本发明属于基因工程，具体涉及一种人aβ42短肽过表达载体及其构建方法和应用，是利用分子克隆技术构建aβ42短肽过表达载体及其在n2a细胞系中的应用。
背景技术：
1、aβ42是一种β淀粉样蛋白的一种形式，它是由42个氨基酸组成的短肽。在疾病状态下，β前体蛋白（app）会通过β-分泌酶和γ-分泌酶异常裂解，释放淀粉样β (aβ) 肽aβ40和aβ42，其中aβ42的数量最多，神经元毒性更大。
2、在阿尔茨海默病中，aβ42被认为是一种重要的致病物质，因为它在大脑中形成了可溶性和不可溶性的斑块，导致神经元损伤和认知功能下降。aβ42的沉积会导致神经元的毒性，干扰神经元之间的正常通信，并最终导致神经元的死亡。因此，aβ42短肽和aβ沉积之间存在密切的关系，对于阿尔茨海默病（ad）的发病机制和治疗具有重要意义。
3、细胞模型能在微观层面研究ad的发病机制，目前研究常采用aβ1-42、aβ25-35诱导细胞建立aβ相关的ad细胞模型。但是蛋白转染存在转染率低，细胞模型不稳定等因素。基因转染技术转染细胞在一定程度上可以提高细胞病理表达的准确性。有学者通过app质粒转染sh-sy5y细胞建立app高表达的ad细胞模型，转染后检测到细胞内app和aβ的表达均增加（ 崔 理立,蔡玉洁,刘根,等.慢病毒载体介导的app695过表达sh-sy5y细胞系的构建和鉴定[j]. 广东医学院学报, 2014, 032(004):435-438.）。专利cn113462650a将app695基因和ps1-de9基因与慢病毒表达载体连接构建成重组质粒后通过慢病毒导入，经过筛选培养获得能稳定表达app695基因和ps1-de9基因的细胞株。cn112980887a构建包含有appswe695蛋白编码基因的重组载体，采取慢病毒转染的方式app蛋白的编码基因整合到宿主细胞的基因组中，构建了过表达app基因的cho 和hff细胞系作为ad细胞模型。
4、n2a细胞系是一种常用的小鼠神经母细胞瘤细胞系，常被用于神经生物学研究。这种细胞系最早是从小鼠神经母细胞瘤中分离出来的，具有神经元样的特征，包括神经突起和电生理特性。n2a细胞系广泛应用于研究神经细胞的生长、分化、突触形成等过程，以及神经退行性疾病的研究。由于其易于培养和操纵，n2a细胞系成为了神经生物学研究中的重要工具。n2a细胞经造模试剂诱导后常出现aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、氧化损伤、细胞凋亡等ad样的病理学特征。n2a/app695细胞是用人app基因稳定转染的n2a细胞，无需造模试剂诱导即可产生更多的app，随后被切割成aβ40、aβ42，被广泛用于淀粉样体发生途径产生aβ的细胞模型。
5、上述ad细胞模型虽然都能过表达aβ42，但由于app酶解后产生多种类型的aβ多肽，不利于研究aβ42蛋白与ad疾病的直接相关性。目前还没有通过基因转染技术构建直接过表达aβ42短肽的细胞模型的相关报道。
技术实现思路
1、基于目前ad细胞模型存在的问题，本发明旨在构建一种aβ42过表达质粒载体、细胞模型及其构建方法。
2、本发明根据过表达载体的设计原则，将人aβ42基因cds扩增，构建了aβ42过表达质粒载体，并转染n2a细胞，通过提取n2a细胞的细胞蛋白，并经过elisa -aβ42检测，成功让n2a细胞系过表达了aβ42，构建了aβ42过表达的n2a/aβ42细胞模型。
3、本发明的技术方案如下：登录ncbi(the national center for biotechnologyinformation)网站检索人aβ42基因的cds序列。aβ42是由app（amyloid precursorprotein）的β-和γ-分泌酶酶切产生的。在这个过程中，app首先被β-分泌酶酶切，产生一个叫做c99（或β-ctf）的中间产物。c99被γ-分泌酶酶切，产生aβ肽，其中aβ42是其中的一种形式。
4、aβ42的cds如下：atggatgcagaattccgacatgactcaggatatgaagttcatcatcaaaaattggtgttctttgcagaagatgtgggttcaaacaaaggtgcaatcattggactcatggtgggcggtgttgtcatagcg（seq id no.1）。
5、本发明所提供的过表达载体，其aβ42的基因编码区位于pcmv-ha载体的cmv启动子下游。
6、本发明还提供了上述过表达载体的构建方法，具体包括如下步骤：
7、（1）根据aβ42的基因编码区设计扩增引物，以hek 293t细胞的逆转录cdna为模板，扩增获得aβ42的编码序列；
8、（2）采用双酶切法酶切pcmv-ha载体得到线性化载体；
9、（3）通过同源重组酶将线性化载体与aβ42的dna序列同源重组，测序，即得所述过表达载体。
10、上述扩增aβ42编码基因的扩增引物如下：
11、f-aβ42-bamhi：
12、5’-gtgccagattacgccggatccatggatgcagaattccgacat-3’
13、r-xhoi-aβ42：
14、5’-aacgggccctctagactcgagcgctatgacaacaccgcc-3’
15、其中f-aβ42-bamhi带有bamhi内切酶切割后的同源臂，r-xhoi-aβ42带有xhoi内切酶切割后的同源臂。
16、其中aβ42的cds位于pcmv-ha的cmv启动子原件之后，构建了aβ42-pcmv-ha的过表达质粒，通过sanger测序验证了序列的准确性。通过将aβ42-pcmv-ha通过lip2000转染到n2a细胞系中，并提取细胞蛋白进行elisa检测aβ42的水平发现aβ42显著高于转染空载质粒的n2a水平。
17、本发明还提供了上述过表达载体在构建过表达aβ42的细胞模型或动物模型中的应用。具体地，将所述过表达载体制备成质粒脂质体复合物，加入n2a细胞中转染24h，构建过表达aβ42的细胞模型。
18、本发明还提供了上述过表达载体在研究aβ42相关疾病发病机制或抑制aβ42表达的药物筛选中的应用。
19、本发明取得的有益效果如下：本发明中针对人aβ42的cds扩增，并通过同源重组的方法，将aβ42的cds核苷酸序列重组到pcmv-ha质粒骨架上实现对n2a细胞中的过表达。直接过表达aβ42有以下优点：
20、1. 精准性：aβ42是由app蛋白的特定酶切产生的，因此直接过表达aβ42可以更精确地研究aβ42对细胞和生物体的影响，而不受其他app代谢产物的干扰。
21、2. 简化：过表达aβ42可以避免app的复杂结构和多功能性，简化了研究的复杂性，使得更容易解释实验结果。
22、3. 特异性：aβ42是阿尔茨海默病中最具毒性的淀粉样蛋白，因此直接过表达aβ42可以更准确地研究与疾病相关的生物学效应。
23、4. 高效性：由于aβ42是app的一个特定片段，过表达aβ42可以更高效地产生所需的蛋白，而不需要过表达整个app蛋白。
24、利用质粒过表达aβ42相比过表达整个app蛋白更直接、更精确地研究aβ42的生物学效应和与阿尔茨海默病相关的机制。
1.一种过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包括aβ42的基因编码区和pcmv-ha载体骨架，所述aβ42的基因编码区位于pcmv-ha载体的cmv启动子下游；所述aβ42的基因编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述过表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
3.根据权利要求2所述过表达载体的构建方法，其特征在于，所述扩增引物如下：
4.根据权利要求2所述过表达载体的构建方法，其特征在于，所述双酶切法的限制性内切酶包括xhoi和bamhi。
5.一种如权利要求1所述过表达载体的应用，其特征在于，所述过表达载体在构建过表达aβ42的细胞模型或动物模型中的应用。
6.根据权利要求5所述过表达载体的应用，其特征在于，将所述过表达载体制备成质粒脂质体复合物，加入n2a细胞中转染24h，构建过表达aβ42的细胞模型。
7.一种如权利要求1所述过表达载体的应用，其特征在于，所述过表达载体在研究aβ42相关疾病发病机制或抑制aβ42表达的药物筛选中的应用。
