本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性的检测方法、探针组和检测试剂盒。
背景技术：
1、t4多聚核苷酸激酶，简称t4 pnk，是由t4噬菌体的pset基因编码的一种蛋白质，最初是从t4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此又叫做t4多核苷酸激酶。该酶可以催化atp的γ-磷酸向单链或双链dna、rna、寡核苷酸或带有3’磷酸基团的单核苷酸的5’羟基转移。该酶还具有3’磷酸酶活性，将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-多膦酸核苷上水解下来，形成3’-羟基结构。
2、t4 pnk应用广泛，在一些应用中，t4 pnk通过催化单核苷酸、寡核苷酸、dna或rna的5’端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行；在另一些应用中，t4 pnk可以通过3’磷酸酶活性来去除3’端磷酸基团。
3、目前，对t4 pnk酶活检测方法，多集中于5’端磷酸化的活性检测。对于t4 pnk3’端的去磷酸化活性，缺少高效准确的检测方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性的检测方法，一种探针组，以及一种试剂盒。本发明采用动力学方法检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，该方法操作简便，可以通过实时监测反应的荧光变化，间接反映出t4 pnk酶的催化活性，且荧光下降速率能够更加真实地反映出酶的催化活性。此外，本发明提供的酶活检测方法，酶活只与添加的酶量有关系，排除了其他条件影响了酶的催化活性，提高了检测的准确性。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性的检测方法，包括如下步骤：
4、获取包含探针组的组合物，
5、所述探针组包括：双链探针和第三探针，所述双链探针包括第一探针和与所述第一探针部分互补结合的第二探针，所述第一探针包括位于5’段的第一区域和位于3’端的第二区域，且所述第一区域和所述第二区域连接；所述第二探针具有与所述第一区域等同的核苷酸数，且所述第二探针与至少部分所述第一区域互补；所述第三探针具有与所述第二区域等同的核苷酸数，且所述第三探针与至少部分所述第二区域存在互补性；其中，所述第一探针的3’端设置淬灭基团；所述第二探针的5’端具有磷酸基团；所述第三探针的5’端设置荧光基团，且所述第三探针的3’端包括磷酸基团；
6、将t4多聚核苷酸激酶标准品与所述组合物混合，并置于适于所述t4多聚核苷酸激酶对所述第三探针的3’端的磷酸基团进行酶切反应的条件下；
7、检测给定时段内的荧光值，并基于所述荧光值的变化建立单位时间内荧光值变化绝对值与酶活的线性拟合方程y＝ax+b，其中，y为所述探针组在单位时间内荧光值变化绝对值，x为酶浓度，a、b为常数；
8、基于所述线性拟合方程，确定待测t4多聚核苷酸激酶的3’端磷酸化活性。
9、在本发明的一些具体实施方案中，所述确定待测t4多聚核苷酸激酶的3’端磷酸化活性，包括：获取相同浓度的两种以上待测t4多聚核苷酸激酶在单位时间内荧光值变化绝对值，所述荧光值变化绝对值越高，所述待测t4多聚核苷酸激酶的3’端去磷酸化活性越强；反之，越弱。
10、在本发明的一些具体实施方案中，所述第三探针的tm≤20℃。低tm可使第三探针处于游离状态，呈现荧光；经t4多聚核苷酸激酶酶切后，第三探针3’端与第二探针5’端结合，促使第三探针与第一探针的第二区域互补，荧光淬灭。
11、在本发明的一些具体实施方案中，所述第二探针与所述第一区域的互补百分比大于或等于60％；所述第二探针与所述第一区域的互补百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或所述第二探针与所述第一区域完全互补；和/或
12、所述第三探针与所述第二区域的互补百分比大于或等于60％；所述第三探针与所述第二区域的互补百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或所述第三探针与所述第二区域完全互补。
13、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物的ph为6.0～7.5。
14、在本发明的一些具体实施方案中，所述获取包含探针组的组合物的步骤，包括：
15、将所述第一探针和所述第二探针进行退火处理。这里取所述第一探针与所述第二探针进行退火处理的目的是形成双链探针后，与所述第三探针混合，使第三探针保持游离状态，实现荧光发光。
16、在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物中还包括：缓冲液、镁离子、atp、dtt和连接酶中的至少一种；
17、任选地，所述连接酶为t4 dna连接酶，所述缓冲液为咪唑-盐酸缓冲盐；
18、任选地，t4 dna连接酶的质量浓度为0.02-0.1mg/ml。
19、在本发明的一些具体实施方案中，所述酶切反应的条件包括：所述t4多聚核苷酸激酶的酶活为10-16.6mu；和/或
20、所述单位时间为20-40s；和/或
21、所述给定时段为将t4多聚核苷酸激酶与所述组合物混合的5-10min内。
22、在本发明的一些具体实施方案中，所述检测给定时段内的荧光值的方法为：每20-35s检测一次荧光值，取前n次检测结果，n为5～20的整数。
23、在本发明的一些具体实施方案中，所述淬灭基团为bhq，所述荧光基团为fam，以484nm作为激发光，530nm作为发射光，检测给定时段内的荧光值。
24、基于上述研究，本发明提供了探针组合物，所述探针组合物用于检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，包括：第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针包括位于5’段的第一区域和位于3’端的第二区域，且所述第一区域和所述第二区域连接；
25、所述第二探针具有与所述第一区域等同的核苷酸数，且所述第二探针与至少部分所述第一区域具有互补性；
26、所述第三探针具有与所述第二区域等同的核苷酸数，且所述第三探针与至少部分所述第二区域具有互补性；
27、其中，所述第一探针的3’端设置淬灭基团；所述第二探针的5’端具有磷酸基团；所述第三探针的5’端设置荧光基团，且所述第三探针的3’端包括磷酸基团。
28、在本发明的一些具体实施方案中，所述第二探针与至少部分所述第一区域互补，形成双链探针。
29、在本发明的一些具体实施方案中，所述第三探针的tm≤20℃。
30、在本发明的一些具体实施方案中，所述第二探针与所述第一区域的互补百分比大于或等于60％；所述第二探针与所述第一区域的互补百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或所述第二探针与所述第一区域完全互补；和/或
31、所述第三探针与所述第二区域的互补百分比大于或等于60％；所述第三探针与所述第二区域的互补百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或所述第三探针与所述第二区域完全互补。
32、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒用于检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，包括本发明所述的探针组合物。
33、在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括缓冲液、镁离子、atp、dtt和t4dna连接酶中的至少一种，其中，所述缓冲液为咪唑-盐酸缓冲盐。
34、在本发明的一些具体实施方案中，以体积份计，所述试剂盒还包括如下组分：
35、
36、所述buffer1包括200mmol/l咪唑(ph＝7.5)和20mmol/lmgcl2；
37、所述buffer2包括200mmol/l咪唑(ph＝6.0)；
38、所述t4多聚核苷酸激酶样品采用2mmol/ltris-hcl(7.5)稀释；
39、或所述试剂盒还包括如下组分：
40、
41、还包括酶稀释buffer；所述酶稀释buffer包括2mmol/l tris-hcl ph 8.0，0.1mg/ml bsa；
42、所述检测试剂组合的ph值包括6.0～7.0。
43、本发明采用动力学方法检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，该方法操作简便，可以实时监测反应的荧光变化间接反映出t4 pnk酶的催化活性；取反应前期特定给定时段内的荧光下降速率能够更加真实的反映出酶的催化活性，此时的酶活只与添加的酶量有关系，排除了其他条件影响了酶的催化活性，提高了检测的准确性。
1.一种t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性的检测方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述确定待测t4多聚核苷酸激酶的3’端磷酸化活性，包括：获取相同浓度的两种以上待测t4多聚核苷酸激酶在单位时间内荧光值变化绝对值，所述荧光值变化绝对值越高，所述待测t4多聚核苷酸激酶的3’端去磷酸化活性越强；反之，越弱。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述第三探针的tm≤20℃；
4.如权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述组合物的ph为6.0～7.5；
5.探针组合物，其特征在于，所述探针组合物用于检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，包括：第一探针、第二探针和第三探针，所述第一探针包括位于5’段的第一区域和位于3’端的第二区域，且所述第一区域和所述第二区域连接；
6.如权利要求5所述的探针组合物，其特征在于，所述第二探针与至少部分所述第一区域互补，形成双链探针。
7.如权利要求6所述的探针组合物，其特征在于，所述第三探针的tm≤20℃。
8.如权利要求5-7任一项所述的探针组合物，其特征在于，所述第二探针与所述第一区域的互补百分比大于或等于60％；所述第二探针与所述第一区域的互补百分比至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或所述第二探针与所述第一区域完全互补；和/或
9.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测t4多聚核苷酸激酶3’端去磷酸化活性，包括如权利要求5-8任一项所述的探针组合物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、镁离子、atp、dtt和t4 dna连接酶中的至少一种，其中，所述缓冲液为咪唑-盐酸缓冲盐。
