本发明属于林木基因工程，具体涉及一种油茶pds基因vigs沉默体系与构建方法。
背景技术：
1、油茶(camellia oleifera abel.)为我国特有木本油料树种，与橄榄、油棕和椰子统称为世界四大木本食用油源树种。油茶脂肪酸结构合理，不饱和脂肪酸含量高达90％以上，油酸含量80％以上，亚油酸含量达到13％，不仅营养价值高，还具有不与农争地、不与人争粮的独特优势和发展潜力，能有效缓解油料供需矛盾和进口压力。
2、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,vigs)是通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术，主要用于基因的功能鉴定。与基因敲除、转基因、突变体筛选等植物转基因技术相比，vigs操作简便，无需构建转基因植株，具有周期短、获得表型快速、成本低等优点。目前，这种反向遗传学新技术已广泛应用于与植物抗病、抗逆及生长发育等相关功能基因的研究，在植物功能基因组学的研究中发挥重要作用。油茶等木本油料植物往往童期长，遗传转化困难，制约了基因工程研究的进展，而vigs技术则有望克服上述瓶颈从而大大促进相关基因的功能鉴定。
3、在不同的植物中建立vigs体系，一般选用八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,pds)基因作为报告基因。copds是油茶中类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，主要在叶片、茎中表达，当类胡萝卜素合成受阻时，油茶叶片会出现光漂白症状，表型肉眼容易观测。本发明构建了携带copds干扰片段的烟草脆裂病毒重组载体，通过农杆菌成功侵染油茶，建立油茶高效vigs体系，为油茶功能基因组学研究提供技术支撑。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种油茶pds基因vigs沉默体系与构建方法，首次在木本油料油茶中成功建立vigs体系。该体系能够快速、高效的鉴定油茶基因的生物学功能，可以根据植株表型的变化来探究目标基因的功能机制。该vigs体系的建立对木本油料植物油茶功能基因的研究具有开创性的意义。
2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种油茶pds基因vigs沉默体系，通过农杆菌介导携带目的基因片段的重组病毒质粒侵染油茶所得，其中目的基因片段如seq id no.1所示。
3、一种油茶vigs沉默体系的构建方法，包括如下步骤：
4、1.油茶植株材料的培养：1年生油茶幼苗，在温室中盆栽种植。
5、2.目的基因片段的克隆：选择油茶pds基因，使用sol genomics network vigs工具设计关键基因的vigs序列，设计目的基因片段的正反向引物，以油茶叶片rna反转录后的cdna为模板，利用高保真酶pcr扩增，获得目的基因片段。
6、3.重组病毒质粒载体的构建：病毒载体ptrv2与步骤2获得的目的基因片段相连接，获得ptrv2和目的基因片段相连接的重组病毒质粒，然后将重组病毒质粒转化进农杆菌。
7、4.农杆菌介导重组病毒质粒侵染油茶植株：将含有ptrv1的农杆菌菌液与含有重组病毒质粒的农杆菌菌液按照1:1的体积比混匀，然后使用1ml注射器采用压迫渗透法侵染油茶叶片。
8、5.沉默效果结果验证：侵染的油茶植株4-6周后长出的新叶逐渐出现白化表型，使用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)分析pds基因的表达量变化情况。
9、进一步的，所述目的基因片段如seq id no.1所示。
10、进一步的，所述目的基因片段正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示。
11、进一步的，所述步骤4具体为：
12、(1)取l ml含有重组病毒质粒的农杆菌菌液转接于5mlyeb液体培养基(含有100mg/l链霉素、100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素)中活化，28℃摇床中180rpm振荡培养至od600为1.0；
13、(2)将步骤(1)所得菌液离心后，弃上清液。收集菌体后在mma溶液(含10mmol/l氯化镁、10mmol/l 2-吗啉乙磺酸和150mmol/l乙酰丁香酮)中重悬菌体，酶标仪测定od600＝1.0；
14、(3)将含有ptrv1的农杆菌菌液分别与含有ptrv2和重组病毒质粒的农杆菌菌液按照1：1的体积比混匀，4℃静止放置1-2h后侵染油茶植株；其中含有ptrv1与含有ptrv2农杆菌的混合菌作为不含重组病毒质粒的空载体对照；
15、(4)用l ml的无针头注射器吸取菌液，缓慢注射油茶叶片直至叶面充满侵染液。接种后保持湿度在90％以上，16℃黑暗培养2天后，16h光照/8h黑暗正常培养。
16、进一步的，所述步骤5中qrt-pcr基因表达分析是以ef1α基因作为内参对照，检测pds基因的表达量情况；正向引物如序列seq id no.4所示，反向引物如序列seq id no.5所示；ef1α内参基因的正向引物如序列seq id no.6所示，反向引物如序列seq id no.7所示。
17、本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明首次在木本油料油茶中成功建立vigs体系。该体系能够快速、高效的鉴定油茶基因的生物学功能，可以根据植株表型的变化来探究目标基因的功能机制。该vigs体系的建立对木本油料植物油茶功能基因的研究具有开创性的意义。
1.一种油茶pds基因vigs沉默体系，其特征在于，通过农杆菌介导携带目的基因片段的重组病毒质粒侵染油茶所得，其中目的基因片段如seq id no.1所示。
2.一种油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述目的基因片段如seq id no.1所示。
4.根据权利要求2所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述目的基因片段正向引物序列如seq id no.2所示，反向引物序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求2所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述步骤s4具体为：
6.根据权利要求5所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的yeb液体培养基含100mg/l链霉素、100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素。
7.根据权利要求5所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的mma溶液含10mmol/l氯化镁、10mmol/l 2-吗啉乙磺酸和150mmol/l乙酰丁香酮。
8.根据权利要求2所述的油茶pds基因vigs沉默体系构建方法，其特征在于，所述步骤s5中qrt-pcr基因表达分析是以ef1α基因作为内参对照，检测pds基因的表达量情况；正向引物如序列seq id no.4所示，反向引物如序列seq id no.5所示；ef1α内参基因的正向引物如序列seq id no.6所示，反向引物如序列seq id no.7所示。
