本发明涉及一种il-cds的制备方法及应用，主要涉及抗菌、抗生物膜和促进伤口愈合方面的应用，属于纳米材料和纳米医学领域。
背景技术：
1、抗生素耐药性的出现及迅速蔓延导致因细菌感染引起的疾病再次被认为是对人类健康的一个严重威胁。细菌生物膜是细菌感染的主要形式，研究表明，80%的细菌感染类疾病是由生物膜引起的，比如植入性设备-医用导管的感染。生物膜的形成可能导致抗生素耐药基因的积累，更容易诱发抗生素耐药性。此外，细菌感染会延缓开放性伤口的愈合过程，可引起败血症和多器官衰竭等并发症，严重时甚至导致死亡。因此，开发新型抗菌剂用于细菌感染类疾病的治疗，以缓解或扭转细菌耐药性带来的危机迫在眉睫。
2、纳米科学和技术的快速发展为抗菌治疗提供了有希望的替代品。与传统抗生素（微生物或天然产物来源）相比，纳米材料具有很多独特的物理化学性质，可以规避现有的获得性耐药机制，不容易诱导细菌产生耐药性。碳点（cds）这一新型碳基纳米材料具有水溶性好、纳米尺度小（更容易进入细胞发挥作用）、易于表面修饰、原料来源丰富（可以通过选择合适的前体来调控cds的性质）、优异的荧光性质以及良好的生物相容性等特点，在生物成像、药物递送、抗癌治疗和抗菌治疗等方面有广泛的应用。
3、以抗菌分子为前体合成的cds通常能保留前体的抗菌活性基团，具有比原料更优异的抗菌性能，这可能得益于电荷变正或抗菌活性基团的加强。由有机阳离子和无机或有机阴离子组成的抗菌分子-离子液体（ils），能够通过静电作用和烷基链的疏水作用发挥抗菌活性。ils的结构会显著影响其抗菌活性，比如阴阳离子种类、烷基链长度以及聚合物效应等。因此，可以通过选择合成单元结构来定制具有优异抗菌活性的ils，这使ils在开发非抗生素治疗方面正变得越来越有影响力。就目前来看，il-cds（离子液体源碳点）抗菌相关的应用很少，主要应用领域是传感、催化及生物成像。
技术实现思路
1、针对上述背景技术中存在的问题，本发明提供一种具有抗菌活性的il-cds的制备方法，以及该il-cds在抗菌、抗生物膜和伤口愈合中的应用。
2、一、il-cds的制备
3、（1）乙烯基咪唑离子液体（vinyl-ils）的制备：将1-乙烯基咪唑和溴代烷烃以1:1的摩尔比混合，在室温下搅拌反应48~96 h，所得产物用乙醚和乙酸乙酯洗涤3~5次，然后在真空烘箱中50℃干燥48h。其中，所述溴代烷烃为溴辛烷、溴十二烷、溴十六烷中的一种。
4、（2）il-cds的制备：首先取1 ml的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（gta）水溶液在140~180℃搅拌反应10~25 min，随后加入1 ml的vinyl-ils水溶液继续在140~180℃下搅拌反应30~45 min。冷却至室温后，加去离子水稀释，经滤膜过滤、透析和冷冻干燥得到il-cds。所述vinyl-ils为1-辛基-3-乙烯基咪唑溴化物（vinyl-c8）、1-十二烷基-3-乙烯基咪唑溴化物（vinyl-c12）、1-十六烷基-3-乙烯基咪唑溴化物（vinyl-c16）中的一种；所述gta和vinyl-ils的摩尔比为1:0.5~1:2；所述gta和vinyl-ils水溶液的浓度为0.5~0.8 mm/ml；所述滤膜过滤和透析过程为：采用0.22 µm的滤膜进行过滤后，在截留分子量为500~1000的透析袋中透析24~72 h。
5、本发明的合成机理：为了保留ils的抗菌结构—烷基链和正电荷咪唑基团，以获得具有增强抗菌活性的il-cds。我们选择vinyl-ils和gta作为合成il-cds的两种前驱体。高温水热合成过程中，vinyl-ils和gta通过乙烯基和环氧基的开环反应实现聚合，进一步碳化形成保留了抗菌官能团（烷基链和正电荷咪唑基团）的il-cds。
6、二、vinyl-ils和il-cds的结构表征
7、以本发明实施例1制备的vinyl-c8和il-c8-cd为例。
8、图1为本发明得到的vinyl-c8的核磁氢谱。图1可以证明vinyl-c8的成功制备。
9、图2为本发明制备的il-c8-cd的透射电镜（a）、粒径分布（b）及xrd（c）图。可以看出，il-c8-cd呈现准球形，分散性良好；尺寸较小且分布均匀，平均尺寸在2.25 nm左右。在高分辨率透射电镜(hrtem)图像中，石墨的(100)晶面与间距为0.21 nm的cd晶体条纹相匹配。(002)晶面对应xrd图中23°处的峰。(100)晶面对应42°处的峰，这与hrtem中的测量结果一致。
10、图3为本发明得到的il-c8-cd的红外光谱（ft-ir）图。从ft-ir图中可以看出，il-c8-cd未保留vinyl-c8在3070 cm-1处烯烃的c-h伸缩振动峰；而2927 cm-1和2857 cm-1处甲基和亚甲基的c-h伸缩振动峰以及1650 cm-1和1160 cm-1的咪唑基团相关峰被保留下来了。此外，il-c8-cd的ft-ir图中未出现1265cm-1左右环氧基的c-h伸缩振动峰，在1718cm-1处出现了c=o的伸缩振动峰，这说明gta的环氧基打开，形成了c=o。这证明通过乙烯基和环氧基的开环反应，il-c8-cd保留了vinyl-c8的烷基链和正电荷的咪唑基团。
11、图4为本发明得到的il-c8-cd的xps全谱（a）及精细谱（b-d）图。xps全谱显示，该材料由c、n、o三种元素组成。高分辨c1s图谱在 284.7和 285.9 ev处显示两个峰，分别归因于c-c/c=c键和c-n/c-o键。从高分辨n1s图谱分析得到399.1和401.7 ev两个信号峰，分别对应于c-n-c和c-n+结构。而高分辨o1s图谱中解析出531.9和532.4 ev两个峰，分别归属于o=c-oh和o=c-n。xps与ft-ir结果一致，均表明il-c8-cd保留了vinyl-c8的抗菌结构：烷基链和咪唑基团。
12、三、il-cds的抗菌性能
13、1、il-cds的增强抗菌活性
14、无菌pbs（0.01 m, ph=7.4）将金黄色葡萄球菌悬浮液稀释至106~107cfu/ml。上述浓度的菌悬液与等体积相同浓度（20 μg/ml）的il-c8-cd、gta或vinyl-c8溶液混合，在37 °c，180 rpm的摇床中孵育2 h。孵育结束后，取100 μl稀释1000倍的混合液涂覆在lb固体培养基上，37°c恒温恒湿培养箱中倒放培养20-24 h后拍照记录菌落生长情况并进行菌落计数。分析图5可知，il-c8-cd具有增强抗菌活性，对金黄色葡萄球菌的杀菌效率明显高于gta和vinyl-c8两种原料。
15、2、与jieyoushen抗菌剂的抗菌效果对比
16、不同浓度梯度的il-c8-cd和jieyoushen抗菌剂与金黄色葡萄球菌悬液(106~107cfu/ml)共孵育2 h后，取100 μl稀释1000倍的混合液涂覆在lb固体培养基上，37°c恒温恒湿培养箱中倒放培养20-24 h后拍照记录菌落生长情况并进行菌落计数。从图6可以看出，il-c8-cd对金黄色葡萄球菌的杀菌效果明显优于洁悠神抗菌剂。在5 μg/ml的浓度下，il-c8-cd的杀菌效率达到100%，而jieyoushen抗菌剂的杀菌效率仅有21%。
17、四、il-cds的抗生物膜性能
18、通过结晶紫定量法评估il-c8-cd抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的能力。金黄色葡萄球菌在lb培养基中培养后，与不同浓度的il-c8-cd溶液混合后加入96孔板中（菌液终浓度为106cfu/ml，il-c8-cd的终浓度为0、200、250、300、350、400μg/ml）。96孔板在37 °c温箱中培养48 h，pbs轻轻洗涤三次以去除浮游细菌。将孔底部形成的生物膜用乙醇固定20min。然后用0.1%结晶紫染色15 min，用pbs洗涤多次以除去多余的染料。最后在每个孔中加入等体积的30%乙酸溶解，并测量od590，计算生物膜抑制率。如图7所示，il-c8-cd对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制率随浓度增加而增加。400μg/ml的il-c8-cd对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制率达到了90.72%，而200μg/ml浓度以下，il-c8-cd对金黄色葡萄球菌生物膜没有明显的抑制生长作用。
19、五、il-cds的生物相容性
20、1、血液相容性
21、将100μl红细胞悬浮液（2vol%）置于96孔板中，并与100 μl不同浓度的 il-cds生理盐水溶液混合以达到实验所需浓度（il-c8-cd终浓度为0、2.5、5、10、20、40、60、80和100μg/ml）。纯水作为正对照（positive），生理盐水作为负对照（negative）。37 °c孵育3 h后，1200 rpm离心15 min。测量上清液在540nm处的吸光度，计算溶血率。100 µg/ml浓度下，il-c8-cd的溶血率低于5%，说明il-c8-cd具有良好的血液相容性（见图8a）。
22、2、细胞毒性
23、通过使用标准甲基噻唑基四唑测定法（mtt）对细胞的活性进行测定。将密度为5000 细胞/孔的宫颈癌细胞（hela，a549）在96 孔板中孵育 24 h。然后，将不同浓度的il-cds加入到每个细胞培养基中。孵育24 h 后，将mtt 溶液添加到每个孔中，并继续孵育4 h。随后，除去培养基并向孔中加入 dmso（100 μl）。轻轻摇动孔板以溶解所形成的沉淀，并用bio-rad model-680 酶标仪测量吸光度。如图8b所示，100 µg/ml的il-c8-cd与hela细胞共培养24小时后，细胞存活率仍超过90%，这表明il-c8-cd的体外细胞毒性可忽略不计。
24、六、il-cds的伤口愈合应用
25、腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉小鼠后，用手术剪剪出直径约为10mm 的圆形伤口。随后，用注射器在形成的伤口部位滴100μl金黄色葡萄球菌细菌悬浮液（3.0×108cfu /ml）并用医用无菌纱布和胶带固定感染24 h。将100 μlil-c8-cd溶液（100μg/ml）和100μlpbs溶液分别滴加到治疗组和对照组的伤口上，每隔24 h治疗一次。在治疗的第0、1、2、4、6、8、10、12天拍摄伤口并记录小鼠的体重变化，用imagej软件分析伤口面积。第12天处死小鼠，收集两组小鼠的伤口组织，多聚甲醛溶液（4%）固定后通过h&e染色进行病理学分析。
26、如图9a和9b所示，il-c8-cd能够明显加速伤口愈合，对照组的伤口愈合率明显低于治疗组。治疗8天时，两组伤口愈合率差异最大，il-c8-cd治疗组的伤口愈合率达到了84.07%，而对照组伤口愈合率仅有37.31%。治疗12天后，il-c8-cd治疗组伤口完全修复且毛发开始重新生长，而在对照组伤口还没有愈合。治疗12天后il-c8-cd和对照组伤口组织的h&e染色结果（图9c）显示，对照组的伤口组织中发现增厚的毛细血管和红细胞聚集，表明伤口中出现水肿和炎症细胞浸润组织（深蓝色区域）；而治疗组的伤口组织中没有出现红细胞聚集和炎症细胞分布现象，成纤维细胞明显迁移和增殖。以上结果均说明，il-c8-cd能够有效的对抗细菌感染，从而促进伤口愈合。
27、综上，本发明提供的il-cds可以作为治疗金黄色葡萄球菌感染类疾病的潜在候选药物，为离子液体（ils）衍生材料的抗菌应用提供了新的思路。
1.一种il-cds的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述一种il-cds的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述溴代烷烃为溴辛烷、溴十二烷、溴十六烷中的一种。
3.如权利要求1所述一种il-cds的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述乙烯基咪唑离子液体为1-辛基-3-乙烯基咪唑溴化物、1-十二烷基-3-乙烯基咪唑溴化物或1-十六烷基-3-乙烯基咪唑溴化物中的一种。
4.如权利要求1所述一种il-cds的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与乙烯基咪唑离子液体的摩尔比为1:0.5~1:2。
5.如权利要求1所述一种il-cds的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述2,3-环氧丙基三甲基氯化铵和乙烯基咪唑离子液体水溶液的浓度为0.5~0.8 m。
6.如权利要求1所述一种il-cds的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，采用0.22 µm的滤膜进行过滤后，在截留分子量为500~1000的透析袋中透析24~72 h。
7.il-cds作为抑制生物膜生长和促进伤口愈合药物在抗菌、抗生物膜和伤口愈合中的应用。
