本发明涉及生物医药，尤其是涉及一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法。
背景技术：
1、重症肌无力(myasthenia gravis,mg)是一种b细胞介导的自身免疫性神经肌肉传递障碍，以骨骼肌无力和疲劳为特征，据统计每年发病率为1-2/10万人，患病率高达20-50/10万人，导致患者的生活质量受到严重影响。全身型重症肌无力甚至导致呼吸肌无力抑制呼吸威胁患者生命。传统的治疗方案是通过抗胆碱酯酶药物、血浆置换、以及胸腺切除术来进行控制，但部分患者仍然治疗无效或治疗后临床复发。mg在血清学上表现为抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptors,achrs)、肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,musk)或脂蛋白相关蛋白4(lipoproteinrelated protein 4,lpr4)等自身抗体的变化。但临床血清学诊断存在诊断不足的风险，大约15％的mg患者被称为血清阴性mg意味着会将大量患者排除在治疗范围之外。
2、rtx(利妥昔)是一种工程嵌合鼠/人单克隆抗cd20抗体，已成为b细胞介导自身免疫性疾病的标准治疗方法，同时其被证实通过消耗b细胞减轻患者mg症状，尤其对难治性全身型重症肌无力的治疗是有益的。文献报道rtx治疗mg的临床症状改善率约为68％，完全缓解率仅为36％。反复注射rtx具有毒性免疫抑制作用。mg的药物敏感性预测主要基于自身抗体等生物标志物以及流式细胞术经典免疫表型。这些方法特异性及敏感性较低，实施过程复杂、昂贵。因此，对mg患者提供敏感、方便、早期发现并明确治疗策略是提高生存及改善生活质量的关键。
3、记忆b细胞是rtx特异性结合位点，与rtx疗效密切相关。记忆b细胞上有多个白细胞分化抗原，例如：cd20、cd27等。健康成人血液中记忆b细胞比例约为11.1％，但在mg引起的病理过程中，记忆b细胞的含量及比例通常会发生变化。此外，记忆b细胞的表达特征与rtx治疗后复发相关。当rtx达到足够的记忆b细胞消耗水平时，mg患者的临床益处可持续存在。记忆b细胞及其亚群重新进入循环是mg患者的临床复发的必要条件，但其与复发的具体关系尚不清楚。症状复发的启动过程也被证实与免疫细胞的分化有关，如自身抗体，记忆b细胞等。因此，寻找新的方法来进一步阐明rtx与mg患者记忆b细胞及其亚群的结合特征，可能对于揭示mg患者rtx疗效及复发情况有重要的意义。
4、现有技术方案：(1)流式细胞技术(flow cytometry)是一种分析和分离细胞的技术，它利用流式细胞仪通过激光束照射细胞，并通过检测散射光和荧光来获取细胞的物理和化学信息。基本原理为：细胞悬液通过流式细胞仪的流体系统，使细胞单个通过激光束，激光会被细胞散射和产生荧光，然后通过光电检测系统检测并转化为电信号，最后通过计算机系统分析。用以细胞计数、细胞周期分析、细胞凋亡检测、细胞表面和内部标志物检测及细胞分选等。(2)免疫磁珠富集法(immunomagnetic enrichment)利用特异性抗体结合磁性珠子，来选择性地捕获和富集目标细胞或目标分子。基本原理为：特异性抗体与磁珠结合，形成抗体-磁珠复合体。当这些复合体加入到包含目标细胞或分子的样本中时，它们会特异性地结合。随后，通过磁场可以轻松地分离和富集与磁珠结合的目标细胞或分子。用以纯化和分离细胞、捕获和检测循环肿瘤细胞、分子诊断和生物标志物的检测、高通量药物筛选等。总而言之，目前主要通过流式细胞技术以及免疫磁珠富集法根据b细胞表面抗原特征鉴定b细胞亚群，无法准确预测对rtx的特异性结合情况以及评估抗体行为。这两种方法存在以下缺陷：①缺乏特异性结合情况的直接预测：可识别、计数、分离与特定抗体结合的细胞，但不能直接预测特异性结合情况；②受细胞环境的影响：其他细胞表面分子的存在、细胞的类型、细胞的生理状态是否会影响靶抗原的构象和可及性而导致无法预测和评估。(3)荧光结合抗体染色法(fluorescence-linked immunosorbent assay，简称flisa)：又称为荧光抗体染色方法、免疫荧光技术，是以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术。但是该技术受血液自身荧光背景和各种荧光伪影的影响，导致背景信号干扰、灵敏度降低、线性范围缩小等问题。具体理解为：①血液和其他生物样本通常都有自己固有的荧光，天然荧光分子(如：黄素、卟啉和某些氨基酸)，这种固有荧光可能与用于染色的荧光染料存在光谱重叠，导致干扰特定信号的监测；②光漂白会破坏导致荧光损；③标记的抗体与目标之外的靶标非特异性结合，从而导致灵敏度降低；④在样品制备的过程中存在改变的靶分子的结构和分布的可能。
5、表面增强拉曼散射(sers：surface-enhanced raman scattering)光谱能提供高灵敏度检测及丰富的结构信息，从而使其在检测和表征方面成为有力的光谱技术。sers技术的分子特异性(常被称为指纹谱)：即其能够区分不同的待检测分子，从而实现对若干感兴趣分子的同时检测。sers技术可提供细胞分子指纹信息为诊断提供依据。振动光谱是分析化学和生物分析领域的重要工具，其中傅立叶变换红外光谱(ftir)和表面增强拉曼光谱(sers)近年来在疾病诊断中得到了广泛的应用。
6、鉴于此，本发明特提出一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，该方法能够特异性的检测不同分化/成熟阶段的记忆b细胞，特异性强，灵敏度高。
2、本发明的第一方面，提供一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，包括如下步骤：
3、s1、制备fe3o4@ag@strepavidin@anti-igm纳米磁性复合材料；
4、s2、制备抗cd20抗体纳米偶联物；
5、s3、提取待测样本记忆b细胞，在提取的记忆b细胞中加入步骤s1制备的fe3o4@ag@streptavidin@anti-igm纳米磁性复合材料；
6、s4、利用外部磁场将记忆b细胞分为mz组和sm组；其中，mz组细胞为与fe3o4@ag@streptavidin@anti-igm纳米磁性复合材料结合的记忆b细胞亚群；sm组为未与fe3o4@ag@streptavidin@anti-igm纳米磁性复合材料结合的记忆b细胞亚群；
7、s5、在mz组和sm组中分别加入步骤s2制备的抗cd20抗体纳米偶联物，进行表面增强拉曼散射检测。
8、优选的，步骤s1包括如下步骤：
9、s11、将naoh加入fecl3.6h2o和fecl2.4h2o的混合物中，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，采用磁选法分离磁性纳米粒子；
10、s12、将步骤s11制备的磁性纳米粒子升温，通过在所制备的磁性纳米粒子表面吸附聚合物，制备磁-o-羧甲基壳聚糖复合物；
11、s13、将硝酸银加入到步骤s12制备的磁-o-羧甲基壳聚糖复合物中，复合物表面的银离子被还原，得到的产物采用磁倾析分离；
12、s14、将步骤s13产物与链霉亲和素混合搅拌，形成链霉亲和素纳米复合材料；
13、s15、将步骤s14的链霉亲和素纳米复合材料与生物素化anti-igm混合，使链霉亲和素和生物素化anti-igm建立共价结合，制得fe3o4@ag@strepavidin@anti-igm纳米磁性复合材料。
14、优选的，步骤s2包括如下步骤：
15、s21、将银纳米粒子通过巯基包覆一层对巯基苯甲酸分子；
16、s22、通过与1-乙基-3-3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐反应活化步骤s21的对巯基苯甲酸分子上的羧基，并与n-羟基琥珀酰亚胺反应生成反应酯中间体；
17、s23、抗cd20抗体共价结合到步骤s22的对巯基苯甲酸分子上，制得抗cd20抗体纳米偶联物。
18、优选的，步骤s21所述的银纳米粒子的粒径为50nm。
19、优选的，步骤s23中所述的抗cd20抗体为利妥昔，制得的抗cd20抗体纳米偶联物为利妥昔纳米偶联物。
20、优选的，步骤s3包括如下步骤：
21、s31、通过密度梯度离心法分离待测样本外周血单个核细胞；
22、s32、采用磁珠分选从步骤s31的外周血单个核细胞中分离记忆b细胞；
23、s33、在步骤s32分离的b细胞中加入fe3o4@ag@strepavidin@anti-igm纳米磁性复合材料。
24、优选的，步骤s32中所述的磁珠分选采用cd27磁珠阳性分选记忆b细胞分离试剂盒。
25、优选的，步骤s5的表面增强拉曼散射检测中使用514.5nm激光激发，达到样品功率3mw，积累时间20s。
26、本发明的第二方面，提供一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测试剂盒，采用上述的方法检测记忆b细胞。
27、优选的，试剂盒包括：fe3o4@ag@strepavidin@anti-igm纳米磁性复合材料和抗cd20抗体纳米偶联物。
28、优选的，抗cd20抗体为利妥昔。
29、优选的，试剂盒中的抗cd20抗体纳米偶联物为rtx纳米偶联物。
30、本发明的第三方面，提供一种重症肌无力患者利妥昔给药预测系统，包括：采用上述的方法获取接受利妥昔治疗的不同疗效的重症肌无力患者的记忆b细胞拉曼光谱构建的opls-da模型。
31、优选的，使用labspec6软件对拉曼光谱进行处理，包括基线校正、光谱均一化。利用opls-da的kennard-stone算法将所有样本分为一个校准集和一个预测集；rtx治疗后缓解的mg患者样本编码为1，治疗后未缓解mg患者的样本编码为2，模型的判别阈值设置为1.5；opls-da模型的性能通过校准(acccv、specv和sencv)和预测(accp、spep和senp)的准确性、特异性和灵敏度进行评估；同时使用s-line分析，借助拉曼位移进一步获得分类模型。
32、有益效果：
33、本发明的技术方案通过以fe3o4@ag@strepavidin@anti-igm纳米磁性复合材料作为基质，既可以富集筛选不同分化/成熟阶段的b细胞，又可以作为sers信号放大的基底；另一方面，将抗cd20抗体通过共价结合到p-mba标签上，构建抗cd20抗体纳米偶联物，实现抗cd20抗体与记忆b细胞的特异性捕获和识别，能够特异性的检测不同分化/成熟阶段的b细胞，特异性强，灵敏度高。
1.一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s1包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s2包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s21所述的银纳米粒子的粒径为50nm。
5.根据权利要求3所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s23中所述的抗cd20抗体为利妥昔，制得的抗cd20抗体纳米偶联物为利妥昔纳米偶联物。
6.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s3包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s32中所述的磁珠分选采用cd27磁珠阳性分选记忆b细胞分离试剂盒。
8.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测方法，其特征在于，步骤s5的表面增强拉曼散射检测中使用514.5nm激光激发，达到样品功率3mw，积累时间20s。
9.一种基于表面增强拉曼散射的记忆b细胞检测试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-8任一项所述的方法检测记忆b细胞。
10.一种重症肌无力患者利妥昔给药预测系统，其特征在于，包括：采用权利要求1-8任一项所述的方法获取接受利妥昔治疗的不同疗效的重症肌无力患者的记忆b细胞拉曼光谱构建的opls-da模型。
