本发明属于生物，涉及肺炎克雷伯菌感染下的奶牛乳腺组织铁死亡模型的建立方法和应用。
背景技术：
1、铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化物蓄积导致的细胞死亡方式，参与多种感染性疾病的发展过程。肺炎克雷伯菌是奶牛乳腺炎中常见的病原菌之一，而对其能否诱导铁死亡未见报道。目前铁死亡在感染中的研究通常使用脂多糖构建模型，采用细菌感染构建铁死亡模型的较为少见，而奶牛临床型乳房炎大部分由细菌感染引起，因此目前奶牛乳房炎模型无法完全模拟临床乳房炎的发病过程，不能满足对乳房炎的致病机理研究。奶牛乳腺上皮细胞体外感染实验是目前常用于探究奶牛乳房炎的模型，但不能完全模拟奶牛体内感染诱导的铁死亡。此外，传统乳房炎检测指标中，对感染导致的铁代谢紊乱无检测方法。同时，奶牛铁死亡模型尚未报道。
技术实现思路
1、针对现有铁死亡动物模型的空白，本发明采取肺炎克雷伯菌感染的方式诱导铁死亡，为铁死亡研究提供一种模型性能稳定、见效快、适用性广的奶牛乳腺铁死亡模型构建方法。
2、本发明提供经乳导管注射肺炎克雷伯菌液诱导奶牛乳腺组织铁死亡方法的建立方法和应用，该方法操作简单，可成功在奶牛乳腺组织中诱导铁死亡，重复性高。
3、为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
4、一种奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，包括以下步骤：挤奶后，将消毒后的乳头经乳导管在左后乳区注射含肺炎克雷伯菌的生理盐水，作为感染组，右后乳区注射无菌生理盐水作为对照组；感染一段时间后，将奶牛麻醉后采集乳腺组织，立即将部分乳腺组织转移到甲醛溶液中，并收集剩余组织放入低温保存管中保存。
5、进一步的，采用碘伏将乳头消毒。
6、进一步的，所述含肺炎克雷伯菌的生理盐水中，肺炎克雷伯菌的浓度为108cfu/ml。
7、进一步的，感染组和对照组的注射量均为5ml，为一次性注射。
8、进一步的，注射后，按摩乳头根部，促进肺炎克雷伯菌分布。
9、进一步的，感染24h后，对奶牛乳腺进行采样。
10、进一步的，采用盐酸赛拉嗪对奶牛进行麻醉。
11、进一步的，所述切下乳腺组织的方法包括：将麻醉后的奶牛侧卧固定于六柱栏内，采样乳区朝上，乳腺及大腿内侧区域剃毛碘伏消毒，3min后酒精脱碘；手术刀切开距乳头基部7-10cm处的下1/3乳腺皮肤，暴露乳腺组织筋膜，组织镊夹起乳腺组织，使用手术刀将乳腺组织切下。
12、进一步的，采样结束后，试验奶牛安置在独立的圈舍中，每日术部进行碘伏消毒，涂抹红霉素软膏，肌肉注射头孢噻呋钠，术后14d拆除缝合线。
13、本发明还提供上述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法在制备奶牛铁死亡药物中的应用。
14、有益效果
15、奶牛作为常见的经济动物，未有确定在奶牛乳腺组织中定义铁死亡的方法。本发明在消毒奶牛乳头后，将5ml浓度为108cfu/ml的肺炎克雷伯菌液，经乳导管注入奶牛乳腺腺泡中，并充分按摩乳头基部促进肺炎克雷伯菌液在乳腺内的分布。感染24h后，麻醉后采集奶牛乳腺组织，进行组织学和蛋白印迹检测。结果显示，肺炎克雷伯菌感染的乳腺腺泡内炎性细胞浸润，铁水平升高，脂质过氧化物蓄积，铁死亡相关标志蛋白水平显著变化，表明模型构建成功。
16、本发明首次使用奶牛乳腺来定义和研究铁死亡现象，利用肺炎克雷伯菌感染奶牛乳腺，然后利用普鲁士染色和免疫组织化学法来定义铁死亡组织。本发明发现，肺炎克雷伯菌感染都能明显地增加奶牛乳腺腺泡内铁的蓄积，诱使脂质过氧化物水平明显增加，改变了铁死亡相关标志蛋白的表达。本发明采取肺炎克雷伯菌感染的方式诱导铁死亡，为铁死亡研究提供一种模型性能稳定、见效快、适用性广的奶牛乳腺铁死亡模型构建方法。本发明所述模型构建方法具有便利、快捷、成功率高，易重复等优点，能够实现铁死亡在个体水平的定性和定量，使奶牛乳腺组织能够成为便利的模型来研究铁死亡现象。
1.一种奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：挤奶后，将消毒后的乳头经乳导管在左后乳区注射含肺炎克雷伯菌的生理盐水，作为感染组，右后乳区注射无菌生理盐水作为对照组；感染一段时间后，将奶牛麻醉后采集乳腺组织，将部分乳腺组织转移到甲醛溶液中，并收集剩余组织放入低温保存管中保存。
2.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，采用碘伏将乳头消毒。
3.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，所述含肺炎克雷伯菌的生理盐水中，肺炎克雷伯菌的浓度为108cfu/ml。
4.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，感染组和对照组的注射量均为5ml，为一次性注射。
5.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，注射后，按摩乳头根部，促进肺炎克雷伯菌分布。
6.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，感染24h后，对奶牛乳腺进行采样。
7.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，采用盐酸赛拉嗪对奶牛进行麻醉。
8.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，所述切下乳腺组织的方法包括：将麻醉后的奶牛侧卧固定于六柱栏内，采样乳区朝上，乳腺及大腿内侧区域剃毛碘伏消毒，3min后酒精脱碘；手术刀切开距乳头基部7-10cm处的下1/3乳腺皮肤，暴露乳腺组织筋膜，组织镊夹起乳腺组织，使用手术刀将乳腺组织切下。
9.根据权利要求1所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法，其特征在于，采样结束后，试验奶牛安置在独立的圈舍中，每日术部进行碘伏消毒，涂抹红霉素软膏，肌肉注射头孢噻呋钠，术后14d拆除缝合线。
10.权利要求1～9任一项所述的奶牛乳腺铁死亡模型的建立方法在制备奶牛铁死亡药物中的应用。
