本发明属于荧光探针领域，具体涉及基于花菁染料的靶向型近红外荧光探针的制备和应用。
背景技术：
1、荧光导航精准切除肿瘤已被应用于多种临床手术中。目前应用比较广泛的是近红外一区染料吲哚菁绿（icg），但是其对肿瘤没有靶向型，虽然有报道显示其在肿瘤部位相比周围正常组织的信号强2.5倍，但区分度并不高。在近红外染料上引入靶向基团成为目前发展的一个趋势。目前可引入靶向基团有常用的两种花菁骨架，一种是两端端基不对称的七甲川花菁结构，一端为磺酸基赋予染料在活体成像中的水溶性与代谢能力，另一端为可接入靶标的反应位点，例如羧基、炔基、叠氮等；另一种是在七甲川花菁中间的位置引入带有cl、br等卤素的刚性环，随后通过与过渡金属的偶联反应或者含n、o、s等强亲核性基团发生取代反应接入后续的靶标。但第一种骨架由于其不对称的结构，导致合成的产率很低，例如draney,d.r等人合成的花菁分子，由于反应中形成了对称的花菁结构ir-783和mhi148导致最终的反应产率只有30%。第二种花菁骨架因其最后连入靶标的方法涉及特定的金属催化偶联反应或者强亲核能力的基团，对接入靶点的结构有着要求，需要靶标修饰上偶联的反应结构或者带有强亲核性的n、o、s等官能团具有一定的局限性。因此，在保持接入靶标通用性的同时，开发具有单一反应位点的靶向单元连接的新材料是迫切需要的。此外icg尽管有报道可以利用其发射光谱在近红外二区的尾峰进行临床的荧光手术导航，但由于其整体的发射光谱还是在近红外一区，提升其整体亮度仍然具有临床意义。为了在近红外区域发射荧光，荧光团通常具有较大的共轭骨架以刺激低带隙，这自发地诱导共轭骨架与其他分子之间的相互作用增强，导致低的量子产率，特别是在水体系中。因此，本发明在花菁骨架中引入相当长度的烷基链来有效地提升整个花菁荧光团在近红外区域的整体亮度。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供基于花菁染料的靶向型近红外荧光探针的制备和应用，该制备方法的合成原料易得，合成操作简单，制作方便；另外，还引入了n3的反应位点，方便接入后续的靶向基团；且通过在中间碳链骨架引入相当长度的烷基链，使得探针的荧光量子产率得到极大的提高。
2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
3、一种花菁类荧光染料，即icg-alkyln3，其结构如式ⅰ所示：
4、ⅰ；
5、其中，上述r选自烷基。
6、本发明根据zincke reaction（n-(2,4-二硝基苯基)吡啶盐与苯胺或脂肪胺作用进行胺交换生成相应的n-芳基或n-烷基吡啶盐的反应）产生的过渡态与对溴苯胺进行亲核反应生成七甲川花菁的必需中间体，随后与季铵化杂环进行缩合，以一锅法串联的方法生成具有单一反应位点的靶向单元连接的花菁骨架，结合实际的活体成像需要，选择了具有磺酸基的苯并吲哚作为两端的杂环结构，并在花菁碳链3号位置引入靶向反应位点叠氮以及相当长度的烷基链，最终设计具有靶向能力、亮度更高的花菁结构icg-alkyln3。
7、本发明还公开了一种花菁类荧光染料的制备方法，包括：
8、步骤一、1-氯-2,4-二硝基苯水解制备2,4-二硝基苯酚；
9、步骤二、2,4-二硝基苯酚与对甲苯磺酰氯发生取代反应制备2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯；
10、步骤三、3-氨基吡啶与溴烷基酸发生酰胺化反应，再与叠氮化钠发生取代反应，制备吡啶衍生物；
11、步骤四、采用2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯和吡啶衍生物制备吡啶盐；
12、步骤五、采用吡啶盐和胺类化合物制备icg-alkyln3。
13、具体地，上述花菁类荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
14、步骤一、将1-氯-2,4-二硝基苯加入到浓度为1.3-1.8m的naoh水溶液中，95-105℃反应1.5-2h后，加入乙酸中和过量的naoh，随后加入饱和食盐水和乙酸乙酯（ea）进行萃取，最后无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到2,4-二硝基苯酚；
15、步骤二、将2,4-二硝基苯酚溶于二氯甲烷（两者的质量体积比为1g:20-35ml）中，依次加入对甲苯磺酰氯和三乙胺，室温反应15-20h，加入水，用二氯甲烷提取，用饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸发有机溶剂，经甲醇洗涤，得到2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯；
16、步骤三、将溴烷基酸溶于无水干燥二氯甲烷（两者的质量体积比为1g:6-10ml）中，加入催化当量n,n-二甲基甲酰胺，随后缓慢加入草酰氯，室温搅拌反应25-50min后，减压蒸发，将残留物溶解在无水n,n-二甲基甲酰胺（溴烷基酸与n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为1g:4-6ml）中，加入三乙胺，然后将3-氨基吡啶溶解于无水干燥n,n-二甲基甲酰胺（3-氨基吡啶与n,n-二甲基甲酰胺的质量体积比为1g:2.5-3ml），随后缓慢加入到上述反应体系中，将反应混合物在室温下搅拌1.5-2.5h，加入叠氮化钠（nan3）在氮气环境下搅拌过夜，用水淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机层用水洗涤，无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发有机溶剂，经柱层析，得到吡啶衍生物；
17、步骤四、将2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯和吡啶衍生物溶解在甲苯（2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯与甲苯的质量体积比为1g:2-2.8ml）中，回流反应15-20h后，冷却至室温，过滤，用甲苯和乙醚（et2o）洗涤，干燥，得到吡啶盐；
18、步骤五、将吡啶盐和胺类化合物溶解在甲醇中，室温搅拌25-35min，然后加入1,1,2-三甲基-3-(4-磺酸丙基)-1h-苯并[e]吲哚内盐和乙酸钠，将反应混合物在室温下再搅拌反应15-20h，结束后加入乙醚，放入-15℃至-18℃冷冻室，冷冻处理20-30h后，过滤，水洗涤，乙醚洗涤，烘干，经柱层析，得到产物icg-alkyln3。
19、优选地，上述步骤一中，1-氯-2,4-二硝基苯与naoh水溶液的质量体积比为1g:3-5ml；饱和食盐水与乙酸乙酯的体积比为1:1.5-2.5。
20、优选地，上述步骤二中，2,4-二硝基苯酚与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.3；2,4-二硝基苯酚与三乙胺的摩尔比为1:2.3-3。
21、优选地，上述步骤三中，溴烷基酸与草酰氯的摩尔比为1:1.3-1.8；溴烷基酸与三乙胺的摩尔比为1:0.8-1.2；溴烷基酸与3-氨基吡啶的摩尔比为1:0.8-1.2；溴烷基酸与叠氮化钠的摩尔比为1:1.7-2.5。
22、优选地，上述步骤四中，2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯与吡啶衍生物的摩尔比为1:0.6-1。
23、优选地，上述步骤五中，吡啶盐与胺类化合物的摩尔比为1:1.1-1.4；吡啶盐与甲醇的质量体积比为1g:45-55ml；吡啶盐与1,1,2-三甲基-3-(4-磺酸丙基)-1h-苯并[e]吲哚内盐的摩尔比为1:2.5-4；吡啶盐与乙酸钠的摩尔比为1:5-6.5。
24、优选地，上述胺类化合物选自苯胺或脂肪胺中的一种。
25、本发明还公开了上述制备方法制得的花菁类荧光染料在制备靶向型近红外荧光探针中的用途。
26、本发明针对吲哚菁绿存在的两个问题，一是整体在近红外二区的亮度不足，二是缺少靶向型基团的接入位点，结合已报道的合成方法与实际活体成像需要，设计合成了一个具有靶向型花菁结构骨架，量子效率在适合生物成像的pbs溶液中是常规吲哚菁绿染料的三倍，此外生物素是所有细胞分裂，尤其是癌细胞生长所必需的维生素，有研究表明，生物素受体在卵巢癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中过表达，本发明选用生物素作为最后的模型验证，并在乳腺癌荷瘤小鼠中起到了很好的靶向作用。
27、本发明还公开了一种靶向型近红外荧光探针的制备方法，包括：
28、采用5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸和2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯发生酰胺化反应，然后在酸性条件下发生水解反应后，与二苯基环辛炔-羧酸发生酰胺化反应，然后再与上述的花菁类荧光染料发生加成反应，制得靶向型近红外荧光探针。
29、具体地，上述靶向型近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
30、将5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸和2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯溶解于n,n–二甲基甲酰胺中，室温搅拌15-20h，用二氯甲烷萃取，有机层用去离子水洗涤，无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发，再经柱层析，获得产物6，然后将产物6加入到浓度为8-12wt%的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中反应5-8h后，饱和碳酸氢钠（nahco3）溶液洗涤2-3次，去离子水洗涤2-3次，无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发，获得粗产品，在粗产品中加入二苯基环辛炔-羧酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺，然后溶于无水n,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室温反应13-20h后，用二氯甲烷萃取，有机层用水洗涤，无水硫酸钠进行干燥，减压蒸发有机溶剂，经柱层析，得到产物7，然后将产物7加入到二氯甲烷中溶解，再加入花菁类荧光染料，反应20-30h，经柱层析，获得靶向型近红外荧光探针。
31、优选地，上述5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸与2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯的摩尔比为1:0.8-1.3；2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯与n,n–二甲基甲酰胺的质量体积比为1g:45-55ml；产物6与三氟乙酸的二氯甲烷溶液的质量体积比为1g:90-110ml；粗产品与二苯基环辛炔-羧酸的质量比为1:0.8-1；二苯基环辛炔-羧酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:0.9-1.3；二苯基环辛炔-羧酸与n-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:0.9-1.3；产物7与花菁类荧光染料的摩尔比为1:0.8-1.3。
32、一种荧光成像试剂，包含上述制备方法制得的靶向型近红外荧光探针。
33、本发明的有益效果包括：
34、本发明获得了基于花菁染料的靶向型近红外荧光探针的制备和应用，本发明针对吲哚菁绿存在的问题，设计合成了一种具有靶向型花菁结构骨架，量子效率在生物成像的pbs溶液中是常规吲哚菁绿染料的三倍，此外生物素是所有细胞分裂，尤其是癌细胞生长所必需的维生素，本发明选用生物素作为最后的模型验证，并在乳腺癌荷瘤小鼠中起到了良好的靶向作用。
35、因此，本发明提供了基于花菁染料的靶向型近红外荧光探针的制备和应用，该制备方法的合成原料易得，合成操作简单，制作方便；另外，还引入了n3的反应位点，方便接入后续的靶向基团；且通过在中间碳链骨架引入相当长度的烷基链，使得探针的荧光量子产率得到极大的提高。
1.一种花菁类荧光染料，即icg-alkyln3，其结构如式ⅰ所示：
2.权利要求1所述的花菁类荧光染料的制备方法，包括：
3.根据权利要求2所述的花菁类荧光染料的制备方法，其特征在于：所述步骤四中，2,4-二硝基苯对甲基磺酸甲苯与吡啶衍生物的摩尔比为1:0.6-1。
4.根据权利要求2所述的花菁类荧光染料的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，吡啶盐与胺类化合物的摩尔比为1:1.1-1.4。
5.一种靶向型近红外荧光探针的制备方法，包括：
6.根据权利要求5所述的一种靶向型近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：所述5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酸与2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基氨基甲酸叔丁酯的摩尔比为1:0.8-1.3。
7.权利要求2-4任一项所述制备方法制得的花菁类荧光染料在制备靶向型近红外荧光探针中的用途。
8.一种荧光成像试剂，包含权利要求5-6任一项所述制备方法制得的靶向型近红外荧光探针。
