本发明属于分析检测，具体涉及一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，更具体地涉及一种一次检测羊毛脂胆固醇粗品中24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇和胆固醇含量的方法。
背景技术：
1、胆固醇，分子式为c27h46o，相对分子质量386.6，其结构式如式ⅰ所示。胆固醇是是人工牛黄的原料之一，也是中药龟甲的指标成分，还可用作化妆品添加剂和饲料添加剂，或者用于生产液晶、维生素d3等，用途广泛。
2、羊毛脂是一种理想的分离提纯胆固醇的资源，其中胆固醇高达10-15％，且比动物脑干来源的胆固醇更安全可靠，没有传播性海绵体脑炎和牛海绵状脑病风险。在羊毛脂胆固醇分离提纯工艺中，羊毛脂中少量的24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇与胆固醇结构类似，难以与胆固醇分离。24-去氢胆固醇结构式如式ⅱ所示，与胆固醇只在24位上相差了一个双键，7-烯胆烷醇结构式如式ⅲ所示，是胆固醇的同分异构体。24-去氢胆固醇与7-烯胆烷醇在胆固醇粗品中的含量高低不仅会影响胆固醇产品的纯度，也会影响胆固醇产品的收率。24-去氢胆固醇可以作为维生素d3的合成前体，7-烯胆烷醇可以用来治疗白内障等眼科疾病，具有很高的经济价值。对胆固醇、24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇进行检测，可以为后续胆固醇粗品纯化工艺中结晶和重结晶的工艺参数提供调控依据，更好地对胆固醇分离进行质量控制；也能为后续是否需要从胆固醇粗品中分离高附加值的24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇的数量提供参考。对于24-去氢胆固醇含量和7-烯胆烷醇含量较低的胆固醇粗品，可以简单重结晶后得到高纯度胆固醇产品。对于24-去氢胆固醇含量或7-烯胆烷醇含量较高的胆固醇粗品，可以考虑进一步分离有价值的24-去氢胆固醇或者7-烯胆烷醇，并同时得到高纯度胆固醇产品。
3、2011年，heryka等人用正相高效液相色谱和二极管阵列检测器对牛奶中的胆固醇和24-去氢胆固醇进行定量(food anal.methods,2011,4:424–430)；2014年，徐青青等人用反相液相色谱和紫外检测器测定了24-去氢胆固醇在不同溶剂中的溶解度(高校化学工程学报,2014,28:443-448)；2023年，coon用二维气相色谱-质谱法检测了非洲芥子种子中的7-烯胆烷醇、胆固醇等39种化合物(state university of new york at albany,development of new mass spectrometric approaches for biomarker discovery:application to complex biological matrices for tissue characterization anddisease diagnosis,dissertation)。目前分析方法中，还没有报道过同时定量检测羊毛脂中胆固醇、24-去氢胆固醇、烯胆烷醇的分析方法，且由于24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇对照品昂贵，常规每种待测物都采用对照品的色谱分析方法会存在检测费用高昂等问题。因此，开发一种能同时检测羊毛脂中胆固醇、24-去氢胆固醇、烯胆烷醇的分析方法很有必要。
4、
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，该检测方法可以弥补现有分析方法对于羊毛脂胆固醇粗品中24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇等高附加值杂质成分关注的不足，也能填补生产中间体分析方法的空白，从而更加全面地评价胆固醇的生产过程，对于控制羊毛脂胆固醇的质量具有重要作用，也为后续如何加工胆固醇粗品提供选择依据。
2、本发明提供一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，以胆固醇为内参物，用高效液相色谱法检测羊毛脂胆固醇粗品中胆固醇、24-去氢胆固醇、烯胆烷醇的含量。
3、本发明建立了一种羊毛脂胆固醇粗品的一标多测方法，仅需在初期建立一标多测方法时用到胆固醇、24-去氢胆固醇、烯胆烷醇三种对照品，方法建立完成后，检测羊毛脂胆固醇粗品中24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇和胆固醇的含量仅用胆固醇一个对照品即可。相比24-去氢胆固醇和7-烯胆烷醇，胆固醇对照品价格低廉，采用一标多测方法不仅有利于减少对照品用量，也能缓解24-去氢胆固醇和7-烯胆烷醇对照品昂贵的问题，实现羊毛脂胆固醇粗品的快速、高效、简便、低廉的质量控制，为分离羊毛脂胆固醇粗品中的24-去氢胆固醇和7-烯胆烷醇提供数据来源。
4、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法的色谱柱为sunshell c18色谱柱，型号为4.6mm×150mm，填料粒径为2.7μm。
5、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法的流动相以乙腈为b相，水为a相，其中乙腈与水的体积比为88-92％：8-12％，优选体积比为90％：10％。
6、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法配置电喷雾检测器或紫外检测器，其中采用紫外检测器时，其检测的波长为205nm。
7、优选地，上述技术方案中，采用电喷雾检测器时，其雾化温度为40±2℃，优选为40℃。
8、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法的的流量为1.2±0.1ml/min，优选为1.2ml/min。
9、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法的的柱温为35±2℃，优选为35℃。
10、优选地，上述技术方案中，所述高效液相色谱法的的进样量为10±2μl，优选为10μl。
11、优选地，上述技术方案中，所述检测方法包括以下具体步骤：
12、(1)对照品溶液的配制：称取胆固醇对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
13、(2)供试品溶液的配制：称取一定量的羊毛脂胆固醇粗品样品，用甲醇溶解后离心作为供试品溶液；
14、(3)高效液相色谱测定：先将步骤(1)中的对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪分析测定，计算供试品溶液中胆固醇的含量，并根据预先确定的相对保留时间和相对校正因子，以胆固醇对照品溶液为内参物，计算24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇的含量。
15、优选地，上述技术方案中，所述相对保留时间和相对校正因子是相对于胆固醇色谱峰出峰时间和峰面积确定的，数据如下表(表1)所示。
16、表1
17、
18、相对于现有技术的有益效果：
19、本发明首次建立了羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，填补了现有方法对生产过程中高附加值杂质成分控制不足的空白。
20、本发明首次同时采用了电喷雾检测器和紫外检测器测定羊毛脂胆固醇粗品中24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇、胆固醇三种主要成分的含量，比现有技术控制的更全面。
21、本发明突破了测定一种成分需要一种对照品的固有方法，建立了一标多测分析方法，仅使用胆固醇一种对照品就可以同时测定羊毛脂胆固醇粗品中24-去氢胆固醇、7-烯胆烷醇、胆固醇三种成分的含量，大大节约了对照品用量，也解决了24-去氢胆固醇对照品价格高昂的问题，降低了检测成本。
22、本发明的检测方法(一标多测)操作简单，准确度高，重现性好，成本低廉；其检测结果与外标法相比较，完全符合要求，同时可实现毛脂胆固醇粗品的质量控制，为分离羊毛脂胆固醇粗品中的24-去氢胆固醇和7-烯胆烷醇提供依据。
1.一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，采用一标多测法，以胆固醇为内参物，用高效液相色谱法检测羊毛脂胆固醇粗品中胆固醇、24-去氢胆固醇、烯胆烷醇的含量。
2.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的色谱柱为sunshell c18色谱柱，型号为4.6mm×150mm，填料粒径为2.7μm。
3.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流动相以乙腈为b相，水为a相，其中乙腈与水的体积比为88-92％:8-12％。
4.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法配置电喷雾检测器或紫外检测器，其中采用紫外检测器时，其检测波长为205nm。
5.根据权利要求4所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，采用电喷雾检测器时，其雾化温度为40±2℃。
6.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流量为1.2±0.1ml/min。
7.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为35±2℃。
8.根据权利要求1所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样量为10±2μl。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
10.根据权利要求9所述的一种羊毛脂胆固醇粗品的检测方法，其特征在于，所述相对保留时间和相对校正因子是相对于胆固醇色谱峰出峰时间和峰面积确定的，数据如下表所示：
