
153、所述方法可以是分批方法(batch process)或连续流方法(continuous flowprocess)。分批可以是封闭分批(即在dna合成开始时提供所有反应组分)，或者可以在所述过程中根据需要向反应提供另外的组分，例如在wo2016/034849中描述的，其通过引用并入本文。如果需要进一步添加，这将稀释核苷酸或核苷酸复合物的浓度，除非添加另外的核苷酸复合物以补充或增加浓度。
154、使用此类离子的dna酶促无细胞合成可以在最小缓冲剂中进行，其中不添加已显示可增强dna合成或有助于引物结合的额外盐或去污剂。所述最小缓冲剂可包含稳定ph的试剂(缓冲剂)。所述最小缓冲剂可含有少量的阳离子，这些阳离子由用于使模板变性的化学物质(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵)的存在而提供。在实施例中，使用5mm氢氧化钠或氢氧化钾作为变性剂，但该浓度可以在进行dna变性的技术人员的技术范围内进行改变以适应反应条件，并且氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵的量可以根据模板的性质，以从2.5mm、高达5mm、高达10mm、15mm、20mm或25mm或更多的量提供来使用。因此，反应混合物可含有少量或最少量的初始不与核苷酸复合物结合的阳离子和阴离子。
155、进一步的优点如下所述。
1.核苷酸复合物，其包含与以每个核苷酸0.2-1.5个二价阳离子的比例存在的二价阳离子结合的核苷酸，该核苷酸任选地进一步与以每个核苷酸小于或等于4个两性离子分子的量存在的两性离子分子结合。
2.根据权利要求1所述的核苷酸复合物，其在溶液中，任选地在水中。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的核苷酸复合物，其中：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核苷酸复合物，包含：
5.核苷酸复合物，其基本上由权利要求1至4中任一项所述的核苷酸复合物组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核苷酸复合物，其中所述核苷酸复合物是脱氧核苷三磷酸(dntp)。
7.一种用于在溶液中酶促合成dna的无细胞方法，所述方法包括获得权利要求1至6中任一项所述的核苷酸复合物和添加核苷酸转移酶。
8.根据权利要求7所述的无细胞方法，其中所述核苷酸复合物以40mm至160mm、任选50至150mm或60至140mm的浓度获得。
9.根据权利要求7至权利要求8所述的无细胞方法，其中所述核苷酸复合物的浓度在整个dna合成过程中保持在40mm至160mm、任选50至150mm或60至140mm、100mm、110mm、120mm、130mm或140mm的浓度。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的无细胞方法，其中将另外的组分添加到所述无细胞方法中，包括但不限于以下的任何一种或多种：
11.根据权利要求10所述的无细胞方法，其中将镁盐或锰盐作为所述核苷酸转移酶的辅因子添加到反应混合物中，使得镁和/或锰与核苷酸的总比例不超过2:1。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的无细胞方法，其中所述核苷酸转移酶是dna聚合酶，优选是链置换dna聚合酶，并且所述合成是等温dna合成。
13.一种在40至55小时之间的时间段内酶促生产至少15g/l dna的无细胞方法，所述方法包括使用核苷酸转移酶和核苷酸复合物，所述核苷酸复合物包含与约1个镁离子或锰离子和至少一个两性离子分子结合的核苷酸，任选地，所述两性离子分子是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或二甲基亚砜-(异丁酰基)甲基化物。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的无细胞方法，其在水中进行，任选地不使用缓冲剂。
15.一种制备核苷酸复合物的方法，所述方法包括：
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述起始核苷酸复合物包含与以每个核苷酸0.2至4个多原子一价阳离子的比例存在的一价阳离子结合的核苷酸。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第二核苷酸复合物包含与以每个核苷酸0.5至4个二价阳离子的比例存在的二价阳离子结合的核苷酸。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述合适的条件是加热和/或真空，任选地其中这些条件在步骤(ii)中应用。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述被蒸发的一部分多原子部分为起始物质中存在的多原子部分的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
21.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中基本上所有的所述多原子部分都被蒸发。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述多原子一价阳离子是碱的共轭酸，其中所述碱是挥发性多原子部分。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述多原子一价阳离子的去质子化形式是挥发性多原子部分，优选地，其中所得挥发性多原子部分在标准大气压下具有低于100℃的沸点。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中所述多原子一价阳离子是铵离子或其离子衍生物。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其中将所制备的核苷酸复合物重悬于溶剂中，优选重悬于水中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述核苷酸复合物可以在不存在缓冲剂的情况下重悬。
27.根据权利要求15至26中任一项所述的方法，其中所述核苷酸复合物是粉末。
28.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述两性离子分子是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或二甲基亚砜-(异丁酰基)甲基化物中的任意一种或多种。
29.根据权利要求15至28中任一项所述的方法，其中所述二价阳离子是钙、镁或锰。
30.根据权利要求15至29中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括对所述核苷酸复合物施加热，使得所述复合物的温度为40℃以上、50℃以上、60℃以上、70℃以上、80℃以上、90℃以上或100℃以上。
31.根据权利要求15至30中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括施加在105pa至100pa之间的压力下产生的真空。
