本发明属于生物，具体涉及一种tlx荧光探针化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
1、核受体无尾蛋白是核受体亚家族2e组成员1(nuclear receptor subfamily 2group e member 1，nr2e1)，也被称为tlx。它是一种转录因子，属于果蝇无尾基因的同源物，在人体的眼部和脑部高表达，以调节神经发生、视网膜祖细胞增殖为人所知。核受体无尾蛋白在神经干细胞激活方面发挥着重要作用，在脊椎动物身上从胚胎阶段开始参与神经干细胞的自我更新和分裂直到成年，维持神经干细胞群体的终末神经元分化，管理着干细胞的生态定位。它在成年人体内是一个转录抑制因子，通过募集辅抑制因子形成复合物抑制神经细胞分化。作为神经发生的调节因子，tlx的反向激动可以激活神经干细胞，是治疗阿尔兹海默症、帕金森等神经退行性疾病的潜在靶点之一。同时，tlx的表达失调已在各种病理条件的研究中得到证实，激动tlx可以增强抑制癌细胞的扩散、迁移和调节预后复发，是治疗脑部的胶质瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤的潜在靶点之一。许多文献都表明tlx拥有巨大的潜在应用价值以及药靶特征，而且tlx也拥有其他核受体一样的dna结合域和配体结合域(ligand binding domain，lbd，如图1中a、b展示)，但是目前没有十分有效的tlx调制剂，阻碍了对其的进一步验证。
2、实体药物高通量药物筛选(high-throughput screening，hts)是一种发现具有潜力的化合物或药物候选物，用于大规模、高效率地筛选化合物或药物候选物与蛋白质靶点相互作用的方法，是现代药物发现过程中的关键步骤之一，旨在加速药物发现的进程，提高药物研发的效率和成功率。但是，过去文献报道的tlx配体发现和结构优化检测机制基本是基于细胞层面的，所以需要建立更简单高效且可靠的分子层面高通量药物筛选体系。蛋白水平上的高通量筛选可以在短时间内快速评估大量化合物与特定蛋白质相互作用，一般的检测方法如使用荧光偏振(fluorescence polarization-fp，图2)和时间分辨荧光共振能量转移(time resolution fluorescent resonance energy transfer-tr-fret，图3)等都是利用荧光分子的性质来研究分子间的相互作用。两种方法都具有高灵敏度和检测低浓度样品的能力，常适用于高通量筛选和定量分析。
3、fp测量荧光分子的偏振方向，荧光示踪剂在与靶标蛋白结合时从低偏振转变为高偏振以形成更大的复合物。主要提供荧光分子在空间上的取向信息，缺点是需要纯化大量的蛋白。tr-fret测量供体和受体之间的能量转移过程，侧重于测量能量转移过程，需要使用镧系元素的供体(如铽—tb)和已知能结合的受体荧光标记物(如多肽等)。要发生电子跃迁能量转移，供体和受体的空间距离须在范围内，如图3所示，首先荧光供体tb与histidine(his)标签发生特异结合，然后his-tlx-lbd蛋白和激动剂/抑制剂配体发生结合后会招募辅激活/抑制肽，接着供体荧光团在被光激发(excitation—ex)时会吸收能量并被激发，把电子能量跃迁传递到带有荧光受体的多肽上发生能量转移。没有结合前，供体和受体处于直接激发状态，供体会在几毫秒内发光，而受体是几纳秒内发光；而供体和受体发生能量转移，受体的发生发射(emission—em)会变成毫秒级别，以达到通过时间分辨测量了解蛋白与化合物的结合。在tr-fret的基础上，tr-fret竞争性结合实验不但用小分子探针(不同名称：荧光配体、示踪剂)替代了高价格的荧光多肽，同时也简化了步骤，降低实验门槛，增加了检测精度与灵敏度(图4)。与tr-fret相同，当目标蛋白与荧光配体探针结合后，光激发的能量从铽标记的供体端的核受体tlx-lbd转移到荧光探针的受体端上发射。如果加入待测定的化合物，它会竞争性地将荧光配体探针从tlx-lbd的用药位点中取代结合，导致供体和受体之间的fret信号丧失，令总体的检测信号强度下降，与此同时可以测定竞争化合物与荧光信号的梯度关系，找出ki值。
技术实现思路
1、本发明第一方面的目的，在于提供一种化合物。
2、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物的制备方法。
3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物的应用。
4、本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂。
5、本发明第五方面的目的，在于提供一种试剂盒。
6、本发明第六方面的目的，在于提供一种检测系统。
7、本发明第七方面的目的，在于提供一种筛选tlx配体的方法。
8、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
9、本发明的第一个方面，提供一种化合物，其化学结构式如式(ⅰ)所示：
10、
11、式(ⅰ)中，r1选自
12、r2选自
13、优选地，r1中，n为整数。
14、优选地，r1中，n为0、1、2、3、或4。
15、优选地，r2选自r1选自-(ch2)3-、-(ch2)4-、-ch2-ch2-o-ch2-ch2-。
16、进一步优选地，r2选自r1选自-(ch2)4-、-ch2-ch2-o-ch2-ch2-。
17、再进一步优选地，r2选自r1选自-ch2-ch2-o-ch2-ch2-。
18、优选地，r2选自r1选自-(ch2)0-、-(ch2)4-、-ch2-ch2-o-ch2-ch2-。
19、优选地，r2选自r1选自-(ch2)4-、-(ch2)0-。
20、优选地，r2选自r1选自-(ch2)4-。
21、优选地，所述化合物选自化合物a、化合物b、化合物c、化合物d、化合物e、化合物f、化合物g、化合物h、化合物i、化合物j、化合物k、化合物l(各化合物具体结构式如表1所示)；进一步选自化合物d、化合物e、化合物f、化合物g、化合物k、化合物l；更进一步选自化合物f、化合物k、化合物g；再进一步选自化合物f。
22、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面的化合物的制备方法，包括如下步骤：
23、s1：将配体与有机中间体进行酰胺反应，得到中间体1a，所述有机中间体选自单boc肼、单boc甲二胺、单boc乙二胺、单boc丙二胺、单boc丁二胺、单boc-2,2'-氧基二乙胺，所述配体选自4-[(e)-2-(5,5-二甲基-8-苯基-6h-萘-2-基)乙烯基]苯甲酸、4-[(e)-2-[5,5-二甲基-8-(2-苯乙炔基)-6h-萘-2-基]乙烯基]苯甲酸；
24、s2：对中间体1a进行脱保护反应，脱保护后的中间体1a与异硫氰酸荧光素进行亲核加成反应，得到本发明第一个方面的化合物。
25、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-(5,5-二甲基-8-苯基-6h-萘-2-基)乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc丙二胺、单boc丁二胺、单boc-2,2'-氧基二乙胺。
26、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-(5,5-二甲基-8-苯基-6h-萘-2-基)乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc丁二胺、单boc-2,2'-氧基二乙胺。
27、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-(5,5-二甲基-8-苯基-6h-萘-2-基)乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc-2,2'-氧基二乙胺。
28、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-[5,5-二甲基-8-(2-苯乙炔基)-6h-萘-2-基]乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc肼、单boc丁二胺、单boc-2,2'-氧基二乙胺。
29、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-[5,5-二甲基-8-(2-苯乙炔基)-6h-萘-2-基]乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc丁二胺、单boc肼。
30、优选地，所述配体选自4-[(e)-2-[5,5-二甲基-8-(2-苯乙炔基)-6h-萘-2-基]乙烯基]苯甲酸，所述有机中间体选自单boc丁二胺。
31、优选地，s1中所述的酰胺反应按照常规的酰胺反应条件进行，比如：室温过夜。
32、优选地，s1中所述的酰胺反应选用的有机溶剂包含：dmf、dhf、乙腈中的至少一种；进一步包含dmf。
33、优选地，s1中所述的酰胺反应选用的缩合剂包含：hatu、pyboc、hoat、hobt、hbtu、bop中的至少一种；进一步包含hatu。
34、优选地，s1中所述的酰胺反应选用的碱包含：n，n-二异丙基乙胺、三乙胺中的至少一种；进一步包含：n,n-二异丙基乙胺。
35、优选地，s1中所述配体和有机中间体的摩尔比为1:1～1:4；进一步为1：1.1～1:3。
36、优选地，s1中所述反应后还包含如下步骤：将反应后的溶液在有机溶剂和水中分配，保留有机相，洗涤，干燥。
37、优选地，s1中所述反应后还包含如下步骤：将反应后的溶液在有机溶剂和水中分配，保留有机相，水相有机溶剂萃取一次，合并有机相，洗涤，干燥。
38、优选地，所述有机溶剂包含：乙酸乙酯。
39、优选地，所述洗涤包含：柠檬酸水溶液洗涤、饱和碳酸氢钠洗涤和氯化钠溶液洗涤。
40、优选地，所述干燥采用硫酸钠干燥。
41、优选地，s2中所述的脱保护反应按照常规的脱保护反应条件进行，比如：室温过夜。
42、优选地，s2中所述脱保护反应选用的有机溶剂包含：dcm、1，4-二氧六环、dmf、thf中的至少一种；进一步包含：dcm。
43、优选地，s2中所述脱保护反应选用的酸包含：tfa、hcl、醋酸中的至少一种；进一步包含：tfa。
44、优选地，s2中所述脱保护反应后还包括如下步骤：浓缩除去有机溶剂。
45、优选地，s2中所述的亲核加成反应按照常规的亲核加成反应条件进行，比如：室温避光过夜。
46、优选地，s2中所述的亲核加成反应选用的有机溶剂包含：1，4-二氧六环、dmf、thf、乙醇中的至少一种；进一步包含：thf和乙醇。
47、优选地，所述thf和乙醇的体积比为(1～3)：1。
48、优选地，s2中所述的亲核加成反应选用的碱包含：n，n-二异丙基乙胺、三乙胺中的至少一种；进一步包含：三乙胺。
49、优选地，s2中所述的亲核加成反应后还包含如下步骤：干燥、纯化。
50、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面的化合物的应用，具体如下：
51、a1)本发明第一个方面的化合物作为荧光探针在筛选tlx配体中的应用；
52、a2)本发明第一个方面的化合物在制备筛选tlx配体的产品中的应用。
53、优选地，所述产品包括试剂、试剂盒、检测系统中的至少一种。
54、优选地，所述tlx配体包括tlx激动剂、tlx拮抗剂中的至少一种；进一步包含tlx激动剂。
55、本发明的第四个方面，提供一种试剂，包含本发明第一个方面的化合物。
56、优选地，所述试剂用于筛选tlx配体。
57、优选地，所述tlx配体包括tlx激动剂、tlx拮抗剂中的至少一种；进一步包含tlx激动剂。
58、本发明的第五个方面，提供一种试剂盒，包含b1)～b2)中至少一种：
59、b1)本发明第一个方面的化合物；
60、b2)本发明第四个方面的试剂。
61、优选地，所述试剂盒还包含：包含tlx配体结合域(tlx-lbd)的蛋白，所述蛋白连接有标签蛋白。
62、优选地，所述试剂盒还包含：镧系元素标记的抗所述标签蛋白抗体。
63、优选地，所述标签蛋白包含：c-myc、his、gst、ha、flag中的至少一种；进一步包含：his。
64、优选地，所述镧系元素包含：la、sc、y、ce、pr、nd、pm、sm、eu、gd、tb、dy、ho、er、tm、yb、lu中的至少一种；进一步包含tb。
65、优选地，所述试剂盒还包含：缓冲液。
66、优选地，所述缓冲液包含pbs缓冲液、tris缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。
67、优选地，所述缓冲液为包含tween20的缓冲液。
68、优选地，所述试剂盒用于筛选tlx配体。
69、优选地，所述tlx配体包括tlx激动剂、tlx拮抗剂中的至少一种；进一步包含tlx激动剂。
70、本发明的第六个方面，提供一种检测系统，包含：c1)～c3)中至少一种和酶标仪：
71、c1)本发明第一个方面的化合物；
72、c2)本发明第四个方面的试剂；
73、c3)本发明第五个方面的试剂盒。
74、优选地，所述检测系统用于筛选tlx配体。
75、优选地，所述tlx配体包括tlx激动剂、tlx拮抗剂中的至少一种；进一步包含tlx激动剂。
76、本发明的第七个方面，提供一种筛选tlx配体的方法，包含：采用d1)～d4)中至少一种的步骤；
77、d1)本发明第一个方面的化合物；
78、d2)本发明第四个方面的试剂；
79、d3)本发明第五个方面的试剂盒；
80、d4)本发明第六个方面的检测系统。
81、优选地，所述方法包括如下步骤：
82、s1：将包含tlx配体结合域(tlx-lbd)的蛋白，所述蛋白连接有标签蛋白、镧系元素标记的抗所述标签蛋白抗体、本发明第一个方面的化合物和待测物质混合，得到混合物；
83、s2：利用荧光共振能量转移技术测定混合物的信号值，根据信号值确认待测物质是否为tlx配体。
84、优选地，所述tlx-lbd的氨基酸序列包含seq id no.1。
85、优选地，所述蛋白在所述混合物中的浓度为30～50nm；进一步为35～45nm。
86、优选地，所述抗体在所述混合物中的浓度为0.5～1.5nm；进一步为0.8～1.2nm。
87、优选地，所述化合物在所述混合物中的浓度为1～8μm；进一步为2～6μm；更进一步为2～4μm。
88、优选地，所述tlx配体包括tlx激动剂、tlx拮抗剂中的至少一种；进一步包含tlx激动剂。
89、本发明的有益效果是：
90、本发明提供了一种化合物，该化合物可以作为荧光探针用于筛选tlx配体，其制备简单、结构稳定、灵敏度高、检测速度快，适用于高通量筛选tlx配体，其用于筛选tlx配体时采用竞争性结合tr-fret筛选体系(不同于传统的荧光偏振体系)，为后续筛选出更多靶向tlx的药物提供了有效体系。
1.一种化合物，其化学结构式如式(ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：
3.权利要求1或2所述的化合物的制备方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
5.权利要求1或2所述的化合物在a1)～a2)中至少一项中的应用：
6.一种试剂，包含权利要求1或2所述的化合物。
7.一种试剂盒，包含b1)～b2)中至少一种：
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
9.一种检测系统，包含：c1)～c3)中至少一种和酶标仪：
10.一种筛选tlx配体的方法，包含：采用d1)～d4)中至少一种的步骤；
