发明领域本发明涉及靶向bcma的单域抗体、嵌合抗原受体和经工程化的免疫效应细胞及其使用方法。
背景技术：
0、发明背景
1、随着肿瘤免疫疗法和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞(car-t)免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法方法之一。一般而言，嵌合抗原受体(car)包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。胞外抗原结合域可包含靶向所鉴定的肿瘤抗原的单链可变片段(scfv)。可以使用基因转染技术在t细胞的表面上表达car。在结合至靶标肿瘤抗原后，car可活化t细胞，用以以抗原依赖性方式发起特异性抗肿瘤响应，而不受对靶标肿瘤抗原具有特异性的主要组织相容性复合体(mhc)的可用性的限制。
2、单域抗体(sdab)由于具有单个单体抗体可变域而不同于传统的4链抗体。例如，骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的sdab，其被称为仅重链抗体(hcab)。骆驼科动物仅重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域(vhh)，所述重链可变域可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力。骆驼科动物vhh被称为最小的功能性抗原结合片段，分子量为大约15kd。
3、多发性骨髓瘤(mm)是一种无法治愈的侵袭性血浆恶性肿瘤，其被归类为b细胞瘤，并且以不受控制的方法在骨髓中增殖，从而干扰血细胞的正常代谢产生并导致令人痛苦的骨病变(garfall,a.l.等人,discovery med.2014,17,37)。多发性骨髓瘤在临床上可出现高钙血症、肾功能不全、贫血、骨病变、细菌感染、高粘血症和淀粉样变性(robertz.orlowski,cancer cell.2013,24(3))。根据调查和统计，每年将有近86,000名患者被诊断为骨髓瘤，而每年有约63,000名患者死于疾病相关的并发症(becker,2011)。由于人口老龄化，预计骨髓瘤的病例数将逐年增加。正如很多癌症一样，多发性骨髓瘤的起因仍不清楚，且未治愈。多发性骨髓瘤的一些治疗类似于其他癌症的疗法，诸如化学疗法或放射疗法、干细胞移植或骨髓移植、靶向疗法或生物疗法(george,2014)。已证实，基于抗体的细胞免疫疗法对血液恶性肿瘤(特别是b细胞非霍奇金氏(non-hodgkin)淋巴瘤)患者具有显著的临床有益效果。虽然目前的多发性骨髓瘤疗法通常会产生缓解，但是几乎所有患者最终都会复发。需要用于治疗多发性骨髓瘤的有效免疫治疗剂。
4、本发明中公开的lcar-b38m是靶向二价bcma的car-t，所述car-t在临床试验中在治疗难治性或复发性多发性骨髓瘤患者的安全性和功效方面已显示出临床优点。在早期临床试验中，35名患者中的33名(94％)在接受lcar-b38m car-t细胞后具有多发性骨髓瘤的临床缓解。大多数患者只有轻微的副作用。主要发明人在2017年asco年会(2017ascoannual meeting)(文摘lba3001)和新闻发布会中介绍了此研究，该新闻发布会吸引了广泛的媒体报道(http://www.ascopost.com/news/55713)。
5、总体而言，客观响应率为100％，并且33名患者(94％)在接受car t细胞的2个月内具有明显的骨髓瘤临床缓解(完全响应、非常好的部分响应或部分响应)。在跟踪该组超过4个月的时间后，在19名患者中，在功效方面，14名已达到严格完全响应标准，1名患者已达到部分响应，并且4名患者已实现非常好的部分缓解标准。
6、由于lcar-b38m临床试验获得的出色功效和安全性特征显著优于asco中同时报道的少数其他bcma car-t试验，因此这些工作在免疫疗法领域已被广泛认为是“革命性的突破”。值得注意的是，所有这些bcma car设计是其中bcma抗原结合域由单价scfv抗体组成的常规car。
7、本文涉及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容据此以引用的方式整体并入本文。
技术实现思路
1、本技术提供抗bcma单域抗体(sdab)、包含一个或多个抗bcma sdab(诸如vhh片段)的嵌合抗原受体(car)、经工程化的免疫效应细胞及其用于癌症免疫疗法的使用方法。
2、本技术的一个方面提供包含seq id no:115-152中的任一者的cdr区的抗bcmasdab。在一些实施方案中，抗bcma sdab包含以下中的任一者：(1)包含seq id no:1的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:39的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:77的氨基酸序列的cdr3；(2)包含seq id no:2的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:40的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:78的氨基酸序列的cdr3；(3)包含seq id no:3的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:41的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:79的氨基酸序列的cdr3；(4)包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:42的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:80的氨基酸序列的cdr3；(5)包含seq id no:5的氨基酸序列的cdr1；包含seqid no:43的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:81的氨基酸序列的cdr3；(6)包含seq idno:6的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:44的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:82的氨基酸序列的cdr3；(7)包含seq id no:7的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:45的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:83的氨基酸序列的cdr3；(8)包含seq id no:8的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:46的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:84的氨基酸序列的cdr3；(9)包含seq id no:9的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:47的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:85的氨基酸序列的cdr3；(10)包含seq id no:10的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:48的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:86的氨基酸序列的cdr3；(11)包含seq id no:11的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:49的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:87的氨基酸序列的cdr3；(12)包含seq id no:12的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:50的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:88的氨基酸序列的cdr3；(13)包含seq id no:13的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:51的氨基酸序列的cdr2；和包含seqid no:89的氨基酸序列的cdr3；(14)包含seq id no:14的氨基酸序列的cdr1；包含seq idno:52的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:90的氨基酸序列的cdr3；(15)包含seq idno:15的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:53的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:91的氨基酸序列的cdr3；(16)包含seq id no:16的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:54的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:92的氨基酸序列的cdr3；(17)包含seq id no:17的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:55的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:93的氨基酸序列的cdr3；(18)包含seq id no:18的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:56的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:94的氨基酸序列的cdr3；(19)包含seq id no:19的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:57的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:95的氨基酸序列的cdr3；(20)包含seq id no:20的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:58的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:96的氨基酸序列的cdr3；(21)包含seq id no:21的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:59的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:97的氨基酸序列的cdr3；(22)包含seq id no:22的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:60的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:98的氨基酸序列的cdr3；(23)包含seq id no:23的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:61的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:99的氨基酸序列的cdr3；(24)包含seq id no:24的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:62的氨基酸序列的cdr2；和包含seqid no:100的氨基酸序列的cdr3；(25)包含seq id no:25的氨基酸序列的cdr1；包含seq idno:63的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:101的氨基酸序列的cdr3；(26)包含seq idno:26的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:64的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:102的氨基酸序列的cdr3；(27)包含seq id no:27的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:65的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:103的氨基酸序列的cdr3；(28)包含seq id no:28的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:66的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:104的氨基酸序列的cdr3；(29)包含seq id no:29的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:67的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:105的氨基酸序列的cdr3；(30)包含seq id no:30的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:68的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:106的氨基酸序列的cdr3；(31)包含seq id no:31的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:69的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:107的氨基酸序列的cdr3；(32)包含seq id no:32的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:70的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:108的氨基酸序列的cdr3；(33)包含seq id no:33的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:71的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:109的氨基酸序列的cdr3；(34)包含seq id no:34的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:72的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:110的氨基酸序列的cdr3；(35)包含seq id no:35的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:73的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:111的氨基酸序列的cdr3；(36)包含seq id no:36的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:74的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:112的氨基酸序列的cdr3；(37)包含seq id no:37的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:75的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:113的氨基酸序列的cdr3；或(38)包含seq id no:38的氨基酸序列的cdr1；包含seq id no:76的氨基酸序列的cdr2；和包含seq id no:114的氨基酸序列的cdr3。在一些实施方案中，抗bcmasdab包含vhh域，所述vhh域包含选自由seq id no:115-152组成的组的氨基酸序列。
3、在一些实施方案中，提供了包含上述抗bcmasdab中的任一者的抗bcma仅重链抗体(hcab)或抗原结合蛋白。还提供了上述抗bcma sdab中的任一者特异性结合的bcma表位，和与上述抗bcmasdab中的任一者竞争的抗bcma抗体(诸如抗bcma sdab)。
4、在根据上述抗bcma sdab中的任一者的一些实施方案中，抗bcmasdab是骆驼科动物抗体。在一些实施方案中，抗bcma sdab是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗bcma sdab是人源化的。在一些实施方案中，抗bcma sdab是vhh片段。
5、本技术的一个方面提供包含多肽的bcma嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含抗bcma sdab(诸如上述抗bcma sdab中的任一者)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，car是单特异性的。在一些实施方案中，car是单价的。在一些实施方案中，car是多价的(诸如二价的或三价的)。在一些实施方案中，car是多特异性的(诸如双特异性的)。在一些实施方案中，胞外抗原结合域包含至少两个抗bcma sdab(诸如上述抗bcma sdab中的任何一者或多者)。
6、本技术的一个方面提供包含多肽的多价嵌合抗原受体(car)，所述多肽包含：(a)包含第一bcma结合部分和第二bcma结合部分的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，第一bcma结合部分和第二bcma结合部分中的一者或多者是抗bcma sdab。在一些实施方案中，第一bcma结合部分是第一抗bcma sdab，并且第二bcma结合部分是第二抗bcma sdab。在一些实施方案中，第一bcma结合部分是抗bcma sdab，并且第二bcma结合部分来源于人抗体。在一些实施方案中，第一bcma结合部分是抗bcma sdab，并且第二bcma结合部分是bcma的多肽配体。在一些实施方案中，第一bcma结合部分和第二bcma结合部分特异性结合至bcma上的相同的表位。在一些实施方案中，第一bcma结合部分和第二bcma结合部分特异性结合至bcma上的不同的表位。在一些实施方案中，第一bcma结合部分和/或第二bcma结合部分特异性结合至来源于选自seq id no:388-394的氨基酸序列的bcma上的表位。在一些实施方案中，第一bcma结合部分特异性结合至来源于seq idno:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二bcma结合部分特异性结合至来源于seqid no:391和/或392的表位。
7、本技术的一个方面提供包含多肽的多价(诸如二价或三价)嵌合抗原受体，所述多肽包含：(a)包含第一抗bcma sdab(诸如上述抗bcma sdab中的任一者)和第二抗bcma sdab(诸如上述抗bcma sdab中的任一者)的胞外抗原结合域；(b)跨膜域；和(c)胞内信号传导域。在一些实施方案中，第一抗bcma sdab和第二抗bcma sdab特异性结合至bcma上的相同的表位。在一些实施方案中，第一抗bcma sdab和第二抗bcma sdab特异性结合至bcma上的不同的表位。在一些实施方案中，第一抗bcmasdab和/或第二抗bcma sdab特异性结合至来源于选自seq id no:388-394的氨基酸序列的bcma上的表位。在一些实施方案中，第一抗bcma sdab特异性结合至来源于seq id no:389和/或390的表位。在一些实施方案中，第二抗bcmasdab特异性结合至来源于seq id no:391和/或392的表位。
8、在根据上文提供的多价car中的任一者的一些实施方案中，第一bcma结合部分(例如，第一抗bcma sdab)位于第二bcma结合部分(例如，第二抗bcma sdab)的n-末端。在一些实施方案中，第一bcma结合部分(例如，第一抗bcmasdab)位于第二bcma结合部分(例如，第二抗bcmasdab)的c-末端。在一些实施方案中，第一bcma结合部分(例如，第一抗bcma sdab)和第二bcma结合部分(例如，第二抗bcmasdab)通过肽键直接彼此融合。在一些实施方案中，第一bcma结合部分(例如，第一抗bcma sdab)和第二bcma结合部分(例如，第二抗bcmasdab)通过肽接头彼此融合。在一些实施方案中，肽接头的长度不超过约50个(诸如不超过约35个、25个、20个、15个、10个或5个中的任一者)氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含选自seq id no:208-215的氨基酸序列。
9、在根据上述car(包括多价car)中的任一者的一些实施方案中，跨膜域来源于选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152和pd1组成的组的分子。在一些实施方案中，跨膜域来源于cd8α或cd28。在一些实施方案中，跨膜域包含seq id no:193或194的氨基酸序列。
10、在根据上述car(包括多价car)中的任一者的一些实施方案中，胞内信号传导域包含免疫效应细胞(诸如t细胞)的主要胞内信号传导域。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域来源于cd3ζ。在一些实施方案中，主要胞内信号传导域包含seq id no:197或198的氨基酸序列。
11、在根据上述car(包括多价car)中的任一者的一些实施方案中，胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域来源于选自由cd27、cd28、cd137、ox40、cd30、cd40、cd3、lfa-1、icos、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激信号传导域包含cd28的胞质域和/或cd137的胞质域。在一些实施方案中，共刺激信号传导域包含seq id no:195和/或seq idno:196的氨基酸序列。
12、在根据上述car(包括多价car)中的任一者的一些实施方案中，car还包含位于胞外抗原结合域的c-末端和跨膜域的n-末端之间的铰链域。在一些实施方案中，铰链域来源于cd8α。在一些实施方案中，铰链域包含seq id no:192的氨基酸序列。
13、在根据上述car(包括多价car)中的任一者的一些实施方案中，car还包含位于多肽的n-末端的信号肽。在一些实施方案中，信号肽来源于选自由cd8α、gm-csf受体α和igg1重链组成的组的分子。在一些实施方案中，信号肽来源于cd8α。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:191的氨基酸序列。
14、本技术的一个方面提供表4和表5中列出的car。在一些实施方案中，car包含选自由seq id no:216-256和298-335组成的组的氨基酸序列。
15、本技术的一个方面提供包含选自由seq id no:115-152、216-256和298-335组成的组的氨基酸序列的多肽。
16、本技术的一个方面提供包含编码上述抗bcma sdab或car(包括多价car)中的任一者的核酸序列的经分离的核酸。在一些实施方案中，核酸序列选自由以下组成的组：seq idno:153-190、257-297和336-373。在一些实施方案中，经分离的核酸还包含编码第一car的第一核酸序列，其中编码第二car的第二核酸序列通过编码自切割肽(诸如t2a、p2a或f2a肽)的第三核酸序列可操作地连接至第一核酸序列。其中第三核酸序列为seq id no:385。在一些实施方案中，经分离的核酸是dna分子。在一些实施方案中，经分离的核酸是rna分子。
17、本技术的一个方面提供包含上述经分离的核酸中的任一者的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，载体是非病毒载体。
18、本技术的一个方面提供经工程化的免疫效应细胞，其包含上文提供的car(包括多价car)中的任一者，或上述经分离的核酸中的任一者，或上述载体中的任一者的。在一些实施方案中，免疫效应细胞是t细胞、nk细胞、外周血单核细胞(pbmc)、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是t细胞。
19、本技术的一个方面提供包含上述经工程化的免疫效应细胞中的任一者和药学上可接受的载剂的药物组合物。还提供了治疗个体的癌症的方法，包括将有效量的上述药物组合物中的任一者施用于个体。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，经工程化的免疫效应细胞是同种异体的。在一些实施方案中，癌症是液体癌(liquid cancer)。在一些实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方案中，癌症是实体癌，诸如胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
20、本技术的一个方面提供包含上述抗bcmasdab中的任一者和药学上可接受的载剂的药物组合物。在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病(诸如癌症)的方法，包括将有效量的药物组合物施用于个体。
21、还提供了包括上述抗bcma sdab、car(包括多价car)、经工程化的免疫效应细胞、经分离的核酸或载体中的任一者的使用方法、试剂盒和制品。
1.一种抗bcma单域抗体(sdab)，包含以下任一者：
2.根据权利要求1所述的抗bcma sdab，包含以下任一者：
3.根据权利要求1所述的抗bcma sdab，其中所述抗bcma sdab包含选自seq id no:117或124的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗bcma sdab，其中所述抗bcma sdab是vhh片段。
5.一种包含多肽的嵌合抗原受体(car)，所述多肽包含:
6.根据权利要求5所述的car，其中所述跨膜域来源于选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152和pd1组成的组的分子。
7.根据权利要求6所述的car，其中所述跨膜域来源于cd8α或cd28。
8.根据权利要求5所述的car，其中所述胞内信号传导域包含免疫效应细胞的主要胞内信号传导域。
9.根据权利要求8所述的car，其中所述主要胞内信号传导域来源于cd3ζ。
10.根据权利要求5所述的car，其中所述胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。
11.根据权利要求10所述的car，其中所述共刺激信号传导域来源于选自由cd27、cd28、cd137、ox40、cd30、cd40、cd3、lfa-1、icos、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd83的配体及其组合组成的组的共刺激分子。
12.根据权利要求11所述的car，所述共刺激信号传导域包含cd28的胞质域和/或cd137的胞质域。
13.根据权利要求5所述的car，其还包含位于所述胞外抗原结合域的c-末端和所述跨膜域的n-末端之间的铰链域。
14.根据权利要求13所述的car，其中所述铰链域来源于cd8α。
15.根据权利要求5所述的car，其还包含位于所述多肽的n-末端的信号肽。
16.根据权利要求15所述的car，其中所述信号肽来源于cd8α。
17.一种嵌合抗原受体(car)，包含选自seq id no:228或229的氨基酸序列。
18.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-4任一项所述的抗bcma sdab或权利要求5-17所述的car的核酸序列。
19.一种载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸。
20.一种工程化的免疫效应细胞，其包含权利要求5-17任一项所述的car。
21.根据权利要求20所述的工程化的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞是t细胞。
22.一种药物组合物，其包含权利要求20或21所述的工程化的免疫效应细胞，和药学上可接受的载剂。
23.权利要求20或21所述的工程化的免疫效应细胞在制备用于在个体中治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症包含表达bcma的细胞。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述癌症是难治性或复发性多发性骨髓瘤。
26.一种抗bcma单域抗体(sdab)，包含以下中的任一者：
27.根据权利要求26所述的抗bcma sdab，包含以下中的任一者：
