本发明涉及制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的改进的方法。
背景技术：
1、制备明确定义的生物分子溶液的能力是基于生物分子的药物制剂开发过程中的重要方面。生物分子稳定性、离子强度、ph值和生物分子浓度以及生物分子完整性是要控制的主要参数。
2、作为可能的生物分子的代表，特别是蛋白质将在以下讨论中被考虑，特别是以下科学文献和专利公开。
3、已知通过赋形剂的存在改善蛋白质稳定性，所述赋形剂以某种方式与溶液中的蛋白质相互作用以稳定和溶解它并避免聚集体的形成。在通常的蛋白质制剂中，常用的赋形剂是例如盐化合物或其他离子物质、糖和洗涤剂。特别是关于药物制剂，蛋白质的稳定性和溶解性取决于制剂。
4、已知基于蛋白质的药物产品的稳定性是溶液条件(例如ph值和离子强度以及赋形剂的种类和浓度)的函数(garidel p.,bassarab s.(2008),impact of formulationdesign on stability and quality,in:quality for biologics:critical qualityattributes,process and change control,production variation,characterisation,impurities and regulatory concerns pp.94-113,publishing,london,uk)。这适用于液体和固体(例如冻干或喷雾干燥)的蛋白质制剂(schersch k.,betz o.,garidel p.,muehlau s.,bassarab s.,winter g.(2013),systematic investigation of the effectof lyophilizate collapse on pharmaceutically relevant proteins iii:collapseduring storage at elevated temperatures,european journal of pharmaceutics andbiopharmaceutics:official journal of arbeitsgemeinschaft für pharmazeutischeverfahrenstechnik e.v,85(2),240-252)。
5、蛋白质和赋形剂之间的相互作用通常非常复杂，通常无法预测蛋白质性质和稳定性(例如hoffmann c.,blume a.,miller i.,garidel p.,insights into protein-polysorbate interactions analysed by means of isothermal titration anddifferential scanning calorimetry,(2009),european biophysics journal,38(5),557-568kamerzell t.j.,esfandiary r.,joshi s.b.,middaugh c.r.,volkin d.b.(2011),protein-excipient interactions:mechanisms and biophysicalcharacterization applied to protein formulation development,advanced drugdelivery reviews,63(13),pp.1118-1159以及许多其他更多)。例如，roberts及其同事研究了特定离子(氯化钠、氯化钙、硫酸钠和硫氰酸钠)和缓冲剂(乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸、琥珀酸盐和tris)在单克隆抗体中对蛋白质-蛋白质相互作用的影响(roberts d.,keeling r.,tracka m.,van der walle c.f.,uddin s.,warwicker j.,curtis r.(2015),specific ion and buffer effects on protein-protein interactions of amonoclonal antibody,molecular pharmaceutics 2015,12,179-193)。这些相互作用影响蛋白质溶解度、蛋白质颗粒的形成和总蛋白质胶体稳定性(garidel p.,blume a.,wagnerm.,prediction of colloidal stability of high concentration proteinformulations,(2015),pharmaceutical development and technology,20(3),pp.367-374)。
6、在制造过程中，蛋白质溶液可能必须多次修饰以促进单元操作、储存和/或配制。每个阶段都可能涉及使用广泛描述为过滤的工艺-超滤(uf)、尺寸排阻色谱(sec)、渗滤(df)和逆流透析-单独或组合使用的溶液交换。这些方法有助于调节蛋白质并将溶液条件改变到特定范围(janson h.-c.(ed.).(2011),protein purification,3rd edition,wiley,new jersey)。
7、调节和制备蛋白质溶液的最常用方法，特别是在工业规模上，是超滤/渗滤(下文也简称为uf/df)的组合(参见例如brose d.j.,dosmar m.,jornitz m.w.(2002),membranefiltration,pharmaceutical biotechnology,14,pp.213-279)。事实上，uf/df广泛用于下游加工，以浓缩蛋白质、交换缓冲溶液、为下游过程如色谱等调节蛋白质，并在制剂所需的浓度和缓冲溶液中回收蛋白质(marshak d.r.,kadonaga j.t.,burgess r.r.,knuthm.w.,brennman w.a.,lin s.-h.(1996),protein purification and characterisation,cold spring harbor laboratory press)。超滤/渗滤(uf/df)是通常用于调节ph值、改变溶液的离子分布/赋形剂组成和/或达到目标蛋白质浓度的方法。
8、uf/df通常在切向流过滤(下文中也简称为“tff”)模式下进行，其也称为交叉流动，其中进料-溶液流平行于膜并因此垂直于滤液流动。这种设置沿着膜表面扫描保留的分子，从膜室中扫出并返回到渗余物容器-提供比死端操作显著更高的过程通量(flickinger,m.c.(ed.)(2013),downstream industrial biotechnology,john wiley&sons,hoboken ney jersey)。
9、tff通常在膜的上游表面产生浓差极化、形成高浓度梯度和高浓度的溶质的边界层。因此，蛋白质吸附、变性、聚集或沉淀可能会污染膜(field r.(2010),fundamentals offouling,in:peinemann k.-v.,pereira nunes s.,membranes for water treatment,volume 4,wiley-vch verlag gmbh&co.kgaa,weinheim,chapter 1,1-23)。最终，这些系统的性能几乎完全取决于保留的溶质从膜上运走并返回到本体溶液中的速率(bowen w.r.,jenner r.(1995),theoretical descriptions of membrane filtration of colloidsand fine particles:an assessment and review,adv.colloid interface sci 56,141-200)。这种现象称为浓差极化。
10、参考图1a，示出了渗滤(df)步骤的示意图。渗滤是一种使用可渗透或多孔膜过滤器从含有生物分子的溶液中除去、替换或降低盐或溶剂浓度的技术。该方法使用膜过滤器根据其分子大小分离溶液和悬浮液的组分。由膜保留的溶液称为浓缩物或渗余物。穿过膜的溶液称为滤液或渗透物。在渗滤中，原料在膜上重复循环并返回到渗余物容器，在其中加入新的液体介质如缓冲剂，同时除去渗透物。如图1a所示，渗滤介质对应于添加到系统中的进料介质，而渗透物是从系统中除去的过滤介质。
11、在图1b中，示出了超滤(uf)步骤的示意图。超滤本身遵循相同的概念，并且基于与图1a中的渗滤所示相同的示意性设置，但没有添加新的液体介质。
12、超滤以及渗滤过程是广泛熟知的并在现有技术中有所描述：
13、例如，marichal-gallardo p.a.,alvarez m.m.(2012),state-of-the-art indownstream processing of monoclonal antibodies:process trends in design andvalidation,biotechnology progress,28,899-916和wo 2014/130064a1公开了缓冲剂交换步骤，其中含有感兴趣的蛋白质的溶液对水进行渗滤。
14、此外，在ca 2 643 508 a1中描述了一种用于获得具有高结合分子能力的人白蛋白溶液的方法，其包括：
15、a)第一透析(渗滤)；
16、b)用nacl和一种或多种氨基酸稳定溶液，不添加脂肪酸；
17、c)加热溶液(巴氏灭菌)；和
18、d)第二透析(渗滤)。
19、也就是说，渗滤步骤的组合，例如，用于使患者的血液或血浆中的白蛋白解毒，目的是除去与白蛋白结合的物质。在这两个渗滤步骤之间，加热白蛋白，即通过巴氏灭菌进行病毒灭活的步骤，其中白蛋白在至少一种氨基酸和氯化钠存在下稳定。该方法允许除去与白蛋白结合的化合物，如脂质、脂肪酸，因为这些化合物降低白蛋白的结合能力。在本发明中不进行第一和第二渗滤之间的溶液加热。
20、此外，wo 91/00290 a1涉及一种从与蛋白质结合的多价金属离子中纯化蛋白质的方法，这些离子通过将离子与一价金属离子交换而从蛋白质中释放，然后除去多价金属离子。特别是通过渗滤或凝胶过滤的方法实现这些离子的释放和除去。特别是，对于从与蛋白质结合的多价金属离子(例如铝、铁或铅)清洁蛋白质如白蛋白和γ-球蛋白，使用两种凝胶过滤步骤的组合，包括高达1m的水和盐溶液，以除去多价金属离子并将它们与钠、钾或铵离子交换。然而，通过对与该方法的描述相关的所呈现的图的分析，不清楚凝胶过滤方法如何运行。此外，该文献描述了金属离子的清洁，但是对于有机离子例如磷酸根离子、琥珀酸根离子、乙酸根离子和含有这些有机离子的蛋白质溶液的控制，它是完全无法处理的。
21、根据wo 2002/051979 a2，提供了一种通过将含有蛋白质的溶液的ph调节至ph约7至约10而从蛋白质中除去柠檬酸根、铝、多价离子和污染物的方法，对水溶液与纯水进行渗滤以提供包含多价离子的滤液和包含该蛋白质的渗余物。在一个实施方案中，描述了在同一容器中进行两个渗滤步骤的非常具体的方法(参见权利要求11)。所使用的方法参数以及与超滤步骤相结合的渗滤步骤，特别是本发明公开的方法步骤顺序的安排没有清楚地描述。
22、此外，现有技术的一些文献涉及浓缩大分子的方法：
23、例如，wo 02/096457 a2涉及适用于肠胃外施用的稳定的抗体液体制剂。还提供了具有高度浓缩的治疗性抗体的水溶液，其可用于生产稳定液体制剂的治疗性液体制剂、用途，例如医学用途，并提供了制备稳定液体制剂的方法。制备治疗性液体制剂的方法包括浓度大于50mg/ml的抗体，其中在第一步中将合适缓冲剂中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml的浓度；在第二步中，将第一步中得到的浓缩溶液用至少一种酸性组分的水溶液渗滤，所述酸性组分任选地含有mgcl2和/或cacl2和/或其它合适的添加剂；以及，在第三步中，将第二步中得到的溶液进一步浓缩至浓度大于50mg/ml。因此，该方法使用浓缩步骤/渗滤步骤/浓缩步骤的顺序。浓缩步骤可以用超滤系统进行。为了提供较少混浊的溶液，描述了另外的5步骤方法，其涉及浓缩/渗滤/浓缩/渗滤/浓缩，以调节含有添加剂(例如mgcl2和/或cacl2和/或其他添加剂)的最终制剂。
24、在wo 2004/042012 a2中，还提出了浓缩大分子的方法。其提供了一种从含有溶液组分的起始水溶液中浓缩大分子的方法，该溶液组分包含高分子和有机聚合物，该方法包括：
25、(1)对起始水溶液进行超滤以浓缩大分子，从而产生第一渗余物溶液，
26、(2)调节第一渗余物溶液的电导率，使得有机聚合物诱导的溶液组分的沉淀基本上被阻止或基本上反转，以产生第二渗余物溶液，和
27、(3)对第二渗余物溶液进行超滤以进一步浓缩大分子，从而产生浓缩溶液。根据实施方案，可以通过与水、合适的稀释剂或缓冲剂进行渗滤来调节电导率，使得该方法可以以超滤(uf)/渗滤(df)/超滤(uf)步骤的组合进行。起始材料包括大分子和有机聚合物，例如pluronicf-68。
28、此外，已知超滤(uf)/渗滤(df)的组合可用于浓缩抗体，如wo 2006/031560 a2示例性所示。在该文献中，描述了制备高度浓缩的抗体组合物的方法，包括：第一超滤第一抗体制备物以提供第二抗体制备物；渗滤第二抗体制备物以提供渗滤的中间抗体制备物；和第二超滤渗滤的中间抗体制备物，以提供第三抗体制备物；其中第一超滤、第二超滤和渗滤中的一步或多步在约30℃至约50℃完成。因此，提出了一种浓缩蛋白质的方法，包括超滤(uf)、渗滤(df)和第二超滤(uf)顺序列，其中所有步骤均在升高的温度进行，例如高于约30℃，在方法步骤中要观察的特定的温度是必不可少的。
29、另外，wo 2009/073569 a2公开了包含水和蛋白质的水制剂，以及制备它们的方法。该发明的水制剂可以是高蛋白质制剂和/或可具有低水平的导电性，这是由低水平的离子赋形剂引起的。它也提供了一种制备包含蛋白质和水的水性制剂的方法，该方法包括：
30、a)在第一溶液中提供蛋白质；和
31、b)使用水作为渗滤介质对第一溶液进行渗滤，直至达到与水的至少五倍体积交换，从而制备水制剂。
32、因此，在渗滤(df)步骤期间的纯水也用于df/uf顺序中以产生具有低电导率的高度浓缩的蛋白质的溶液。然而，根据我们的经验，当生物分子带正电时，即使大的渗滤体积也可能不足以完全除去阴离子赋形剂。
33、因此，已经描述的现有技术中已知的传统uf/df方法通常包括三个步骤。这种已知的3步uf/df过程如图2所示。它显示使用两种超滤uf1和uf2调节和浓缩蛋白质溶液的uf/df方法的示意图，并且在这两种超滤步骤之间进行一个渗滤步骤df1。
34、图2的三个步骤是：
35、1.uf1：超滤，将蛋白质溶液浓缩至例如最终目标值的三分之一至二分之一；
36、2.df：渗滤，通常在几个循环中进行，针对纯水以除去初始赋形剂；和
37、3.uf2：超滤，以将蛋白质溶液浓缩至所需的最终水平。
38、关于这种uf/df方法，方法开发人员和制剂设计师通常假定a)所得溶液的赋形剂谱将被明确定义，b)最终的赋形剂谱将与介质-交换溶液的制剂或渗滤介质匹配，和c)超滤将去除残留的赋形剂，而渗滤将完全避免残留的残留物。
39、然而，已发现现有技术的传统三步uf/df方法具有不充分的性能。虽然上述假设可能适用于非常低的蛋白质浓度，例如<<80mg/ml，但我们的研究表明，使用用水的渗滤步骤获得高蛋白质浓度的三步uf/df具有以下缺点：浓度为例如4至10mm的初始缓冲离子的残留水平仍保留在溶液中。然而，许多产生的生物分子，例如单克隆抗体，需要具有确定的赋形剂含量的高度浓缩的的制剂(例如70mg/ml或更多)。因此，已知的uf/df方法不能提供所需的质量标准，并且不能满足基于生物分子或基于蛋白质的制剂开发期间的永久增加的要求。
40、此外，如现有技术中已经显示和证明的那样，从含有生物分子如含有蛋白质的溶液中除去带电离子并不简单。正如研究中所讨论的那样(例如donnan f.g.(1911),thetheory of membrane equilibrium and membrane potential in the presence of anon-dialyzable electrolyte,a contribution to physical-chemical physiology,zeitschrift für elektrochemie und angewandte physikalische chemie 17(10),572-581；donnan f.g.(1927),concerning the applicability of thermodynamics to thephenomena of life,j.general physiology 8,685-688)带电离子穿过半透膜的不对称分布产生电势；影响取决于总离子浓度，更确切地说，取决于系统中的离子活度(stonerm.r.,fischer n.,nixon l.,buckel s.,benke m.,austin f.,randolph t.w.,&kendrickb.s.(2004),protein-solute interactions affect the outcome of ultrafiltration/diafiltration operations,j.pharm.sci.93,2332-2342)。在总的可扩散离子浓度低的情况下，赋形剂离子和蛋白质之间的静电相互作用的影响相对较大(甚至包括蛋白质-赋形剂复合物的形成)，并且清除赋形剂离子变得困难。简而言之，跨膜电势抑制带电缓冲组分的自由交换。因此，预期用于去除这些离子的简单分离方法是不成功的。
41、具有恒定渗余物(retentate)体积的渗滤，如图1a所示，是最常见的方法。假设恒定的筛分系数，不同溶质的质量平衡考虑导致开发用于计算小分子清除率的模型(vanreis r.,zydney a.l.(2013),protein ultrafiltration,in:flickinger mc.(ed.)downstreamindustrial biotechnology:recovery and purification,1st ed,john wley&sons)中：
42、c ＝ c0 exp (-n·s) (1)
43、其中c是以g/l表示的最终蛋白质浓度，c0是以g/l表示的初始蛋白质进料浓度，n是透析体积(diavolume)的数量，s是小分子筛分系数。透析体积是总收集的滤液或渗透物(permeate)体积与恒定进料体积之间的比率(kurnik r.t.,yu a.w.,blank g.s.,burtona.r.,smith d.,athalye a.m.,van reis r.(1995),buffer exchange using sizeexclusion chromatography,countercurrent dialysis,and tangential flowfiltration:models,development,and industrial application,biotechnology andbioengineering,45(2),149-157)。筛分系数描述了滤液和渗余物中溶质浓度的比率。在自由溶质流动的理想情况下，小分子的渗透作为透析体积的函数在对数刻度上显示线性溶质减少，筛分系数达到1。等式1通常用于确定将小分子和杂质减少到特定水平所需的透析体积或循环数(harinarayan c.,skidmore k.,kao y.,zydney a.l.,van reis r.(2009),small molecule clearance in ultrafiltration/diafiltration in relation toprotein interactions:study of citrate binding to a fab,biotechnology andbioengineering,102(6),1718-1722)。然而，该等式不考虑非平衡状态。
44、在介质交换涉及添加新组分i的情况下，c根据以下公式计算：
45、c ＝ ci [1-exp (-n)] (2)
46、其中ci是在渗滤过程中加入的组分i的本体(bulk)浓度。s假定为1。
47、然而，在实践中，渗滤通常需要比等式1和2更多的透析体积交换，这表明将杂质减少到给定水平。然而，增加渗滤循环的次数会增加处理时间，并且取决于蛋白质，会损害蛋白质稳定性并引发聚集体形成。
48、正如harinarayan et al.(同前文献)报道，蛋白质-赋形剂相互作用和蛋白质-杂质相互作用可能影响小分子清除率。例如，raibekas et al.(raibekas a.a.,bures e.j.,siska c.c.,kohno t.,latypov r.f.,kerwin b.a.(2005),anion binding andcontrolled aggregation of human interleukin-1receptor antagonist,biochemistry,44(29),9871-9879)描述了阴离子如焦磷酸根、柠檬酸根和磷酸根与人重组白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1ra)的结合。估计的解离常数在毫摩尔范围内，并且结合强度与阴离子大小和每分子的离子化基团数相关。这些研究将结合位点鉴定为单个il-1ra簇上的特异性带正电荷的赖氨酸氨基酸(raibekas et al.，同前文献)。已知其他蛋白质-包括钙调蛋白、乳酸脱氢酶、柠檬酸合酶、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶-与柠檬酸根结合(neufeld t.,eisenstein m.,muszkat k.a.,&fleminger g.(1998),a citrate-bindingsite in calmodulin,journal of molecular recognition 11,20-24)。这种赋形剂-蛋白质相互作用甚至可以导致相分离：esue et al.(esue o.,kanai s.,liu j.,patapofft.w.,shire s.j.(2013),carboxylate-dependent gelation of a monoclonalantibody,pharm.res.26(2009)2478-2485)描述了单克隆抗体的羧酸根依赖性凝胶化。
49、shao和zydney(shao j,zydney a.l.(2004a),optimization ofultrafiltration/diafiltration processes for partially bound impurities,biotechnology and bioengineering,87(3),286-292；shao j.,zydney a.l.,(2004b),retention of small charged impurities during ultrafiltration,biotechnologyand bioengineering,87(1),7-13)显示杂质和大分子(如蛋白质)之间的结合相互作用如何显著降低杂质清除率。因此，需要大量增加透析体积以获得给定水平的杂质去除。他们提出了一个分析表达式，用于计算适应蛋白质-赋形剂相互作用的最佳渗滤步骤。他们还指出这些相互作用降低了可用于最佳渗滤的蛋白质浓度。shao和zydney建议稀释进料溶液以反向驱动结合反应以增加“游离”杂质的浓度，从而减少总的超滤/渗滤过程时间。
50、基于这样的反应和来自等式1的模型，harinarayan et al.(同前文献)发现测试的抗体片段(fab)和三价柠檬酸根之间的特异性静电相互作用(而在fab和单价乙酸根之间未观察到相互作用)(harinarayan et al.同前文献)。
51、还应记住，uf/df步骤，特别是涉及高度浓缩的蛋白质制剂时，会增加蛋白质电荷密度，从而增加蛋白质-赋形剂的静电相互作用。这些与donnan效应有关，其中大的带电分子聚集在膜的一侧，在其上产生电荷梯度(例如donnan f.g.,(1927),concerning theapplicability of thermodymaics to the phenomena of life,j.general physiology8,685-688；donnan f.g.(1930),theorie der gleichgewichtsionenverteilung beieinem gelsystem mit mizellenverteilung,kolloid-zeitschrift 51,24-27)。因此，donnan效应在非透析性电解质的膜平衡和膜电位中起特别突出的作用(brezesinski g.,h.s.,und kolloide,(1993),physikalisch-chemische grundlagen,spekrum akademischer verlag heidelberg,berlin,oxford)。
52、各种研究人员尝试开发结合donnan效应的理论模型，以更好地预测蛋白质溶液(例如单克隆抗体)中的赋形剂和ph变化(例如van reis r.,goodrich e.m.,yson c.l.,frautschy l.n.,whiteley r.,zydney a.l.,(1997),constant c(wall)ultrafiltrationprocess control,journal of membrane science,130(1-2),123-140)。然而，迄今为止，这些努力尚未完全成功，特别是在生物分子和要除去的赋形剂具有相反电荷的情况下。
53、为了生产高度浓缩的的生物分子制剂，在已经提到的现有技术中，已经在超滤/渗滤(uf/df)步骤中使用了纯水，或者已经添加了赋形剂例如甘氨酸或聚乙二醇以影响蛋白质溶剂化。然而，常规方法-用纯水渗滤以从含有生物分子的溶液(例如蛋白质溶液)洗涤所有赋形剂，然后进行超滤步骤以浓缩生物分子溶液-并不总是导致明确定义的制剂。一些赋形剂组分被残留。
54、例如，进行了一项测试，发现含有琥珀酸根/氯化钠的～10mg/ml蛋白质溶液即使在常规uf/df(用纯水进行多达20次渗滤循环以及10倍至14倍蛋白质浓缩)后仍保留可测量的残留赋形剂。从25mm琥珀酸根、ph6开始，该方法在最终～100mg/ml蛋白质浓度导致～4-5mm琥珀酸根的残留。另一个试验开始于ph5.5的25mm乙酸根缓冲剂的起始溶液；在用纯水的15次渗滤循环和10倍蛋白质浓缩后，最终产物仍含有高达10mm乙酸根。
55、因此，对于两个简要描述的测试，不可能完全除去初始缓冲赋形剂。在现有技术中(steele and arias(2014)accounting for the donnan effect in diafiltrationoptimization for high-concentration ufdf applications,internationalbioprocess 12(1),january 2014,50-54)，使用了多达40个透析体积用于除去99.995％的某些未披露的赋形剂。这从实际和经济的观点来看，不是一个合理的程序。
56、残留(carryover)程度取决于例如初始生物分子溶液的ph、生物分子-赋形剂相互作用和渗滤体积的数量。用纯水渗滤，即使有大量循环(约20-25)，也不能消除阴离子赋形剂如琥珀酸根和乙酸根的残留。在实践中，清除赋形剂所需的透析体积交换次数基本上超过了由上述等式1(用于计算渗滤的小分子清除的数学模型)计算的数量。此外，本领域技术人员必须记住，增加渗滤循环可能对蛋白质完整性产生负面影响并增加处理时间。
57、因此，本发明的一个目的是克服现有技术的缺陷并提供一种改进的方法，该方法允许制备含有生物分子，特别是蛋白质的明确定义的高度浓缩的制剂，用于药物或非药物用途。
58、本发明的另一个目的是使用该方法提供一种更纯净的液体生物分子制剂产品，该方法与现有技术方法相比可以更容易和更快地纯化，由此赋形剂，特别是阴离子赋形剂的残留程度减少甚至最小化。
59、本发明的另一个目的是提供一种方法，其中清除(一种或多种)赋形剂所需的透析体积交换次数在合理的范围内，以便不损害生物分子的稳定性和引发聚集体形成。
60、本发明的又一个目的是提供一种大规模可行的方法，以合理的成本提供所需的质量标准和操作效率。
技术实现思路
1、令人惊奇的是，发现可以克服现有技术中已知的缺点，特别是如果在采用第二渗滤(df2)之前用确定高离子强度的液体介质进行额外的渗滤步骤df1，可以显著减少或完全避免残留问题。
2、因此，为了克服上述缺点，提供了改进的和修改的双超滤和渗滤uf/df方法。本发明的制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法包括以下步骤：
3、(a)第一超滤uf1；
4、(b)第一渗滤df1；
5、(c)第二渗滤df2；和
6、(d)第二超滤uf2；
7、其中一种或多种盐的水溶液，作为液体介质b，用于步骤(b)，且水或一种或多种盐的水溶液，作为液体介质c，用于步骤(c)，其中用于步骤(b)中的一种或多种盐与用于步骤(c)的一种或多种盐相同或不同，并且其中液体介质b的离子强度高于液体介质c的离子强度。
8、在本发明的框架中的表述“含有生物分子的高度浓缩的液体制剂”应理解为(一种或多种)生物分子以70mg/ml或更高、或80mg/ml或高、或85mg/ml或更高的浓度存在于液体制剂中。
9、发现本发明的方法始终如一地降低起始液体生物分子制剂中存在的不需要的赋形剂的水平，优选低于检测极限，并产生所含生物分子的稳定液体制剂。如果生物分子被选定为蛋白质，则该方法产生仅具有足够的交换介质抗衡离子的溶液以平衡蛋白质的固有电荷并允许蛋白质自我缓冲。通常发现生物分子完整性和生物分子质量是可接受的或完全不变的。
10、此外，完全出乎意料的是，在溶液条件下，可以在本发明的方法中除去起始液体生物分子制剂中存在的任何种类的不想要的(一种或多种)赋形剂，例如(一种或多种)带正电的赋形剂、(一种或多种)带负电的赋形剂和(一种或多种)中性赋形剂。
11、根据本发明的方法的另一个优点在于，就施加在蛋白质上的物理应力而言，它是非常温和的。这可以通过整个方法步骤中的高度单体含量得出。
1.一种制备含有生物分子的高度浓缩的液体制剂的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1的方法，其特征在于
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于
4.根据前述权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于
5.根据权利要求4的方法，其特征在于
6.根据权利要求5的方法，其特征在于
7.根据前述权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于
8.根据前述权利要求7的方法，其特征在于
9.根据前述权利要求7或8中任一项的方法，其特征在于
10.根据权利要求9的方法，其特征在于
