本发明属于生物，具体涉及一种在体外异位表达组织限制性抗原的方法。
背景技术：
1、在肿瘤进展过程中，肿瘤基因组中积累的突变会影响蛋白质编码基因，导致蛋白质序列发生变化。突变的蛋白质被主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，mhc)切割成短肽，呈递在肿瘤细胞表面，这些源于突变基因的多肽抗原即为肿瘤新抗原，它们存在于肿瘤细胞中，但不存在于正常细胞中，具有高度肿瘤特异性。随着高通量组学的广泛应用和新抗原预测技术的发展，基于新抗原的免疫治疗成为新的研究热点。目前，基于新抗原的个性化治疗性癌症疫苗已被证明在黑色素瘤和胶质母细胞瘤患者中是安全可行的。新抗原的识别、筛选和鉴定加速了肿瘤患者个体化免疫治疗的发展，这将使更多的患者受益。新抗原的发现主要借助于生物信息学预测及后续验证，其初始阶段是肿瘤组织与正常组织的测序，但由于肿瘤异质性与组织限制性抗原带来的假阳性，新抗原预测的准确性存在限制。组织限制性抗原(tissue restricted antigens，tras)是仅在一个或几个外周机体组织中特异性表达的抗原，即外周正常组织所表达的抗原。如果能拿全身正常组织的抗原来与肿瘤组织表达的抗原进行比较，不仅能避免这种假阳性，还能快速发现新抗原。但目前存在的问题是：缺少全身正常组织的抗原作为参照，因此需要一个能表达所有正常组织抗原的体系。
2、正常机体的成熟t细胞既要对多样性的非已抗原发生免疫应答，又要对自身抗原发生免疫耐受。为达到此要求，在胸腺t细胞的发育过程中，首先要经历其抗原识别受体(tcell receptor，tcr)α链和β链的基因重排，表达多样性的tcr，然后经历阳性选择和阴性选择。淋巴干细胞离开骨髓进入胸腺后经过tcr重排，发育为cd4+cd8+双阳性(doublepositive，dp)t细胞，被胸腺皮质区上皮细胞(cortical thymic epithelial cells，ctec)阳性选择获得mhc限制性并分化为cd4+或cd8+单阳性(single positive，sp)t细胞，sp细胞在皮质髓质交界处及髓质区经历阴性选择，能与髓质区上皮细胞(medullary thymicepithelial cells，mtecs)表达的自身抗原肽以高亲和力结合(即具有自身反应性)的sp细胞发生凋亡，少部分分化为调节性t细胞，而不能结合的sp细胞存活成为成熟t细胞并进入外周免疫器官。
3、阴性选择对于清除自身反应性t细胞，维持t细胞的中枢免疫耐受具有重要意义。胸腺髓质上皮细胞在诱导中枢耐受中起关键作用，mtecs可以表达外周各器官组织的特异性抗原，即组织限制性抗原。tras可以由mtec提呈给t细胞，或在mtec凋亡后由胸腺里的树突状细胞摄取并交叉提呈给t细胞。
4、tra基因在胸腺中的表达是异质性的，并且随机出现在呈递抗原的细胞内，这种现象称为“杂乱基因表达”(promiscuous gene expression，pge)，pge使mtecs表达自身抗原库。每个mtec只表达一组有限的tras，单个tra在任何给定时间仅在0.4％-3％的细胞中表达，这种在单细胞水平上相当大的异质性加在一起，在群体水平上形成了一个完整的组织限制性抗原库。这一复杂的机制需要由几个转录因子执行严格的调控，目前已知的核心调控因子包括自身免疫调节因子(autoimmune regulator，aire)和前脑胚胎锌指样蛋白2(forebrain embryonic zinc-finger-like protein 2，fezf2)。在mtec中，aire驱动3000多个组织限制性自身抗原的表达，约占胸腺表达的所有tras的40％，而aire和fezf2共同调控着60％以上组织限制性抗原的表达。
5、基于mtec这种表达外周组织限制性抗原库的特性，它对新抗原的发现具有重要参考价值，但直接对mtec进行测序是不现实的，首先是由于成人胸腺萎缩，用于测序的样本不足，其次，直接取患者胸腺对机体具有极大破坏性。因此本发明旨在在体外建立一个能像mtec一样表达组织限制性抗原的体系。本发明拟建立一种具有临床操作性的体外组织限制性抗原表达方法。这对进一步实现患者个体化的外周组织限制性抗原体外表达具有重要意义，为肿瘤新抗原的发现提供了对照，为开发新的肿瘤靶向治疗方式奠定了一定的基础，在肿瘤的免疫治疗、精准医疗方面具有潜在的应用价值。
技术实现思路
1、本发明提供了一种在体外利用体细胞异位表达外周组织限制性抗原的方法，包括以下步骤：
2、第一步，分离体细胞，并进行体外培养与鉴定，得到能在体外稳定培养的原代体细胞；
3、第二步，用空载腺病毒和目的基因过表达的腺病毒感染体细胞，进行目的基因过表达的鉴定后，得到空载腺病毒感染的体细胞和目的基因过表达的体细胞；；
4、第三步，对空载腺病毒感染的体细胞和目的基因过表达的体细胞进行rna的提取，对rna样本进行转录组测序；
5、第四步，对转录组测序结果进行分析；
6、进一步的，所述腺病毒为分别携带aire和fezf2基因的病毒，其中aire病毒带egfp基因和flag标签基因，fezf2病毒带mcherry基因和myc标签基因；
7、本发明中提到的试剂均可通过市购方式获得，腺病毒由汉恒生物公司提供。
8、作为进一步地改进，本发明所述的体细胞来自正常的健康组织，包括皮肤细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、心脏细胞、脾脏细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞中的任意一种。
9、作为进一步地改进，本发明所述的目的基因是调控组织限制性抗原编码基因表达的转录因子，包括自身免疫调节因子和前脑胚胎锌指蛋白2。
10、作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)中所述的分析包括，基于空载腺病毒感染的体细胞与目的基因过表达的体细胞的差异表达基因，筛选其中的组织限制性抗原编码基因。
11、特异性杀死肿瘤细胞的一种方案是找到新抗原。新抗原仅在肿瘤组织中表达，不在正常组织中表达，胸腺髓质上皮细胞异位表达外周组织限制性抗原(tissue restrictedantigens,tras)，对于新抗原的发现具有参考价值。本发明公开了一种在体外异位表达组织限制性抗原的方法：利用腺病毒感染体细胞向其中转入调控tras异位表达的转录因子来建立体外tras表达体系，并对体细胞进行转录组测序分析，评估表达方法的有效性。本发明在体细胞中成功异位表达了部分组织限制性抗原编码基因。本发明建立的方法对进一步利用患者来源的细胞在体外实现患者正常外周tras的表达具有参考价值。
12、本发明的有益效果主要体现在：
13、1.本发明所述体细胞可来自于表皮、毛囊等组织，易于临床采取、创伤性小、
14、具有临床可操作性。
15、2.本发明所述体细胞在具体临床应用时可来自患者本身，能实现患者个体化组织限制性抗原的表达。
16、3.目前肿瘤新抗原发现过程的初始阶段涉及肿瘤组织和正常组织的测序，但由于肿瘤异质性以及组织限制性抗原带来的假阳性结果，其准确性存在限制，以本发明为基础建立的正常组织限制性抗原库能在一定程度上解决这个问题。
17、4.本发明建立的这种方法，能在体外表达正常组织的抗原，作为肿瘤新抗原发现的对照，这种个性化的新抗原发现方法在推进癌症免疫治疗方面具有一定潜力，为开发新的肿瘤靶向治疗方式奠定了一定的基础。
1.一种在体外异位表达组织限制性抗原的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体细胞来自正常的健康组织，包括皮肤细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、心脏细胞、脾脏细胞、骨细胞、血细胞、肌肉细胞、脂肪细胞中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的基因是调控组织限制性抗原编码基因表达的转录因子，包括自身免疫调节因子和前脑胚胎锌指蛋白2。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的分析包括，基于空载腺病毒感染的体细胞与目的基因过表达的体细胞的差异表达基因，筛选其中的组织限制性抗原编码基因。
