本发明涉及医学生物，涉及serpinb9作为分子标志物在胰腺导管腺癌分期诊断、预后评估以及治疗中的应用，具体涉及serpinb9在制备胰腺导管腺癌分期诊断或预后评估试剂盒以及治疗药物中的应用。
背景技术：
1、胰腺导管腺癌(pdac)因其高度恶性特征被戏称为"癌中之王"，其预后十分不乐观。据统计，其5年总生存率不足10％，而预计到2030年，将成为某些地区癌症相关死亡的第二大原因1,2。当前针对pdac的治疗手段涵盖手术切除、全身化疗和靶向治疗等策略。然而，尽管采用这些方法，pdac患者的5年总生存率(os)仍然十分低下3。这种对胰腺肿瘤的困难治疗形势迫切需要寻求新的治疗途径。
2、近年来，免疫疗法被发现是应对实体肿瘤，包括胰腺癌的最有前景的治疗方法。pd-l1/pd-1作为目前研究最广泛的肿瘤核心免疫检查点，在免疫治疗中扮演着关键角色，抗pd-1/pd-l1单克隆抗体已成为免疫检查点抑制剂的主要代表4。这种pd-l1/pd-1通路的抑制策略已被用于多种癌症类型，包括乳腺癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌5–7。然而，胰腺癌独特的强烈免疫抑制性肿瘤微环境导致对pd-l1/pd-1阻断治疗反应不佳8。因此，逆转肿瘤免疫抑制微环境对提高基于pd-1/pd-l1的联合治疗的临床疗效至关重要。
3、serpinb9，又称为pi-9，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpinb)家族的一员。最近的研究表明，serpinb9在肿瘤免疫治疗中扮演着重要角色，它通过调节颗粒酶b的活性来抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，而颗粒酶b则是免疫细胞介导的肿瘤细胞杀伤的关键蛋白9。研究指出，serpinb9作为一种潜在的免疫检查点调节剂，对免疫治疗的研究具有重要意义10。这些发现表明，调控serpinb9可能代表一种新的肿瘤治疗策略。
4、然而，目前尚无研究探讨serpinb9在胰腺癌中发挥的功能及其调控免疫微环境的相关机制。本研究旨在探究serpinb9对免疫微环境的调节以及其对胰腺癌治疗的影响，从而提出一种增强pd-l1/pd-1单抗治疗效果的联合治疗策略。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供胰腺导管腺癌的诊断标志物，本发明的目的也在于提供serpinb9的新用途，即在制备胰腺导管腺癌分期诊断或预后评估试剂盒以及治疗靶点中的应用。
2、发明人经过研究发现：serpinb9在胰腺癌免疫微环境中扮演关键角色，其通过稳定精胺合酶(sms)的表达进而增加了肿瘤微环境中代谢产物精胺的水平，这抑制了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。通过抑制serpinb9有助于增强胰腺肿瘤pd-l1/pd-1单抗治疗效果。此外，serpinb9表达水平与胰腺癌患者肿瘤分期分级有显著相关性，也与胰腺癌患者生存预后有显著相关性，serpinb9低表达组生存期长。由此，发明人发现了serpinb9分子在用于肿瘤发展判断、治疗方案选择和/或预后评估中的新用途，从而在此基础上完成本发明。
3、本发明涉及serpinb9分子在用于胰腺导管腺癌发展判断、治疗和/或预后评估中的新用途，还涉及在胰腺肿瘤治疗中利用serpinb9的调控作用来增强pd-l1/pd-1单抗疗效的方法。通过抑制serpinb9，期望提高免疫治疗的响应性，以克服胰腺癌免疫抑制性微环境对pd-l1/pd-1阻断疗法的限制。
4、本发明的第一方面，提供了serpinb9作为胰腺导管腺癌诊断标志物的应用。
5、本发明的第二方面，提供了serpinb9在制备胰腺导管腺癌分期诊断或预后评估试剂盒中的应用，基于分期诊断对治疗方案进行选择，事先对患者进行个性化针对性治疗。
6、优选的，所述检测serpinb9表达量的试剂为检测生物样品中serpinb9含量的试剂。
7、本发明中，检测对象为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。应用于临床时，检测对象选自下组：将接受、正在接受或已接受肿瘤免疫治疗的胰腺导管腺癌患者；具有或疑似具有pd-l1/pd-1单抗疗效不佳的胰腺导管腺癌患者。
8、检测的生物样品选自：获自所述对象肿瘤的组织、细胞和/或体液样品，可以是新鲜样品、冷冻样品、固定样品(如福尔马林固定样品、石蜡包埋样品)。
9、优选的，serpinb9选自如下任一种物质：serpinb9基因、serpinb9的mrna或cdna、serpinb9蛋白或前述任一种的活性或标志性片段。
10、因此，serpinb9水平包括其核酸分子水平和/或其蛋白质分子水平。检测serpinb9表达量的试剂选自：对serpinb9具有检测特异性的探针、基因芯片、pcr引物、抗体、蛋白质芯片或化学小分子。
11、本发明具体实施方式中通过western blot(wb)和免疫组化染色(ihc)技术，我们评估了serpinb9在临床胰腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异。同时，分析了serpinb9的表达水平与胰腺癌患者的分期分级和预后之间的关系。两种方法发中所用的抗体通过动物免疫方式获取得到。
12、在一些实施方式中，测定样品中serpinb9水平的试剂直接或间接被可检测标签标记。在一些实施方式中，可检测标记选自：放射性同位素、荧光基团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子或配体。
13、本发明中，分期诊断是根据对象肿瘤样品中serpinb9水平对胰腺导管腺癌进行分期，基于分期结果选择相应的治疗方案。治疗分期诊断的对照水平为通过统计学确定的群体标准水平。
14、本发明中，预后评估是根据对象肿瘤样品中serpinb9水平将罹患胰腺导管腺癌的所述对象评估为预后良好或预后不良。具体包括：根据对象样品中serpinb9水平对罹患胰腺导管腺癌的所述对象进行预后评估，其中serpinb9水平高于对照水平则评估所述对象预后不良，而serpinb9水平低于对照水平则评估所述对象预后良好。
15、其中，对照水平的确定方法选自如下任一种方式：由非肿瘤的正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的serpinb9分子水平、同一对象不同时间点采集的样品(例如治疗前一段时间内、治疗前后、治疗后一段时间内)、通过统计学确定的群体标准水平(例如统计学样本中serpinb9水平的中位数或平均数)、或经标准化的水平。
16、本发明的第三方面，提供了一种胰腺导管腺癌的分期诊断或预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中serpinb9含量的试剂。
17、优选的，所述检测serpinb9表达量的试剂选自：对serpinb9具有检测特异性的探针、基因芯片、pcr引物、抗体、蛋白质芯片或化学小分子。
18、本发明的第四方面，提供了serpinb9抑制剂在制备胰腺导管腺癌治疗药物中的应用。
19、优选的，serpinb9选自如下任一种物质：serpinb9基因、serpinb9的mrna或cdna、serpinb9蛋白或前述任一种的活性或标志性片段。
20、优选的，serpinb9抑制剂选自如下任一种物质：降低serpinb9表达水平、降低serpinb9活性或促进serpinb9代谢的物质。如该serpinb9抑制剂包括serpinb9的sgrna及crisper-cas9 mrna、小干扰rna分子、短发夹rna、反义核苷酸中的任意一种，或携带上述任一种物质的纳米颗粒、病毒载体、peg修饰蛋白、蛋白微球、脂质体或细胞外囊泡。
21、serpinb9 sgrna和crispr-cas9 mrna全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据所公开的有关核苷酸序列来设计引物，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
22、本发明具体实施方式中，通过serpinb9 shrna序列，将其导入肿瘤细胞，并通过蛋白免疫印迹(westernblotting，wb)实验验证了敲低serpinb9的成功构建。
23、应理解，本文的serpinb9分子优选获自人，获自其它动物的与人serpinb9高度同源(如具有70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它serpinb9分子也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如blast。
24、来源方面，本发明抑制剂选自：天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质；进一步的，所述抑制剂源自哺乳动物，如人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。
25、本发明的第五方面，提供了一种serpinb9抑制剂重组载体，包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的serpinb9的sgrna及crisper-cas9 mrna、serpinb9 sirna、serpinb9shrna或strip反义核苷酸。
26、本发明第六方面，提供了上述serpinb9抑制剂重组载体在制备胰腺导管腺癌治疗药物中的应用。
27、本发明第七方面，提供了一种胰腺导管腺癌治疗药物组合物，包括活性组分以及医学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
28、其中，活性组分选自如下任一情况：(1)serpinb9抑制剂；(2)serpinb9抑制剂重组载体；(3)serpinb9抑制剂与pd-l1/pd-1单抗的组合；(4)serpinb9抑制剂重组载体与pd-l1/pd-1单抗的组合。
29、本发明第八方面，提供了serpinb9抑制剂或抑制剂重组载体在制备pd-l1/pd-1单抗增强剂中的应用。
30、pd-l1/pd-1通路的抑制策略不仅适用于胰腺导管腺癌，也已被用于多种癌症类型，包括乳腺癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌。因此，serpinb9抑制剂或抑制剂重组载体与pd-l1/pd-1单抗联用，不仅适用于胰腺导管腺癌，也适用于采用pd-l1/pd-1通路的抑制策略的其他癌种。
31、本发明第九方面，提供了抗肿瘤的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗有效量的serpinb9 shrna制剂和/或其抑制剂。优选，在给予本技术的serpinb9 shrna和/或其抑制剂之前、之时或之后给予其他抗肿瘤药物，如pd-l1/pd-1单抗。
32、本发明的给药方式多样，包括口服、注射(例如直接裸dna或蛋白质注射法、脂质体包裹dna、rna或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、经静脉、肺部、黏膜、鼻腔、腹腔内、颅内、瘤内、舌下、颊部、透皮给药。
33、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
34、就技术而言，serpinb9的检测本质上是一种western blot(wb)和免疫组化染色(ihc)技术，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。
35、本发明揭示了serpinb9分子在胰腺癌分期诊断、预后评估、治疗靶点中的新用途，为serpinb9的研究和开发利用提供了新的思路和途径。本发明首次公开了通过抑制serpinb9增强胰腺肿瘤pd-l1/pd-1单抗治疗效果的联合治疗策略，从而为采用pd-l1/pd-1单抗治疗效果不佳的肿瘤治疗提供了一种新的思路和途径。
1.检测serpinb9表达量的试剂在制备胰腺导管腺癌分期诊断或预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测serpinb9表达量的试剂为检测生物样品中serpinb9含量的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物样品选自肿瘤的组织、细胞或体液样品，
3.一种胰腺导管腺癌的分期诊断或预后评估试剂盒，该试剂盒包含了检测生物样品中serpinb9含量的试剂。
4.根据权利要求3所述的胰腺导管腺癌的分期诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，所述检测serpinb9表达量的试剂选自：对serpinb9具有检测特异性的探针、基因芯片、pcr引物、抗体、蛋白质芯片或化学小分子。
5.serpinb9抑制剂在制备胰腺导管腺癌治疗药物中的应用，其特征在于，所述serpinb9抑制剂选自如下任一种物质：降低serpinb9表达水平、降低serpinb9活性或促进serpinb9代谢的物质。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述serpinb9抑制剂与其他治疗药物联用，所述其他治疗药物为pd-l1/pd-1单抗。
8.一种serpinb9抑制剂重组载体，其特征在于，包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的serpinb9的sgrna及crisper-cas9 mrna、serpinb9 sirna、serpinb9 shrna或strip反义核苷酸。
9.一种胰腺导管腺癌治疗药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学或免疫学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，
10.serpinb9抑制剂或抑制剂重组载体在制备pd-l1/pd-1单抗增强剂中的应用，其特征在于，所述serpinb9抑制剂选自如下任一种物质：降低serpinb9表达水平、降低serpinb9活性或促进serpinb9代谢的物质。
